楊 雯，王 嘉，王 棟，郭寶鳳，高 磊

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品不良反應(yīng)中心，呼和浩特 010000)

多糖也稱(chēng)多聚糖(Polysaccharide)，是由單糖或簡(jiǎn)單寡糖縮合而成的多聚物，在自然界中廣泛分布。植物多糖，是植物細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的聚合度超過(guò)10個(gè)的聚糖[1]。不能再水解的糖類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)為單糖(Monosaccharide)，單糖可以依據(jù)其碳數(shù)的不同分為丙糖、丁糖、戊糖、己糖等,植物中的單糖以己糖(六碳糖)為主[2]，常見(jiàn)的單糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。多糖具有多種生物活性，如提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血糖和血脂等功效[3]。多糖的生物活性與多糖的單糖組成及相對(duì)分子質(zhì)量緊密相關(guān)。在研究多糖結(jié)構(gòu)與組分時(shí)，必須對(duì)多糖進(jìn)行水解，通過(guò)分離純化，用適宜的分析方法測(cè)定單糖含量，以獲得相應(yīng)單糖的組成信息。測(cè)定多糖中單糖的組成，對(duì)多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)效活性的研究有一定的基礎(chǔ)意義。

1 多糖水解

水解多糖大分子的方法有多種，包括酸水解、酶水解、氧化水解、超聲波水解等[4]，其中酸催化水解是目前的主流技術(shù)，其它方法使用較少。

1.1 酸催化水解法

多糖的水解是破壞糖苷鍵的過(guò)程。酸性條件下會(huì)提供大量的H+，這有利于反應(yīng)的進(jìn)行。然后隨著糖苷鍵的斷裂，苷元的脫離，C+溶劑化，最后質(zhì)子被去除形成單糖[5]。目前，酸水解中最常用的酸主要為硫酸(H2SO4)、鹽酸(HCl)、三氟乙酸(TFA)。

1.1.1HCl水解

鹽酸價(jià)廉且易揮發(fā)，通常用于酸解制備低聚糖[6]，但由于在高壓或高溫條件下鹽酸具有強(qiáng)酸性和氧化性，會(huì)破壞多糖，反應(yīng)不易控制。

1.1.2H2SO4水解

中性多糖常用硫酸進(jìn)行水解，由于其強(qiáng)酸的特性，在使用過(guò)程中必須嚴(yán)格控制使用濃度。硫酸法水解后，使用氫氧化鋇除去硫酸，硫酸鋇沉淀會(huì)吸附單糖，硫酸也與單糖可能發(fā)生作用而使產(chǎn)率降低，降低檢測(cè)結(jié)果的精確度[7]。

1.1.3TFA水解

TFA因其易于除去、氧化性不強(qiáng)，對(duì)多糖的破壞小等顯著優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。TFA帶有強(qiáng)電負(fù)性的-CF基團(tuán)，可以吸引更多氫離子，從而催化促進(jìn)多糖的水解[8]。胡坪[9]等采用三氟乙酸(TFA)對(duì)麥冬多糖進(jìn)行全水解，考察了麥冬多糖的水解受TFA的濃度、溫度以及時(shí)間的影響程度，結(jié)果表明隨著TFA濃度的增加，水解產(chǎn)物中果糖和葡萄糖的質(zhì)量均先升高后下降，在0.01～0.03mol·L-1之間，單糖質(zhì)量均達(dá)到最高值，且其最佳水解時(shí)間為2h。

多糖的水解早期多采用不同濃度的鹽酸與硫酸，但這兩種酸水解完成后，需要將pH值調(diào)成中性后，再進(jìn)行檢測(cè)，操作相當(dāng)復(fù)雜[10]，TFA在水解后可用減壓蒸餾或冷凍干燥法除去，避免了傳統(tǒng)的中和步驟，操作簡(jiǎn)便快捷，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。

1.2 酶催化水解法

酶催化水解法是利用水解酶特異性地水解特定類(lèi)型的糖苷鍵[11]。該方法反應(yīng)過(guò)程中不需要加入大量的試劑，反應(yīng)條件溫和，速度快，克服了化學(xué)水解產(chǎn)品均一性差的缺點(diǎn)，但酶降解法受多種因素的影響，如溶液的溫度、底物濃度、酶溫度[12]。因此，目前酶催化水解多糖仍有一定的局限性。

1.3 氧化降解

氧化降解的實(shí)質(zhì)是使糖苷鍵發(fā)生非酶氧化斷裂，目前常用的氧化劑為過(guò)氧化氫(H2O2)。不同的糖苷鍵對(duì)H2O2處理的敏感性不同，隨著H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加會(huì)導(dǎo)致糖苷鍵斷裂，同時(shí)也會(huì)引起敏感單體的降解，因此H2O2降解多糖時(shí)有最適的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)[13]。王靈昭[14]等利用H2O2水解水不溶性條斑紫菜多糖，研究發(fā)現(xiàn)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)溶出率最高。鄧六勤[15]等采用維生素C(Vit C)和H2O2體系產(chǎn)生的自由基水解黃芪多糖，用H2O2氧化降解多糖無(wú)毒，沒(méi)有副產(chǎn)物，是一種理想的水解方法，但此方法在現(xiàn)代研究中應(yīng)用較少。

1.4 超聲波法

超聲波降解多糖是采用合適的頻率和功率的將大分子鏈打斷。超聲波降解法具有節(jié)省時(shí)間、能源，操作簡(jiǎn)便，有機(jī)溶劑使用量較少，降低污染等優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)成本過(guò)高，收率過(guò)低，因此在單糖組成分析中，使用超聲波進(jìn)行多糖降解未有報(bào)道。

