賀春香，余婧萍，李富周，賀 旭，李 平，成紹武，宋禎彥

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南長沙 410208）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種與衰老相關(guān)的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床上以認(rèn)知功能障礙,特別是記憶障礙和視空間技能損害為主要特點(diǎn)。隨著人口老齡化日趨明顯,AD在老年人群的患病率逐年上升,我國65歲老人中患病率高達(dá)6.6%［1］。細(xì)胞外神經(jīng)纖維斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的主要病理特征,誘導(dǎo)這些致病轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制尚不清楚［2］。腦內(nèi)沉積的β-淀粉樣蛋白（amyloid-beta,Aβ）被認(rèn)為是AD的關(guān)鍵病理過程［3］。Aβ 是由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein,APP）經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的含有39～43個氨基酸的多肽,其在腦內(nèi)的沉積形成不溶性斑塊引發(fā)神經(jīng)毒性作用是神經(jīng)元凋亡的重要原因［4］。Aβ1-42處理的原代神經(jīng)元在細(xì)胞周期標(biāo)記物、DNA復(fù)制和有絲分裂突變方面存在異常表達(dá)［5］。研究表明,Aβ 刺激可以促進(jìn)神經(jīng)元的分化抑制蛋白1（inhibitor of differentiation-1,Id1）、音猬因子（sonic hedgehog,SHH）和Cyclin D1等細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)因子的異常表達(dá),參與誘導(dǎo)終末分化的神經(jīng)元細(xì)胞周期異常激活導(dǎo)致神經(jīng)元脆裂、變性和死亡［6］。Aβ 也可引起神經(jīng)元活性氧產(chǎn)生增多、DNA損傷［7］,使得防止神經(jīng)元細(xì)胞周期再入的周期蛋白依賴性激酶5 （Cyclin Dependent Kinase 5,Cdk5）表達(dá)下降,在與Aβ 的共同刺激下,促使神經(jīng)元細(xì)胞周期再入,一方面,作為細(xì)胞周期啟動蛋白Cyclin D1過表達(dá)激活成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein,Rb）使其磷酸化,并向S期過渡；另一方面,過度損傷的DNA導(dǎo)致PARP（poly ADP-ribose polymerase）和p38 （Thr 180/Tyr 182）的激活,使得casepse3激活增多,Bax表達(dá)量升高以及Bcl-2/Bax比率的下降,從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［8］。這種在進(jìn)入細(xì)胞周期的合成階段之前,在G1至S點(diǎn)出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡,被經(jīng)典地稱為“abortive cell cycle reentry”,其特征是細(xì)胞周期和凋亡蛋白的上調(diào)［9-10］。因此,研究干擾Aβ 依賴信號途徑的藥物對于預(yù)防AD腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞周期失調(diào)和凋亡引起的神經(jīng)退行性病變具有一定的臨床意義。當(dāng)歸芍藥散出自東漢張仲景的《金匱要略》,臨床觀察證明當(dāng)歸芍藥散是治療AD的有效方劑［11-12］,實驗研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散改善AD的認(rèn)知功能主要與抗炎、抗氧化損傷、增強(qiáng)腦組織的能量代謝、促進(jìn)突觸形成等相關(guān)［13-15］。本研究利用Aβ1-42誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）構(gòu)建AD細(xì)胞模型來研究當(dāng)歸芍藥散對Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞株購自武漢普諾賽生物有限公司（貨號CL-0208）,用含10% 胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素（美國Gibco公司,貨號分別為 10270-106,15070063）的DMEM/F12培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司,貨號SH30023.01）在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 動物 SD大鼠,10只,SPF級,雄性,體質(zhì)量250～300 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘）2013-0004,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。動物實驗方案通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（ZYFY20190905）。

1.3 藥物與試劑 當(dāng)歸芍藥散由當(dāng)歸7 g、白芍37.2 g、茯苓9.3 g、白術(shù)9.3 g、澤瀉18.6 g、川芎18.6 g組成,所有藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,由藥劑科主任戴冰教授鑒定為正品。Aβ1-42（美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號03112）；噻唑藍(lán)（MTT）和乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司,貨號M8180、BC0685）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號C1086）；細(xì)胞周期染色試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,貨號CCS012）；Bax、Bcl-2、Cyclin D1、β-actin （北京博奧森公司,貨號分別為bs-0127M、bs-0032R、bs-0623R、bs-0061R）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗 （美國Sigma-Aldrich公司,貨號分別為AP132P、AP124）。

