徐文華趙 陽#寧桂蘭馬曉聰趙新望王海娟張曉文鄭景輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心內(nèi)科，廣西南寧 530000）

冠心病是指發(fā)生在冠狀動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,是世界范圍內(nèi)最常見的心血管疾病［1］。根據(jù)《中國心血管病報(bào)告2017》,2015年中國城市和農(nóng)村居民冠心病死亡率繼續(xù)2012年以來的上升趨勢［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療冠心病雖然效果明顯,但是不良反應(yīng)明顯。中醫(yī)藥治療冠心病效果良好且不良反應(yīng)較小。目前,中醫(yī)藥的化學(xué)成分和藥理活性研究方法很多,包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC/MS）、核磁共振法（NMR）和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、生化實(shí)驗(yàn)等［3］。方法耗時(shí)、成本高、效益低,僅用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法分析中醫(yī)藥的作用機(jī)制是比較困難的,因此課題組采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法基于分子層面對(duì)血府逐瘀湯進(jìn)行研究。通過計(jì)量文獻(xiàn)學(xué)方法,對(duì)當(dāng)前治療冠心病的熱門中藥或方劑的使用性進(jìn)行篩選。初步驗(yàn)證和預(yù)測了熱門方劑治療冠心病的作用機(jī)制,以期為進(jìn)一步深入揭示其作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源與檢索策略 在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索自建庫以來所收集的中醫(yī)藥治療冠心病的相關(guān)文獻(xiàn),具體檢索式見圖1。

1.2 提取文獻(xiàn)數(shù)據(jù)并繪制中藥相關(guān)的高頻關(guān)鍵詞共現(xiàn)圖、聚類分析圖 應(yīng)用書目共現(xiàn)分析系統(tǒng)軟件提取檢索文獻(xiàn)的發(fā)表的關(guān)鍵詞,選取出現(xiàn)頻次≥10以上的關(guān)鍵詞作為高頻關(guān)鍵詞,并對(duì)高頻關(guān)鍵詞進(jìn)行共現(xiàn)分析。摘取與中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān)的共現(xiàn)關(guān)系,導(dǎo)入Cytoscape

3.6.1 軟件中生成共現(xiàn)圖。摘取中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）之間相關(guān)的共現(xiàn)關(guān)系,導(dǎo)入IBM SPSS v21統(tǒng)計(jì)分析軟件中生成聚類分析圖。

1.3 高頻方劑的化學(xué)成分收集以及靶點(diǎn)預(yù)測 利用TCMSP （中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)）數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/）檢索高頻方劑中的藥物對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分,以建議藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%［4］,類藥性（drug likeness,DL）≥0.18［5］,篩選高頻方劑中高頻方劑中的活性成分以及靶點(diǎn)。

1.4 冠心病相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建 本研究基于CTD （應(yīng)用毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫）、TTD （治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫）及GeneCards數(shù)據(jù)庫綜合篩選冠心病相關(guān)靶點(diǎn),TTD數(shù)據(jù)庫是一個(gè)提供關(guān)于耐藥性突變的對(duì)目標(biāo)和藥物基因表達(dá)和目標(biāo)組合的數(shù)據(jù)庫［6］,GeneCards數(shù)據(jù)庫是一個(gè)可搜索的、集成的數(shù)據(jù)庫,它提供了關(guān)于所有注釋和預(yù)測的人類基因的全面的信息。提供GiftS算法,構(gòu)建基因與疾病的相關(guān)度排序,根據(jù)“Relevance score” 可在特定疾病對(duì)應(yīng)的眾多靶點(diǎn)中進(jìn)一步篩選相關(guān)度更高的靶點(diǎn)從而減少冗余,經(jīng)三大數(shù)據(jù)庫挖掘共同篩選冠心病相關(guān)基因。利用Venn分析工具,將三大數(shù)據(jù)庫與血府逐瘀湯潛在靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)分析得到血府逐瘀湯作用于冠心病的靶點(diǎn)。并利用Cytoscape 3.6.1軟件蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖和化合物靶點(diǎn)圖。

1.5 血府逐瘀湯作用靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析 將血府逐瘀湯潛在藥效靶點(diǎn)的上傳到David 6.8數(shù)據(jù)庫 （https：//david.ncifcrf.gov/）中,進(jìn)行GO （基因本體）分析和KEGG （基因組百科全書）分析。將GO分析生物過程（biological process,BP）、細(xì)胞成分 （cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行可視化分析。并利用Omicshare （http：//www.omicshare.com/）網(wǎng)站繪制氣泡圖。

