王德麟，汪曉鶯

(1 江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南通 226006；2 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系)

病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病。全球約有20億人感染HBV，我國HBV感染者約1.3億，其中慢性乙型肝炎患者3 000萬。病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明，取決于多種因素，尤其與機(jī)體的免疫狀態(tài)有密切的關(guān)系[1-2]。趨化因子是20世紀(jì)80年代末引起廣泛關(guān)注的一大類結(jié)構(gòu)相似、功能相近的小分子蛋白質(zhì)。國內(nèi)外學(xué)者[3-4]證實(shí)，部分趨化因子在病毒性肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起作用，本研究對(duì)人類趨化因子CXCL8在乙型病毒性肝炎、肝硬化發(fā)生、發(fā)展及診斷中的作用進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年6月―2016年12月在南通市第三人民醫(yī)院住院確診為乙型肝炎病毒感染患者100例，其中男69例，女31例；年齡22～70歲，平均43歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照《中國慢性乙型肝炎防治指南(2014年版)》；(2)依從性良好；年齡＞16歲，＜75歲，男女不限。將經(jīng)臨床確診的乙肝病例分為慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝細(xì)胞癌和肝硬化組(表1)；正常對(duì)照組為排除乙型肝炎病毒感染，兩對(duì)半、肝功能正常的健康體檢者。

表1 各病例組主要生化指標(biāo)及病毒載量()

注：ALT，alanine aminotransferase，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST，aspartate aminotransferase，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；PT，prothrombin time，凝血酶原時(shí)間；Tbil，total bilirubin，總膽紅素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器與試劑 WELLSCAN K3酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)，人類趨化因子CXCL8檢測試劑盒(美國BD公司，批號(hào)201402)。

1.2.2 標(biāo)本制作 患者入院后次日清晨空腹采集常規(guī)靜脈血5 mL，室溫靜置2 h，1 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。

1.2.3 檢測方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(雙抗體夾心法)檢測人類趨化因子的含量。用純化的人趨化因子抗體包被微孔板，制成固相抗體，在包被單抗的微孔中加入趨化因子抗原，再與辣根過氧化物酶(horse-radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的CXCL8抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色。TMB在HRP的催化下生成藍(lán)色化合物，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色(顏色的深淺和樣品中的趨化因子CXCL8呈正相關(guān))。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)過程 在酶標(biāo)包被板上按濃度由大到小依次加入各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品及對(duì)照品，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。用配置好的洗滌液重復(fù)5次洗滌后拍干加酶。37 ℃溫育30 min后再洗滌，顯色15 min終止(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色)：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(optical density,OD)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人趨化因子CXCL8的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Stata 10.1軟件進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用直線相關(guān)和回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

慢性乙型肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌、急性乙型肝炎組的CXCL8含量分別為(6.45±1.97)、(6.52±1.92)、(7.01±1.86)、(6.44±1.37) μg/L，均高于正常對(duì)照組[(4.88±0.67) μg/L](P＜0.01,P＜0.05)；各病例組間差異不明顯(P＞0.05)；各病例組HBV-DNA含量與趨化因子濃度之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.2354、-0.2775、0.0154、-0.0286，無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

CXCL8又稱白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-8，也被稱為中性粒細(xì)胞激活蛋白-1，是1986年由德國弗萊堡大學(xué)皮膚學(xué)實(shí)驗(yàn)室[5-6]首先證實(shí)，是最早被發(fā)現(xiàn)的含有ELF序列的CXC亞家族一員，定位于人第4號(hào)染色體(q19～q21)。CXCL8由IL-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)、γ 干擾素(interferon,IFN)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌[7-9]。CXCL8的主要功能是同表達(dá)其配體的免疫細(xì)胞結(jié)合，激活并趨化相應(yīng)的免疫細(xì)胞，參與組織損傷與修復(fù)，在機(jī)體抗感染抗病毒等多種炎性疾病中發(fā)揮重要作用。CXCL8對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用[10-12]。

乙型肝炎是一種由HBV感染引起的以肝臟局部大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤的疾病，CXCL8主要通過激活免疫細(xì)胞參與乙型肝炎的病程。無論是急性乙型肝炎還是慢性乙型肝炎，在人體感染HBV后，受感染的肝細(xì)胞均可迅速識(shí)別病毒RNA，分泌IFNα 和IFNβ，并一起激活自然殺傷細(xì)胞，且刺激病毒感染的細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物-1類分子，使感染細(xì)胞更易于被呈遞于T細(xì)胞，活化T細(xì)胞?；罨募?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌高水平IFNγ。TNFα、IFNγ 和LPS等物質(zhì)均可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌CXCL8[13-14]。另外，HBV侵入人體后，在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量病毒抗原，誘導(dǎo)機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌趨化CXCL8因子。在慢性病毒性肝炎患者中，多種免疫細(xì)胞及某些在正常情況下無趨化因子分泌活性的細(xì)胞也可分泌CXCL8[15-16]。

當(dāng)CXCL8遇到表達(dá)CXCL8配體CXCR1/2的特異型免疫細(xì)胞時(shí)，CXCL8便與之結(jié)合，激活G蛋白傳導(dǎo)通路，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]，激活基因表達(dá)，細(xì)胞合成分泌一些參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。這樣CXCL8便與配體結(jié)合，將信號(hào)傳遞給效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞向乙肝病毒聚集的部位遷移，發(fā)生抗病毒的炎性免疫反應(yīng)[19-20]。只要人體內(nèi)存在H-BV病毒，均可刺激機(jī)體的特異性免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子參與抗病毒的免疫反應(yīng)，可見病毒刺激對(duì)CXCL8因子的產(chǎn)生起主要作用，在病毒刺激下肝細(xì)胞分泌的各類分子激活人體的免疫系統(tǒng)，完成抗病毒的免疫反應(yīng)過程。

在病毒性肝炎及其相關(guān)疾病中，趨化因子CXCL8參與整個(gè)抗病毒反應(yīng)的過程，并在其中起著重要作用。因此，研究CXCL8參與HBV的反應(yīng)機(jī)制對(duì)HBV及其相關(guān)疾病的臨床診療有著重要價(jià)值。