董小鵬王麗娟 趙春霖張建平潘海邦易劍鋒石育弘

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730020）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是以胰腺外分泌部的炎癥為特征,其發(fā)生發(fā)展與腺泡細(xì)胞損傷和局部和全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。根據(jù)發(fā)病速度和病情嚴(yán)重程度,在2012年亞特蘭大國際共識修訂分類中將其分為3種類型：輕度胰腺炎 （mild acute pancreatitis,MAP）、中度胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis,MSAP）和重度胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）［1］。AP一般起病較急,尤其SAP病情進(jìn)展迅速,且伴有多種并發(fā)癥。其中,以急性肺損傷（acute lung injury,ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）最為常見,這也是胰腺炎引起死亡的主要原因［2-3］。近年來,AP發(fā)病率逐年增高,每年增幅3.4%左右［4］,與此同時(shí)對于AP各種并發(fā)癥尤其ALI缺少有效安全的藥物,因此迫切需要積極開始實(shí)驗(yàn)及臨床研究尋找研發(fā)相應(yīng)治療藥物。血必凈注射液屬于國家二類新藥,臨床研究表明血必凈注射液可顯著改善SAP患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài),抑制炎癥反應(yīng),用于SAP患者的治療并具有潛在肺功能保護(hù)作用［5-7］。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示血必凈注射液能夠降低AP大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β （白細(xì)胞介素-1β）和IL-6 （白細(xì)胞介素-6）的水平,通過抑制炎癥反應(yīng)來改善胰腺組織病理損傷［8］,但對于AP引發(fā)肺損傷的治療機(jī)制研究報(bào)道較少。因此,本研究首先利用生物信息學(xué)方法分析出AP肺損傷發(fā)病過程中可能的靶點(diǎn)及其功能,同時(shí)建立AP大鼠模型觀察血必凈注射液對肺組織TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平的影響,以期為今后血必凈注射液的臨床推廣及治療機(jī)制研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 高通量芯片數(shù)據(jù)庫 從GEO數(shù)據(jù)庫［9］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索與AP與ALI相關(guān)的高通量轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)。根據(jù)研究物種和樣本數(shù)量,選擇Hedegger K等提交的GSE121038數(shù)據(jù)集和XU W等提交的GSE48787數(shù)據(jù)集。GSE121038存儲(chǔ)用雨蛙肽制備的AP模型小鼠和正常小鼠胰腺組織轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù),每組各4個(gè)樣本,樣本編號分別為GSM3424904～GSM3424907及GSM3424908～GSM3424911。GSE48787存儲(chǔ)用脂多糖制備的ALI模型小鼠和正常小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄組的芯片數(shù)據(jù),每組各選3個(gè)樣本,樣本編號分別為GSM118462～GSM118462及GSM1184630～GSM1184632。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD大鼠48只,雌雄各半,體質(zhì)量（220±20）g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK （甘）2015-0002。

1.3 藥物及主要試劑 血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司,批號1809101,規(guī)格10 mL/支,主要成分是紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸）；?；悄懰徕c（北京索萊寶公司,批號20200909,規(guī)格25 g,使用前用0.9%生理鹽水配成5% 質(zhì)量濃度）；TLR4 （bs-20594R）、NF-κB （bs-2695R）、TNF-α （bsm-0387M）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.4 主要儀器 BS110電子天平（德國賽多利斯公司）；TEC5組織包埋機(jī)（北京怡康勇佳科技有限責(zé)任公司）；QPJ-1C型石蠟切片機(jī)（天津愛華醫(yī)療器械有限公司）；olympusVanox型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；DZF-1AS真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法

2.1 疾病相關(guān)高通量芯片數(shù)據(jù)DEGs篩選及相關(guān)通路分析 DEGs是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生表達(dá)量改變的一些基因,可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在GSE121038和GSE48787數(shù)據(jù)集中,利用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的在線分析工具GEO2R分別篩選AP相關(guān)的DEGs及ALI相關(guān)的DEGs。篩選標(biāo)準(zhǔn)為①adj P＜0.05；② | log FC| ≥1.5。分別選取2個(gè)數(shù)據(jù)集的上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs取交集,作為AP伴發(fā)ALI的DEGs進(jìn)行后續(xù)分析。在KEGG數(shù)據(jù)庫［10］（https：//www.kegg.jp/kegg/mapper.html）輸入上述篩選的DEGs及相應(yīng)物種信息,檢索DEGs相關(guān)的信號通路。