1.4 儀器 Z36HK超速冷凍離心機(jī)（德國Hermle公司）；Series 8000 WJ CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；Axio Vert.A1倒置顯微鏡 （德國ZEISS公司）；Cytation3多功能酶標(biāo)儀 （美國BioTek公司）；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；A1+共聚焦激光顯微鏡 （日本Nikon公司）；MoFlo XDP超速流式分選系統(tǒng)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 當(dāng)歸芍藥散凍干粉制備 當(dāng)歸芍藥散采用水提法制備凍干粉［13］。按處方比例稱取藥材100 g（當(dāng)歸7 g、白芍37.2 g、茯苓9.3 g、白術(shù)9.3 g、澤瀉18.6 g、川芎18.6 g）,用5倍體積蒸餾水浸泡藥物2 h,100 ℃煮沸0.5 h,小火煨1 h,收集濾液。使用3倍體積蒸餾水按照上述步驟再次提取。2次提取物混合后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮成浸膏。最后,將浸膏裝入凍干機(jī)真空冷凍干燥得到當(dāng)歸芍藥散凍干粉。

2.2 含藥血清制備 取雄性SD大鼠10只隨機(jī)分為2組,給藥組大鼠灌胃給予當(dāng)歸芍藥散濃縮液（生藥24 g/kg）,正常對照組給予同體積蒸餾水。灌胃7 d后,于末次灌胃后2 h后以3%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉大鼠,暴露腹主動脈,用負(fù)壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中,靜置過夜,3 000 r/min離心10 min,收集上清,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Aβ1-42處理構(gòu)建AD細(xì)胞模型 SH-SY5Y細(xì)胞生長處于對數(shù)期時,接種到培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h貼壁,根據(jù)課題組前期研究［16］,給予10 μmol/L Aβ1-42處理24 h構(gòu)建AD細(xì)胞模型。。

2.4 分組及當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù) 細(xì)胞分組為空白對照組（空白血清）,模型組（10 μmol/L Aβ1-42+空白血清）,當(dāng)歸芍藥散含藥血清低、中、高干預(yù)組（10 μmol/L Aβ1-42造模后分別給予25、50、100 mL/L含藥血清干預(yù)24 h,即每升完全培養(yǎng)基中分別含有25、50、100 mL當(dāng)歸芍藥散含藥血清,體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%、5%、10%）,采用“體積分?jǐn)?shù)+受試藥物含藥血清” 的方式表達(dá)［13］。

2.5 細(xì)胞活率和LDH活性檢測 96孔板中按8×103/孔密度接種細(xì)胞培養(yǎng)貼壁,按方法10 μmol/L Aβ1-42處理24 h后,根據(jù)MTT試劑盒和LDH活性檢測試劑盒說明書方法檢測每個孔的細(xì)胞存活情況和LDH活性。

2.6 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 6孔板中放入蓋玻片接種4×105/孔細(xì)胞使細(xì)胞爬片,經(jīng)試驗處理24 h后,用4%多聚甲醛室溫固定10 min,PBS清洗細(xì)胞,0.3% Triton-X透膜5 min,將TUNEL反應(yīng)混合物加入細(xì)胞,37 ℃孵育1 h,DAPI染核5 min,PBS清洗后使用尼康A(chǔ)1+共聚焦顯微鏡10倍物鏡下掃描成像。隨機(jī)選取5個視野,采用Image J分析每組平均熒光強(qiáng)度,統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 6孔板接種4×105/孔細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁,經(jīng)試驗處理24 h后,按照細(xì)胞周期染色試劑盒所述方法操作。收集細(xì)胞離心棄上清,輕彈管壁,使沉淀重懸在殘余的液體中,加入1 mL室溫下的PBS。將細(xì)胞緩慢加入至3 mL無水乙醇（-20 ℃預(yù)冷）中,邊加邊高速攪拌。-20 ℃固定過夜。檢測當(dāng)天,將固定細(xì)胞離心,棄去乙醇,輕彈管壁使沉淀松散,加入5 mL室溫下的PBS,放置15 min使細(xì)胞再次水化。離心,棄上清。加入1 mL PI染色液,室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度,在貝克曼MoFlo XDP流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測,488 nm激發(fā)光源,使用FL2-RPE （578 nm）通道檢測。流式結(jié)果使用Modfit軟件進(jìn)行分析。

