張慧卿，路延朋，宋學(xué)琴

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

Calpainopathy是由Calpain 3基因(CAPN3)突變導(dǎo)致的calpain3蛋白缺失、減少或功能喪失，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)的遺傳性肌病。calpain3蛋白是骨骼肌特有的鈣依賴(lài)非溶酶體蛋白酶，其缺失減少或功能喪失可導(dǎo)致肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進(jìn)行性肌無(wú)力和肌萎縮，屬于肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Limbgirdle muscular dystrophy, LGMD)范疇。根據(jù)遺傳方式LGMD可分為L(zhǎng)GMD1型(呈常染色體顯性遺傳方式)和LGMD2型(呈常染色體隱性遺傳方式)，根據(jù)累及突變基因類(lèi)型再分為多種亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)40種基因突變。CAPN3基因突變導(dǎo)致的Calpainopathy 為L(zhǎng)GMD2A和LGMD1I, 其遺傳方式既有常染色體顯性遺傳，也有隱性遺傳；臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為高肌酸激酶血癥，重者嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)能力需坐輪椅；病理改變可為正常、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肌營(yíng)養(yǎng)不良樣改變等各不相同。本文就Calpainopathy的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行綜述。

1 發(fā)病機(jī)制

Calpainopathy是由CAPN3基因突變所致，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但目前研究使得我們?cè)诨蚝偷鞍姿接幸欢ǖ牧私狻APN3基因于1989年被克隆，位于15q15-q21，包含24個(gè)外顯子，全長(zhǎng)40 kb，編碼由821個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為94 k的calpain3蛋白[1]。calpain3蛋白屬于calpains家族，Calpains蛋白是細(xì)胞內(nèi)一種鈣依賴(lài)非溶酶體的中性半胱氨酸蛋白酶。Calpains家族中研究較多的是calpain1和calpain2，又稱(chēng)為μ-calpain和m-calpain，均為異二聚體，由兩個(gè)亞基組成：一個(gè)大亞基(80 kDa)和一個(gè)小亞基(28 kDa)[1-2]，這些蛋白廣泛存在于身體的各個(gè)組織中。Calpain3主要是在肌肉中表達(dá)，雖然也可在晶狀體、肝臟、大腦和心肌中檢測(cè)到，但濃度非常低。Calpain3與caplain1、caplain2的大亞基分別有54%和51%的同源序列，三者均具有共同的特性，即鈣依賴(lài)的酶活性和中性pH中最大酶活性等。Calpain3蛋白可分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅳ區(qū))，其中Ⅱ和Ⅳ區(qū)為具有重要功能的半胱氨酸蛋白酶和鈣離子結(jié)合區(qū)，而且這兩區(qū)與其他calpain蛋白具有同源序列。Calpain3蛋白的Ⅱ區(qū)為保守的鈣蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶(Calpain-type cysteine Protease conserved, CysPc)結(jié)構(gòu)域，包括兩個(gè)蛋白酶核心結(jié)構(gòu)域(Protease Core subdomains)PC1和PC2，Ⅱ區(qū)與蛋白酶的活性有關(guān)。Ⅳ區(qū)為PEF(Penta EF hand)結(jié)構(gòu)域，主要為與鈣離子結(jié)合區(qū)域，并幫助calpain3同源二聚化。Ⅲ區(qū)為鈣蛋白酶型β夾層(Calpain-type Beta-Sandwich, CBSW)功能域，對(duì)calpain3激活時(shí)所需要的結(jié)構(gòu)改變很重要。除此之外，calpain3還具備3個(gè)特有的插入序列：N末端有20～30個(gè)氨基酸(N-terminus NS)；位于PC2的插入序列1(insertion sequence 1, IS1)；位于CBSW和PEF之間的插入序列2(insertion sequence2, IS2)，這幾個(gè)插入序列賦予calpain3蛋白獨(dú)特的自我催化作用[3-6]。

Calpain3蛋白是骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的鈣依賴(lài)非溶酶體的中性半胱氨酸蛋白酶，其激活需要鈣離子釋放[7]，需要的鈣離子濃度相比calpain1和calpain2要低。Calpain3蛋白作為蛋白酶通過(guò)自我溶解而激活，在肌細(xì)胞內(nèi)的肌聯(lián)蛋白(肌聯(lián)蛋白在M線和I帶具有幾個(gè)calpain3結(jié)合位點(diǎn))之間發(fā)揮作用，其功能包括組裝和重塑肌節(jié)中的收縮蛋白、調(diào)控肌漿網(wǎng)中的鈣離子外流、肌膜修復(fù)和肌肉再生等[1]。