1.6 血府逐瘀湯主要活性成分-血府9010瘀湯對(duì)冠心病作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果分析系統(tǒng)分子對(duì)接（systems dock）Systems Dock Web Site （http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）數(shù)據(jù)庫,是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測和分析的Web服務(wù)器,它應(yīng)用高精度對(duì)接模擬和分子路徑圖來綜合表征配體選擇性,并說明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。系統(tǒng)對(duì)接應(yīng)用AutoDock Vina進(jìn)行對(duì)接模擬,預(yù)測蛋白質(zhì)和配體結(jié)合的性能,調(diào)整X-Y-Z坐標(biāo)和網(wǎng)格大小以細(xì)化綁定的位置［7］。對(duì)接結(jié)果的分?jǐn)?shù)=（PKD/PKI）的負(fù)對(duì)數(shù),Docking Scores的值通常為0至10。登陸Systems Dock Web Site數(shù)據(jù)庫,將血府逐瘀湯拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算出最主要的5個(gè)化合物與血府逐瘀湯治療冠心病靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中計(jì)算的前5蛋白輸入PDB ID,找活性位點(diǎn),計(jì)算格點(diǎn),調(diào)整X-Y-Z坐標(biāo)來細(xì)化位置。輸入化合物的化學(xué)分子結(jié)構(gòu),成功后開始對(duì)接,整理對(duì)接結(jié)果中的Docking Score并分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索的結(jié)果 根據(jù)圖1檢索式,在中國知網(wǎng)中共收集到自建庫以來中醫(yī)藥治療冠心病的相關(guān)文獻(xiàn)5 451篇。

2.2 文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞提取結(jié)果 通過書目共現(xiàn)分析系統(tǒng)軟件（BICOMB）,從5 451篇文獻(xiàn)中共提取6 443個(gè)關(guān)鍵詞,選取頻次≥10以上的關(guān)鍵詞作為高頻關(guān)鍵詞,共得到高頻關(guān)鍵詞309個(gè),頻次累計(jì)百分比占總頻次的60.026 4%。其中27個(gè)關(guān)鍵詞與中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān),見表1。摘取與中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān)的共現(xiàn)關(guān)系,將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件,生成共現(xiàn)圖（圖2）。導(dǎo)入IBM SPSS v21統(tǒng)計(jì)分析軟件,生成聚類圖（圖3）。經(jīng)文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)結(jié)果計(jì)算發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯在中醫(yī)藥治療冠心病的過程中應(yīng)用最為廣泛。

2.3 血府逐瘀湯有效成分篩選 通過篩選得到血府逐瘀湯活性成分148種,其中枳殼5種、桃仁23種、當(dāng)歸2種、紅花22種、赤芍29種、甘草42種、生地黃2種、川芎7種、桔梗7種、柴胡17種、牛膝20種。其中潛在作用靶點(diǎn)138個(gè),作用于冠心病的靶點(diǎn)38個(gè),其中包括細(xì)胞色素P450 （CYP3A4）、超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮合酶（NOS2）、絲裂原活化蛋白激酶1 （MAPK1）、白細(xì)胞介素-6受體亞單位α （IL-6）等。GO分析得到27個(gè)生物學(xué)過程,其中包括細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮生長因子刺激的反應(yīng) （cellular response to vascular endothelial growth factor stimulus）、血管生成 （mammary gland alveolus development）、過氧化氫對(duì)缺氧的反應(yīng)基因表達(dá)的正調(diào)控（esponse to hydrogen peroxide response to hypoxia positive regulation of gene expression）等；3個(gè)細(xì)胞組成包括細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）、細(xì)胞小凹（caveola）、細(xì)胞外空間（extracellular space）和4個(gè)分子功能血紅素結(jié)合（heme binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、相同的蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）；KEGG分析得到22條信號(hào)（取本杰明矯正P＜0.01）通路包括：HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路 （TNF signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路 （PI3K-Akt signaling pathway）、FoxO信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）等與心血管疾病高度相關(guān)的信號(hào)通路 （具體結(jié)果見圖4～6、表2）。

表1 中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān)的高頻關(guān)鍵詞

圖2 中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān)的共現(xiàn)關(guān)系共現(xiàn)圖

圖3 中藥類（復(fù)方、單味藥、中成藥）高頻關(guān)鍵詞聚類圖

圖4 血府逐瘀湯的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（節(jié)點(diǎn)大小、連線粗細(xì)根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)相關(guān)參數(shù)繪制）

2.4 分子對(duì)接結(jié)果 系統(tǒng)分子對(duì)接結(jié)果血府逐瘀湯對(duì)冠心病作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果如表3所示。一般認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)合力值大于4.25表示對(duì)接分子與靶點(diǎn)之間有一定的結(jié)合活性,大于5.0表明對(duì)接分子與靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性,大于7.0則說明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［8］。分子對(duì)接結(jié)果顯血府逐瘀湯多個(gè)靶點(diǎn)的Docking Score值大于8.0證明有強(qiáng)烈的結(jié)合活性,見圖7,且多個(gè)靶點(diǎn)大于5.0。由此表明血府逐瘀湯主要化學(xué)成分與血府逐瘀湯對(duì)冠心病作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。