2.8 Western blot檢測細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)實驗處理后使用RIPA法裂解細(xì)胞,30 Hz超聲10 s斷裂DNA,12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA法檢測定量蛋白濃度,每孔上樣30 μg/孔,100 V電泳100 min,0.45 μm PVDF膜200 A濕轉(zhuǎn)90 min,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,封閉后一抗用TBST 1 ∶1000稀釋,β-actin為內(nèi)參,4 ℃孵育過夜,二抗（1 ∶10 000）37 ℃避光孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)成像計算灰度值統(tǒng)計分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析,計量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析,先進(jìn)行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗,兩兩比較方差齊者用LSD檢驗,方差不齊者用Tamhane’s T2法檢驗,以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響 明場下觀察SH-SY5Y細(xì)胞生長情況（圖1）,空白對照組細(xì)胞生長良好,細(xì)胞細(xì)長呈梭形或者橢圓形,有樹枝狀軸突,細(xì)胞飽滿透亮。Aβ1-42處理24 h后SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)損傷,細(xì)胞密度有所下降,樹枝狀軸突消失,細(xì)胞部分皺縮,部分包膜出現(xiàn)破裂,細(xì)胞光澤變暗,細(xì)胞間隙增大。當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后,細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù),部分細(xì)胞恢復(fù)呈梭形或者橢圓形,細(xì)胞間隙變小。

圖1 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphological changes of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells due to Danggui Shaoyao Powder medicated serum treatment at different concentrations

3.2 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細(xì)胞存活率和LDH活性的影響 MTT檢測結(jié)果（圖2）顯示,與空白對照組比較,模型組的SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降（P＜0.01）。與模型組比較,給予當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)24 h后,5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清組的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞存活率均提高（P＜0.01）。LDH漏出率檢測結(jié)果（圖3）顯示,與空白對照組比較,模型組的SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率升高（P＜0.01）；與模型組比較,當(dāng)歸芍藥散含藥血清能一定程度降低模型組細(xì)胞LDH漏出率,5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清組均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響（n=6）Fig.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell viability of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （n=6）

圖3 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SHSY5Y細(xì)胞LDH活性的影響（n=6）Fig.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the LDH activity of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （n=6）

3.3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示（圖4）當(dāng)歸芍藥散含藥血清呈濃度依賴性抑制Aβ1-42介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。熒光強(qiáng)度統(tǒng)計分析結(jié)果顯示（表1）,與空白對照比較,10 μmol/L Aβ1-42處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）,細(xì)胞凋亡率為（48.12±5.28）%。與模型組比較,5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)24 h后細(xì)胞凋亡率為 （17.69 ± 4.26）%、（15.64 ±4.15）%,P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42 處理后SHSY5Y細(xì)胞凋亡的影響（， n=3）Tab.1 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis rate of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells（， n=3）

表1 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42 處理后SHSY5Y細(xì)胞凋亡的影響（， n=3）Tab.1 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis rate of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells（， n=3）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。

圖4 TUNEL染色檢測不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells using TUNEL

3.4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示（表2、圖5）,與空白對照組比較,模型組SH-SY5Y細(xì)胞在10 μmol/L Aβ1-42處理24 h后,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量無變化,S期細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05）,G2/M期細(xì)胞數(shù)量下降（P＜0.05）。與模型組比較,2.5%當(dāng)歸芍藥散含藥血清組細(xì)胞周期G0/G1、S、G2/M期均差異無統(tǒng)計學(xué)意義；5%、10% 當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后G0/G1期細(xì)胞數(shù)量無變化,S期細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）,G2/M期細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。提示Aβ1-42處理后SHSY5Y細(xì)胞大量進(jìn)入細(xì)胞周期,停滯于S期,細(xì)胞周期阻滯；5%、10% 當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后能改善Aβ1-42對SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響。

3.5 當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后周期蛋白Cyclin D1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示（圖6、表3）,與空白對照組比較,Aβ1-42處理后周期相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降,促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較,5%、10% 當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后Cyclin D1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）,Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）,Bax蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。

表2 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響（， n=5）Tab.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=5）

表2 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響（， n=5）Tab.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=5）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。

圖5 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells

4 討論

圖6 Western blot檢測各組蛋白表達(dá)Fig.6 Detection of the protein expression of each group by Western blot

表3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞Cyclin D1和凋亡相關(guān)蛋白的影響（， n=3）Tab.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum on the apoptosis related proteins and Cyclin D1 of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=3）