Calpainopathy的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但推測(cè)有幾種可能：① Calpain3蛋白是骨骼肌三聯(lián)管的組成成分之一，其活性下降可導(dǎo)致鈣離子的釋放異常；②Calpain3蛋白參與組成dysferlin蛋白復(fù)合體，在部分LGMD2B(dysferlinopathy)患者中可見(jiàn)繼發(fā)的calpain3蛋白缺失也證實(shí)了這一點(diǎn)，Calpain3蛋白可能會(huì)影響肌膜的修復(fù)[8]；③CAPN3基因錯(cuò)義突變不僅可以影響calpain3蛋白的酶活性，還可影響蛋白分子之間的結(jié)合，從而影響蛋白的完整性；④ Calpain3蛋白在體內(nèi)結(jié)合到肌聯(lián)蛋白上，肌聯(lián)蛋白具有調(diào)節(jié)calpain3蛋白活性和抑制其出現(xiàn)自我降解的作用[1, 9]。CAPN3基因突變(比如R448H或D705G)并沒(méi)有影響Calpain3的酶活性，但影響了該蛋白與肌聯(lián)蛋白的結(jié)合。和其他大部分肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(致病基因編碼細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白)不同的是CAPN3基因編碼的是一種蛋白水解酶，因此對(duì)于任何影響到該酶活性、數(shù)量和酶結(jié)構(gòu)完整性的因素都可能致病。

2 臨床表現(xiàn)

Calpainopathy可導(dǎo)致肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進(jìn)行性肌無(wú)力和肌萎縮，屬于肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(LGMD)范疇。LGMD為常見(jiàn)的遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良類(lèi)型，發(fā)病率為4/100 000～7/100 000，LGMD呈常染色體顯性遺傳者稱(chēng)為1型, 呈常染色體隱性遺傳方式者稱(chēng)為2型，再根據(jù)突變基因分為多種亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)40種基因突變。CAPN3基因突變導(dǎo)致的Calpainopathy包括LGMD2A和LGMD1I, 前者為常染色體隱性遺傳，后者為常染色體顯性遺傳方式。除遺傳方式不同、LGMD1 I癥狀較輕且少見(jiàn)之外，二者臨床表現(xiàn)類(lèi)似。LGMD2A相對(duì)常見(jiàn)，有關(guān)它的報(bào)道相比LGMD1I較多，一般文獻(xiàn)中提及的Calpainopathy多為L(zhǎng)GMD2A亞型。2018年歐洲神經(jīng)肌病中心建議新的LGMD分類(lèi)和命名，如LGMD2A被稱(chēng)為L(zhǎng)GMD R1 calpain3-related[10]。

LGMD2A為常染色體隱性遺傳，其發(fā)病率有地理區(qū)域差異，不同國(guó)家報(bào)道LGMD2A占LGMD的比率從10%～80%不等，在歐洲為最常見(jiàn)的LGMD類(lèi)型，但在亞洲特別是我國(guó)病例數(shù)相對(duì)較少見(jiàn)。臨床表現(xiàn)與其他LGMD類(lèi)型相類(lèi)似，主要為肩帶肌、盆帶肌和四肢近端肌肉進(jìn)行性肌無(wú)力和肌萎縮，但有臨床異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)多樣且輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為高肌酸激酶血癥或假性代謝性肌病，重者嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)能力需坐輪椅。常染色體顯性遺傳者(LGMD1I)的臨床表現(xiàn)與LGMD2A相似，但發(fā)病年齡可延遲20年左右，無(wú)力癥狀相對(duì)較輕。

肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良2A(LGMD2A)的發(fā)病率大約為1/100000。典型的臨床表現(xiàn)為選擇性、對(duì)稱(chēng)性的近端肢體(骨盆帶肌、肩胛帶肌、軀干肌)無(wú)力和萎縮，常有關(guān)節(jié)攣縮和翼狀肩等。患者發(fā)病年齡2～55歲，平均18歲左右，初起為步態(tài)的異常，上樓困難，舉物費(fèi)力，病情緩慢進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)行走費(fèi)力，多在發(fā)病后20年左右失去行走能力。腓腸肌肥大少見(jiàn)，面肌和頸肌通常不受累，這有助于LGMD2A與面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良的鑒別?？沙霈F(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮，尤其是跟腱攣縮，也可出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)攣縮，常出現(xiàn)在疾病的早期。心肌受累少見(jiàn)[11]；膈肌受累往往出現(xiàn)在疾病的后期，偶見(jiàn)報(bào)道疾病早期即出現(xiàn)呼吸功能衰竭，需要無(wú)創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣[12]。有幾個(gè)臨床線索提示該病[13]：①早期伸膝、屈髖和大腿內(nèi)收肌群容易出現(xiàn)無(wú)力，肌肉核磁顯示大腿內(nèi)收肌群和股后肌群易受累；②腓腸肌早期出現(xiàn)脂肪浸潤(rùn)；③20%出現(xiàn)翼狀肩胛；④50%出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮，踝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)易受累；⑤肺功能和心臟常不受累。

該病臨床異質(zhì)性較大，不同患者發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展等存在差異。部分患者缺乏明顯的肌無(wú)力肌萎縮癥狀，僅表現(xiàn)為無(wú)癥狀的高肌酸激酶血癥(Asymptomatic hyperCKemia)、假性代謝性肌病(Pseudometabolic myopathy)或嗜酸性粒細(xì)胞肌炎(Eosinophilic myositis)[14-15]等。

高肌酸激酶血癥是指無(wú)任何臨床癥狀，僅在查體時(shí)發(fā)現(xiàn)血清肌酸激酶升高，多為正常參考區(qū)間的5～80倍，肌酸激酶水平可有波動(dòng)起伏。無(wú)癥狀的高肌酸激酶血癥也可見(jiàn)于其他遺傳性肌病中如dysferlinopathy，因此對(duì)于臨床上出現(xiàn)無(wú)癥狀的高肌酸激酶血癥應(yīng)給予重視。

假性代謝性肌病通常出現(xiàn)在兒童和年輕患者中，患者可能一直保持無(wú)癥狀階段很長(zhǎng)時(shí)間，也可表現(xiàn)為無(wú)力、肌痛、運(yùn)動(dòng)不耐受或輕微的近端肌無(wú)力，實(shí)驗(yàn)室檢查可見(jiàn)血乳酸增高及肌酶增高。

嗜酸性粒細(xì)胞肌炎主要發(fā)生在年輕人，伴或不伴肢體無(wú)力，肌酶升高，可見(jiàn)外周血嗜酸粒細(xì)胞增高，肌肉病理可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)可能是LGMD2A臨床前階段，因此在肌肉活檢顯示嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)的病人中應(yīng)該考慮到該病的可能。

該病臨床異質(zhì)性較大，但與基因突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型缺乏明確的相關(guān)性，相比錯(cuò)義突變，無(wú)義突變似乎更易出現(xiàn)肌無(wú)力，臨床表型較嚴(yán)重[16-17]。即使相同的基因突變?cè)谕粋€(gè)家系，其臨床表型可差異較大；錯(cuò)義突變引起的臨床表現(xiàn)難以預(yù)測(cè)。部分患者在懷孕過(guò)程中可病情惡化[18]。

3 肌肉病理

因臨床表型不同，病理表現(xiàn)也輕重不一，經(jīng)基因證實(shí)的Calpainopathy患者的肌肉病理可表現(xiàn)為正常的病理、只有個(gè)別局灶壞死、明顯的肌營(yíng)養(yǎng)不良樣改變或嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的肌源性損害等。

LGMD2A的肌肉組織病理檢查中，大多數(shù)患者骨骼肌呈肌營(yíng)養(yǎng)不良樣病理改變，即肌纖維肥大、萎縮、不同程度壞死再生伴結(jié)締組織增生。除此之外可見(jiàn)核內(nèi)移現(xiàn)象、高收縮纖維、旋渦狀纖維和分葉纖維。分葉纖維為calpainopathy最顯著或典型的病理改變，約見(jiàn)于67%的LGMD2A患者，但分葉纖維還可見(jiàn)于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、LGMD2D(又稱(chēng)為α-sarcoglycanopathy)和面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中，但他們的存在與這些疾病的嚴(yán)重程度并不相關(guān)；分葉纖維更易在兒科患者中觀察到，提示早期的病理變化。Fanin等[19]發(fā)現(xiàn)男性肌纖維較女性明顯減少；肌纖維的再生在LGMD2A病人的病理中相對(duì)于其他類(lèi)型的LGMD較少出現(xiàn)，比例平均小于3%，分析原因可能為calpain3蛋白的丟失影響了肌纖維的再生過(guò)程[20]。