2.2 動(dòng)物分組、疾病模型制備及給藥 大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為假手術(shù)組、AP模型組、血必凈注射液組,16只/組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。造模前各組大鼠均禁食12 h,自由飲水。本實(shí)驗(yàn)采用牛磺膽酸鈉制備AP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定于無菌手術(shù)臺上。腹部備皮、消毒,開腹后在胰腺被膜下多點(diǎn)注射5%?；悄懰徕c,當(dāng)胰腺顏色由淡粉色變?yōu)樯罴t色時(shí)關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組在開腹后僅輕輕翻動(dòng)胰腺及十二指腸數(shù)次即可關(guān)腹。造模結(jié)束后,將大鼠以右側(cè)臥位放回鼠籠,禁食、水,并注意保溫,同時(shí)密切觀察其生命狀態(tài)。血必凈注射液組大鼠造模前12 h、造模后10 min內(nèi)、6、24 h分別腹腔注射血必凈注射液4 mL/kg,其余各組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。

2.3 樣本采集及指標(biāo)檢測 于造模后6、24 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取8只大鼠心臟取血,分離血清用于AMY檢測。處死大鼠后取出胰腺和肺臟,用于組織病理學(xué)觀察及肺臟組織TLR4/NF-κB表達(dá)水平的檢測。

2.3.1 血清AMY檢測 利用AMY ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清AMY活性,具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.3.2 胰腺及肺臟組織病理學(xué)觀察 處死大鼠開腹后,觀察腹水顏色、胰腺組織及胰周組織器官的形態(tài)變化。取出部分胰腺經(jīng)甲醛固定。打開胸腔后觀察肺臟病理學(xué)變化,取出部分右肺經(jīng)甲醛固定。甲醛固定的組織經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯浸透和石蠟包埋,切片,進(jìn)行HE常規(guī)組織學(xué)染色。

2.3.3 肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平檢測 取出大鼠部分左肺制備組織勻漿,利用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用單因素方差分析方法。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AP肺損傷DEGs篩選結(jié)果及相關(guān)通路分析 本研究從GSE121038數(shù)據(jù)集中篩選到相關(guān)DEGs 809個(gè)（上調(diào)基因562個(gè),下調(diào)基因247個(gè)）。從GSE48787數(shù)據(jù)集中篩選到相關(guān)DEGs 613個(gè)（上調(diào)基因319個(gè),下調(diào)基因294個(gè)）。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別取交集,共獲得54個(gè)DEGs （上調(diào)基因40個(gè),下調(diào)基因14個(gè)）?；鹕綀D見圖1。在KEGG數(shù)據(jù)庫中,分析結(jié)果顯示DEGs主要集中在Toll樣受體、TNF-α、HIF-1等信號通路且以上調(diào)基因?yàn)橹?提示ALI發(fā)病過程中這些通路可能被異常激活。見圖1～4。

3.2 血清AMY活性檢測結(jié)果 ELISA檢測結(jié)果顯示,造模后6 h及24 h AP組及血必凈注射液組血清AMY活性顯著高于假手術(shù)組,但在24 h血必凈注射液組AMY活性低于AP組,提示血必凈注射液對重癥AP肺損傷可能有一定治療作用,但需聯(lián)用其他藥物以加強(qiáng)療效。結(jié)果見表1。

表1 血必凈對AP大鼠血清AMY活性的影響（n=8，）

表1 血必凈對AP大鼠血清AMY活性的影響（n=8，）

注：與假手術(shù)組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01；與AP模型組比較,*P＜0.05。

3.3 血必凈對AP大鼠胰腺及肺臟組織病理學(xué)的影響 胰腺組織切片HE染色鏡下觀察顯示假手術(shù)組胰腺結(jié)構(gòu)完整清晰,無胰腺腺葉崩解破壞,未見有炎癥細(xì)胞浸潤。造模后6 h時(shí)AP模型組大鼠胰腺腺葉出現(xiàn)崩解破壞,有炎癥細(xì)胞浸潤,24 h時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤增多；血必凈注射液組胰腺結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組不同,也可見胰腺腺葉損壞、炎癥細(xì)胞浸潤等情況,但其病損程度與AP模型組比較明顯好轉(zhuǎn),見圖5。肺組織切片HE染色鏡下觀察顯示假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔清晰,肺泡內(nèi)未見炎癥細(xì)胞及水腫。造模后6 h時(shí)AP模型組肺組織出現(xiàn)破壞,結(jié)構(gòu)不完整,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及水腫并可見到肺間質(zhì)充血水腫及增厚,24 h時(shí)炎癥細(xì)胞略有增多。血必凈注射液組6 h和24 h也有一定程度病理改變,但較AP模型組減輕,見圖6。

圖1 GSE121038和GSE48787數(shù)據(jù)集DEGs火山圖

圖2 Toll樣受體信號通路

圖3 TNF信號通路

圖4 HIF信號通路

3.4 血必凈對AP大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示,在造模后6 h,與假手術(shù)組比較,AP模型組大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平顯著升高。血必凈注射液組大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達(dá)水平也顯著升高,比AP模型組有降低趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）,見表2。造模后24 h,AP模型組大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平進(jìn)一步升高,血必凈注射液組大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平較AP模型組有所下調(diào),其中以TNF-α 表達(dá)水平下降最為顯著（P＜0.01）,見表3。