表3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細(xì)胞Cyclin D1和凋亡相關(guān)蛋白的影響（， n=3）Tab.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum on the apoptosis related proteins and Cyclin D1 of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=3）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癡呆病位在腦,與肝、腎、脾三臟密切相關(guān),肝失疏泄,脾失健運(yùn),腎乏氣化,分清泌濁失司,釀生痰濁血瘀,痰瘀互結(jié),蒙蔽神明［17］。中醫(yī)認(rèn)為治療老年癡呆當(dāng)以養(yǎng)肝補(bǔ)腎為主,當(dāng)歸芍藥散方中重用白芍養(yǎng)血調(diào)肝,當(dāng)歸充補(bǔ)肝血以補(bǔ)腎精；川芎活血通絡(luò),引血上行；白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾利濕,有化痰排濁功效,利于腎濁排出,諸藥合用具有滋補(bǔ)肝腎,活血化瘀,化痰通絡(luò)。上世紀(jì)80年代,日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散能改善AD患者的運(yùn)動障礙和認(rèn)知功能下降［18］,隨后國內(nèi)外許多當(dāng)歸芍藥散抗衰老的臨床報道和實驗室研究資料表明［19-20］,當(dāng)歸芍藥散具有抗衰老作用,主要表現(xiàn)為提高學(xué)習(xí)記憶能力,清除自由基、抗氧化,增強(qiáng)海馬神經(jīng)突觸可塑性等［15］,本研究結(jié)果表明,當(dāng)歸芍藥散能抑制Aβ 引起細(xì)胞周期失調(diào)和細(xì)胞凋亡,具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究重點(diǎn)考察當(dāng)歸芍藥散通過對Aβ 所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞周期再入和細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用,探索中藥復(fù)方當(dāng)歸芍藥散防治神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制,故采用Aβ1-42處理SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建AD細(xì)胞模型。G1/S-特異性周期蛋白-D1 （Cyclin D1）,與細(xì)胞周期激活和G1/S期進(jìn)展相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后,可CyclinD1過表達(dá)可使細(xì)胞縮小,縮短G1期,加速進(jìn)入S期。Aβ 使CyclinD1水平的增加并使細(xì)胞脫離有絲分裂后期,重新進(jìn)入細(xì)胞周期［21］。而正常的成年神經(jīng)元細(xì)胞不再進(jìn)入細(xì)胞周期（而是停留在G0期）,屬于永久性的有絲分裂后細(xì)胞,神經(jīng)元細(xì)胞周期的異常激活會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［22］。在AD患者大腦中,CyclinD1的積累與細(xì)胞周期激活相關(guān),并最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［23］。同樣有研究發(fā)現(xiàn)用Aβ 作用于SH-SY5Y后,細(xì)胞周期進(jìn)展不會超過S期,并伴隨著細(xì)胞的凋亡［24］。此外,CyclinD1的核定位功能使神經(jīng)元能保持為終末分化狀態(tài),同時它的核入口調(diào)節(jié)功能在神經(jīng)元細(xì)胞周期退出中起到重要作用［25］。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,Aβ1-42處理后,SH-SY5Y細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加,G2/M期顯著減少,表明Aβ 能促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期,但大量停留在S期而沒有進(jìn)入G2/M期,表現(xiàn)為細(xì)胞周期阻滯,并可能進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡［26］。當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后與模型組比較,S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少,G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著增加,提示當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后能改善Aβ1-42誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞周期再進(jìn)入。課題組推測,可能的機(jī)制是由神經(jīng)元中Aβ 的刺激,迫使神經(jīng)元進(jìn)入細(xì)胞周期,然而,細(xì)胞周期功能失調(diào)阻礙了神經(jīng)元的成功分裂,或者使它們變得脆弱,導(dǎo)致神經(jīng)元變性,最終死亡,而當(dāng)歸芍藥散能有效的減輕Aβ 引起的SH-SY5Y細(xì)胞周期再進(jìn)入和神經(jīng)元凋亡。

抗凋亡蛋白Bcl-2是線粒體凋亡的中心調(diào)控因子并阻止Bax和Bak的同質(zhì)寡聚化,在AD患者大腦中會出現(xiàn)下調(diào)［27］。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白,Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡。研究表明Bax易位 （激活）參與Aβ 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程［28-29］。Bax/Bcl-2 2種蛋白之間的比率是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn),Aβ 會通過改變線粒體核裂變和核聚變蛋白質(zhì)促進(jìn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體動力學(xué)損傷最終導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,并伴隨著Bax/Bcl-2比率的升高［30］。同時體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的大鼠海馬區(qū)的BaxmRNA水平出現(xiàn)上升［31］。通過Western blot對蛋白Bax和Bcl-2進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示Aβ1-42處理后促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高,Bax激活增多,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),使其表達(dá)顯著下降,與模型組比較,當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后Bax蛋白表達(dá)出現(xiàn)不同程度下降,對Bcl-2蛋白的抑制作用降低,Bcl-2蛋白的表達(dá)出現(xiàn)不同程度升高。說明Aβ 通過對Bax/Bcl-2的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的發(fā)生,當(dāng)歸芍藥散對Aβ 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

本研究采用Aβ1-42處理SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建AD細(xì)胞模型,給予不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)。結(jié)果提示當(dāng)歸芍藥散能明顯減輕Aβ1-42引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,抑制細(xì)胞周期再進(jìn)入和細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。