4 蛋白印跡

通過(guò)免疫印跡分析肌肉組織中calpain3蛋白減少或缺失是診斷calpainopathy的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，但這種方法會(huì)產(chǎn)生假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果[21]，需結(jié)合基因檢測(cè)。在20%的LGMD2A患者中，蛋白印跡檢查發(fā)現(xiàn)caplain3蛋白量表達(dá)正常，但其功能喪失或減弱，這會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。caplain3是一種細(xì)胞蛋白酶，它在體外因自溶作用極易降解，且降解速度較快[1]，因此對(duì)其檢測(cè)難度較大；另外其他類(lèi)型的LGMD中由于相應(yīng)的蛋白缺失，例如LGMD2B型的dysferlin蛋白[21]、LGMD2J型的肌聯(lián)蛋白(titin)[22]、LGMD2I型的fukutin相關(guān)蛋白等可能會(huì)導(dǎo)致caplain3蛋白的繼發(fā)性減少或缺失，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[7]。免疫印跡分析結(jié)果顯示的caplain3蛋白數(shù)量和該病的嚴(yán)重程度沒(méi)有關(guān)聯(lián)。

5 基因檢測(cè)

LGMD2A是第一個(gè)明確基因及其分子生物學(xué)特征的肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良，迄今在萊頓肌營(yíng)養(yǎng)不良數(shù)據(jù)庫(kù)(leiden muscular dystrophy database, http://www.dmd.nl/capn3_home.html)中，關(guān)于calpainopathy的基因突變已經(jīng)超過(guò)500多種[23]，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變、小的缺失、大的缺失等多種突變類(lèi)型，其中LGMD2A中最常見(jiàn)的突變類(lèi)型是錯(cuò)義突變(60%左右)且多為復(fù)合雜合突變。攜帶兩種無(wú)義突變患者常發(fā)病年齡早，進(jìn)展快，有嚴(yán)重的臨床表型。攜帶錯(cuò)義突變患者的臨床表型不可預(yù)測(cè)，可能與突變位點(diǎn)處于蛋白不同重要程度的功能區(qū)有關(guān)[24]。錯(cuò)義突變中外顯子11可能是突變熱點(diǎn)；若不論突變類(lèi)型，外顯子21可能是一個(gè)突變熱點(diǎn)[25]。文獻(xiàn)報(bào)道的熱點(diǎn)突變分布多位于Calpain3的II區(qū)和Ⅳ區(qū)，這兩個(gè)區(qū)分別為半胱氨酸蛋白酶和鈣離子集合區(qū)結(jié)構(gòu)域，在鈣離子依賴(lài)的酶活化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。導(dǎo)致功能缺失的錯(cuò)義突變?nèi)鏿.Thr184Met and p.Gly222Arg，p.Arg489Gln, p.Arg490Gln and p.Arg490Trp，p.Gly496Arg and p.Ser606Leu等位于蛋白酶功能域II區(qū)和Ⅳ區(qū)[26]。最近Martinez-Thompson等[27]報(bào)道了CAPN3基因突變可能與顯性遺傳性肌病有關(guān)。要注意calpainopathy臨床表型具有高度異質(zhì)性，即使有相同基因突變的同胞兄弟姐妹亦可能有不同的臨床表現(xiàn)，所以不能通過(guò)基因突變類(lèi)型和位點(diǎn)判斷患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。雖然目前基因檢測(cè)是診斷遺傳性肌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且檢測(cè)方法也取得顯著的進(jìn)步，但這不是絕對(duì)的，因?yàn)槟承﹨^(qū)域的突變?nèi)鐔?dòng)子、內(nèi)含子和大的缺失等不能被檢測(cè)到，目前發(fā)現(xiàn)有10%的calpainopathy患者基因檢測(cè)僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)等位基因突變，推測(cè)可能存在一些目前技術(shù)尚不能檢測(cè)到的突變。

6 小結(jié)

本文針對(duì)CAPN3基因突變引起Calpainopathy的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行綜述。Calpainopathy的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚不完全清楚。目前診斷方法中基因檢測(cè)費(fèi)用昂貴，蛋白印跡缺乏一定的敏感性及特異性。但隨著研究的深入，相信不久的將來(lái)能提高Calpainopathy的診斷率；深入了解其發(fā)病機(jī)制，精準(zhǔn)基因治療會(huì)有更廣闊的前景。