表2 造模后6 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平（n=8，）

表2 造模后6 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平（n=8，）

注：與假手術(shù)組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表3 造模后24 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平（n=8，）

表3 造模后24 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達(dá)水平（n=8，）

注：與假手術(shù)組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01；與AP模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 討論

AP是一種臨床常見的外科急腹癥,主要病因是膽道疾病和酒精,但近年來高脂血癥繼發(fā)的胰腺炎比例也越來越高［11］。此外,自身免疫性胰腺炎、藥物性胰腺炎也開始普遍受到關(guān)注［12］。AP主要特征是全身炎癥和胰腺壞死/凋亡［13］。目前研究認(rèn)為AP發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵就是體內(nèi)促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失衡,大量炎癥因子不僅損害胰腺而且可以損傷胰腺以外的遠(yuǎn)隔臟器,如肺臟、肝臟、腎臟腺等。其中以ALI最為突出,并且可以演變成為呼吸衰竭,是胰腺炎引起死亡的主要原因［14］。因此,不斷深入研究SAP引發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制和治療方法是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。

圖5 血必凈注射液對AP大鼠胰腺病理形態(tài)改變的影響（HE×400）

圖6 血必凈注射液對AP大鼠肺臟病理形態(tài)改變的影響（HE×400）

GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）開發(fā)并維護(hù)的一個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)倉庫和在線資源,收錄了世界各國研究機(jī)構(gòu)及研究者提交的各種高通量數(shù)據(jù),是生物信息學(xué)研究分析的重要數(shù)據(jù)來源,對于疾病發(fā)病機(jī)制的研究、潛在靶點(diǎn)的篩選提供了重要信息［15-16］。本研究從GEO高通量數(shù)據(jù)庫中篩選AP及ALI樣本和正常對照樣本之間具有差異表達(dá)的基因,共篩選出的54個(gè)主要參與促進(jìn)炎癥反應(yīng)、IL-1及TNF介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、凋亡過程、中性粒細(xì)胞趨化過程等,并且富集在HIF-1信號通路、TNF信號通路、趨化因子信號通路、PI3K-Akt （磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B）等信號通路。其中,TNF信號通路是典型的炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。已有大量研究證實(shí)AP引發(fā)的ALI主要就是由于炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α 大量釋放所致［17］,且TLR4/NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)［18］,TLR-4可介導(dǎo)NF-κB的活化,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IL-6等,這些炎癥因子又可以激活TLR4/NF-κB通路,進(jìn)而引起炎癥“瀑布式反應(yīng)”。

AP并發(fā)ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,單一的抗炎藥物難以取得良好的療效。血必凈注射液由當(dāng)歸、紅花、川芎、赤芍、丹參5味中藥組成,具有多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)［19］,主要用于膿毒癥治療,其作用機(jī)制主要是通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生［20］,此外還與抗內(nèi)毒素、抑制炎癥、恢復(fù)凝血和免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)［21-22］。血必凈注射液在臨床使用時(shí)給藥途徑為靜脈注射,但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中考慮到大鼠尾靜脈較細(xì),注射時(shí)藥物易滲漏于周圍組織影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,有研究表明腹腔注射可代替尾靜脈注射［23］,所以一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以大鼠腹腔注射方式給予血必凈治療［24-25］。根據(jù)血必凈注射液臨床每日使用劑量,結(jié)合大鼠與人藥物劑量折算系數(shù)6.25［26］及本研究中的給藥間隔時(shí)間,故而計(jì)算出大鼠腹腔注射給藥劑量為4 mL/kg,也見其他研究給予大鼠腹腔注射4 mL/kg血必凈注射液進(jìn)行治療［27-28］。本研究利用常見的胰腺被膜下注射5% ?；悄懰徕c的方法制備AP大鼠模型［29］,分別利用血清AMY含有量和肺組織病理學(xué)改變、TLR4/NF-κB信號通路關(guān)鍵分子TLR4、NF-κB、TNF-α 的表達(dá)水平初步觀察血必凈注射液對于AP大鼠ALI的保護(hù)作用及可能機(jī)制,結(jié)果表明血必凈注射液可能通過抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路發(fā)揮一定的治療效果。

綜上所述,本研究利用生物信息篩選AP并發(fā)ALI的相關(guān)靶點(diǎn)及富集的信號通路,同時(shí)觀察血必凈注射液對AP并發(fā)ALI模型大鼠的治療作用及可能機(jī)制,以期為該病機(jī)制的深入研究及血必凈注射液作用機(jī)制的探討提供依據(jù)。