圖5 血府逐瘀湯的化合物靶點(diǎn)圖

圖6 血府逐瘀湯作用靶點(diǎn)的GO分析

表2 血府逐淤湯作用于冠心病的KEGG分析結(jié)果

3 討論

冠心病屬于中醫(yī)“胸痹” “心痛” “心悸” “喘證”“水腫” 等病范疇,中藥相對(duì)于西藥較為安全可靠［9］。中醫(yī)理論從整體和宏觀的角度出發(fā),強(qiáng)調(diào)辨證論治、從整體出發(fā)協(xié)同配伍。但是由于中藥配伍的復(fù)雜性且具有多因、多效、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),其作用于疾病的具體分子機(jī)制難以被闡明。本研究通過文獻(xiàn)檢索、共現(xiàn)分析和聚類分析等文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析,探討中醫(yī)藥干預(yù)治療冠心病的常用藥。利用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法根據(jù)機(jī)體對(duì)外援化學(xué)物質(zhì)的吸收、分布、代謝、排泄、以及化合物對(duì)機(jī)體的毒性篩選出中藥有效成分。血府逐瘀湯是經(jīng)文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)計(jì)算臨床應(yīng)用研究最為廣泛的方劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［10-11］,血府逐瘀湯可以通過調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)影響細(xì)胞的壽命,控制血管的生成,降低神經(jīng)損傷。并且可以改善腦血管舒縮功能、降低細(xì)胞損傷,從而改善血液供應(yīng)。

圖7 血府逐瘀湯主要化學(xué)成分與血府逐瘀湯對(duì)冠心病作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果示例（僅列出Docking值大于8.0的）

表3 血府逐瘀湯主要化學(xué)成分與血府逐瘀湯對(duì)冠心病作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

對(duì)血府逐瘀湯與其他309個(gè)高頻關(guān)鍵詞的共現(xiàn)分析,如圖2所示,發(fā)現(xiàn)共有29個(gè)高頻關(guān)鍵詞與血府逐瘀湯存在共現(xiàn)關(guān)系,其中涉及病機(jī)的關(guān)鍵詞有血液流變學(xué)、血瘀、氣虛血瘀、血脂,涉及治法的關(guān)鍵詞是活血化瘀,研究表明,血府逐瘀湯治療冠心病的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面［12］,（1）抗血小板聚集：前期研究顯示,血府逐瘀湯可干預(yù)血清PAF （血小板活化因子）含有量升高,以抑制血小板聚集,改善微循環(huán)及血管內(nèi)皮功能,助緩動(dòng)脈粥樣硬化形成。（2）改善循環(huán)抗心肌缺血：研究報(bào)道,血府逐瘀湯通過下調(diào)CRP （反應(yīng)蛋白）、BNP （腦鈉肽）水平可緩解炎癥的刺激,使血管舒張、血流量提升,減輕心肌容量負(fù)荷,避免心肌細(xì)胞受損。（3）調(diào)血脂：血府逐瘀湯通過降低后主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊MPO （髓過氧化物酶）指標(biāo),使血脂四項(xiàng)含有量減少,從而使血管壁結(jié)構(gòu)改變,延緩動(dòng)脈粥樣硬化（AS）進(jìn)程。據(jù)《醫(yī)林改錯(cuò)》 書中描述血府逐瘀湯由桃紅四物湯、四逆散加桔梗、牛膝組成,其中桃紅四物湯有活血化瘀而養(yǎng)血的功效；四逆散有疏肝理氣,氣行則血行得作用；另配伍桔梗引藥上行于胸中,牛膝引血下行利血脈。諸藥調(diào)和,共奏祛瘀、活血、行氣、通絡(luò)、止痛。另外對(duì)27個(gè)與中藥（復(fù)方、單味藥、中成藥）相關(guān)的高頻關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析,如圖3所示,27個(gè)高頻關(guān)鍵詞被從上到下依次分為10級(jí)樹狀圖血府逐瘀湯處于樹狀圖的最高級(jí)層,進(jìn)一步說明血府逐瘀湯在治療冠心病藥物中的重要地位。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選,血府逐瘀湯中槲皮素在一定濃度范圍內(nèi)可明顯抑制血管緊張素誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增值和膠原蛋白合成增加,同時(shí)可升高SOD含有量、降低MDA （丙二醛）活力,從而延緩心肌纖維化的發(fā)展［13］。異鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗脂肪形成、抗增殖和抗腫瘤活性的作用,Gao等［14］新生大鼠心肌細(xì)胞中進(jìn)行的體外研究證實(shí),異鼠李素可以減弱血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,而血管緊張素Ⅱ與PI3K-AKT信號(hào)通路有關(guān),異鼠李素具有通過阻斷PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑靶向心臟肥大的保護(hù)潛力。Zhou等［15］通過對(duì)山柰酚處理對(duì)大鼠心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn),山柰酚預(yù)處理顯著提高了LVDP（左室發(fā)展壓）的恢復(fù)率和土dp/dt max,并提高了SOD和phospho-GSK-3β 水平以及GSH/GSSG （谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）比值；減少了心肌梗塞面積和TUNEL （原位末端標(biāo)記法）陽性細(xì)胞率,并降低了裂解的caspase-3 （半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）、細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C、CK （肌酸激酶）、LDH （乳酸脫氫酶）、MDA和TNF-α 的水平,通過抗氧化活性和抑制GSK-3β 活性提供心臟保護(hù)作用。Liao等［16］在小檗堿干預(yù)大鼠心肌梗死后心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)小檗堿能通過上調(diào)Bcl-2 （B細(xì)胞淋巴瘤）和下調(diào)caspase-3表達(dá),從而抑制心臟重塑和保護(hù)心臟功能。除此之外,血府逐瘀湯中還有芍藥苷、豆甾醇等通過調(diào)節(jié)炎癥因子、細(xì)胞因子和氧化損傷來干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而起到血管內(nèi)皮保護(hù)作用的化合物。