2 單糖衍生化

大部分糖紫外吸收很弱，不能利用光吸收的方法進(jìn)行直接檢測(cè)，需將糖類(lèi)進(jìn)行衍生化處理，使其帶有發(fā)光基團(tuán)，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，使檢測(cè)靈敏度提高。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、反應(yīng)條件條件溫和，被廣泛應(yīng)用于定性與定量分析中[16]。衍生化試劑的用量、反應(yīng)時(shí)間都會(huì)對(duì)衍生反應(yīng)產(chǎn)生不同程度的影響[17]。

3 單糖的含量測(cè)定

測(cè)定單糖含量的傳統(tǒng)方法有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但此方法無(wú)法對(duì)單糖的具體含量進(jìn)行測(cè)定[18]。多糖中單糖含量測(cè)定方法有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、毛細(xì)管電泳檢測(cè)法(CE)以及離子色譜法(IC)等。

3.1 薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography，TLC)

薄層色譜法樣品制備簡(jiǎn)單，無(wú)需衍生化，能夠同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的分析，操作方便可行，設(shè)備簡(jiǎn)單易得。但是其靈敏度低，分離效果差。鄧勇[19]等采用薄層色譜法對(duì)不同蟲(chóng)草多糖的單糖組成進(jìn)行分析，錢(qián)夕惠[20]采用薄層色譜法分析靈芝多糖中的單糖組成。此法僅適用于定性分析，在單糖的定量分析方面未見(jiàn)報(bào)道。

3.2 氣相色譜法(Gas chromatography，GC)

GC靈敏度較高、分析速度較快、測(cè)定所需試樣量少，在多糖以及單糖的研究中廣泛應(yīng)用。但是糖類(lèi)的沸點(diǎn)高、揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較低，需對(duì)其進(jìn)行衍生化處理然后測(cè)定。而GC的單糖衍生化反應(yīng)操作復(fù)雜，容易產(chǎn)生異構(gòu)體，誤差較大[21]。

3.3 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)

高效液相色譜法具有分析快速、靈敏、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，常用于糖類(lèi)的定性和定量分析。與氣相色譜法比較，HPLC的多種分離模式可滿(mǎn)足大部分糖的分析且不存在揮發(fā)性限制的問(wèn)題。HPLC測(cè)定單糖的方法分為衍生化法和非衍生化法。非衍生法通常采用示差折光檢測(cè)器以及蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行分析[22]，但是檢測(cè)器靈敏度低，檢測(cè)限較高，價(jià)格比較昂貴且步驟繁瑣[21]。衍生化法有多種衍生試劑，分為柱前衍生法和柱后衍生法，以PMP為代表的吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑和糖鏈發(fā)生的反應(yīng)屬于柱前衍生法，在弱堿性條件中進(jìn)行，條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定、無(wú)立體異構(gòu)體、被廣泛應(yīng)用于糖類(lèi)化合物的分析。柱后衍生法產(chǎn)生的副產(chǎn)物不會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，穩(wěn)定性需求較低，但需要額外的設(shè)備，成本較高，并且反應(yīng)條件有限[23]，目前采用柱后衍生法測(cè)定單糖的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

3.4 毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)

毛細(xì)管電泳測(cè)定單糖反應(yīng)快速、靈敏高、選擇性好。水溶液中單糖的解離能力較差，只有在強(qiáng)堿性條件下才能使單糖帶上電荷。加入硼砂的緩沖液能讓單糖在較低的pH條件下帶上足夠的負(fù)電荷，不同類(lèi)型的單糖在相同的條件下與硼砂的絡(luò)合物具有有效淌度的差異，可被毛細(xì)管電泳分辨[24]。

3.5 離子色譜法(Ion Chromatography，IC)

離子色譜是近年發(fā)展起來(lái)的一種糖類(lèi)物質(zhì)分析方法。單糖通過(guò)在安培檢測(cè)器的金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，引起電流變化而被檢測(cè)[25]，此方法便能高效、可以準(zhǔn)確地進(jìn)行單糖分析，無(wú)需衍生化，操作簡(jiǎn)單，并且每種單糖都能產(chǎn)生單一色譜峰，靈敏度高，非常適合樣品來(lái)源較困難的多糖的糖組分分析[26]。

4 展望

通過(guò)對(duì)2009-2019年的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，近年來(lái)通過(guò)薄層色譜法測(cè)定單糖7種[27]，主要為定性分析；氣相色譜法測(cè)定單糖11種[28-30]；高效液相色譜法測(cè)定單糖15種[17、22、31-33]；毛細(xì)管電泳檢測(cè)法測(cè)定單糖9種[24、34]；離子色譜法測(cè)定單糖13種[35-37]。單糖的種類(lèi)主要為戊糖和己糖，其中高效液相色譜法測(cè)定單糖種類(lèi)最多，最為常用。每種方法都有優(yōu)點(diǎn)、不足之處，有一定的適用范圍，在單糖的含量測(cè)定時(shí)單一方法不能很好的滿(mǎn)足需要時(shí)，應(yīng)考慮多種方法聯(lián)合應(yīng)用。上述內(nèi)容通過(guò)對(duì)多糖的水解以及單糖的含量測(cè)定方法進(jìn)行綜述，對(duì)研究多糖中單糖的組成具有很好的參考價(jià)值。