在對(duì)血府逐瘀湯治療冠心病的作用靶點(diǎn)其生物學(xué)過程分析中,提示血府逐瘀湯在治療冠心病的過程中與一氧化氮合成、激活MAPK活動(dòng)、血管生成等活動(dòng)密切相關(guān)。TNF-α、IL-1B、MAPK1等均富集在以上通路中。TNF-α 參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié),對(duì)冠狀動(dòng)脈上皮平滑肌細(xì)胞增殖具有誘導(dǎo)的作用,并且會(huì)誘導(dǎo)IL-β 等炎性因子的產(chǎn)生,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。白細(xì)胞介素-1β 作為血清炎性指標(biāo)的一類,對(duì)血管功能具有調(diào)節(jié)的作用,在冠心病中表達(dá)水平較高。p38MAPK參與了NF-κB的激活,可誘導(dǎo)缺氧心肌細(xì)胞凋亡,抑制p38MAPK可改善心肌損傷動(dòng)物心功能不全、減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生［17］。過程在KEGG富集分析中得到的HIF-1 （缺氧誘導(dǎo)因子）信號(hào)通路,在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中表明［18］HIF-1α 在參與對(duì)低氧反應(yīng)基因的調(diào)控,可以促進(jìn)VEGF、促紅細(xì)胞生成素（EPO）、HO-1等因子的表達(dá)。在冠心病發(fā)生、發(fā)展過程中HIF-1/HO-1被激活,通過抗氧化作用保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,保護(hù)內(nèi)皮系統(tǒng)的穩(wěn)定性,同時(shí)促進(jìn)血管平滑肌凋亡,減輕血管損傷后的不良重構(gòu)。PI3K/AKT信號(hào)通路作為治療心血管疾病的明星通路,PI3K/AKT信號(hào)通路的活化可以介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng),它通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、血管再生進(jìn)而影響其在心血管系統(tǒng)的表達(dá)［19］。FoxO轉(zhuǎn)錄因子［20］是一類在許多生理功能中重要的高度保守蛋白。然而,即使FoxO是胰島素的下游靶標(biāo),FoxO因子也控制上游信號(hào)元件控制胰島素敏感性和葡萄糖代謝。FoxO活性的變化通過抑制蛋白磷酸酶對(duì)心肌細(xì)胞中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)具有劑量響應(yīng)性抑制作用。此外KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果提示除以上被證實(shí)的通路以外Focal adhesion信號(hào)通路,可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白,肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)與第二生心區(qū)祖細(xì)胞構(gòu)成非經(jīng)典頂端-基底極性上皮有一定相關(guān)性。

本研究應(yīng)用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對(duì)血府逐瘀湯藥治療冠心病的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行初步探索性研究,以期為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多等多種原因,中藥方劑中可能存在的小分子多肽、或是中藥復(fù)方通過腸道菌群調(diào)節(jié)等方式間接對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)控。且由于方法學(xué)限制未從中藥所含化學(xué)成分的含有量進(jìn)行分析,尚需從LC-MS/MS分析其真實(shí)入血成分。并且由于數(shù)據(jù)庫信息不全面、目前認(rèn)識(shí)的不全面性、化合物篩選的主觀性,且只關(guān)注于藥物的組成成分,忽略了其成分的含有量、化合物之間的相互作用以及藥物體內(nèi)代謝過程等的影響,故研究預(yù)測的結(jié)果具有一定的片面性和局限性,需要進(jìn)一步加入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。