丁晨 陶紅蕾 傅之梅 章杭 馬婷婷

[摘要] 目的 探討不同神經肽S側腦室注射劑量對瑞芬太尼痛覺敏感小鼠的鎮(zhèn)痛效果。 方法 42只小鼠分為A組（對照組）、B組（切口痛）、C組（瑞芬太尼）、D組（切口痛-瑞芬太尼），利用切口痛-瑞芬太尼模型成功小鼠進行實驗，隨機分為Saline組，0.1 nmol/L NPS側腦室注射組、1 nmol/L NPS側腦室注射組、10 nmol/L NPS側腦室注射組，每組6只。采用小鼠熱板實驗、小鼠熱甩尾實驗、小鼠醋酸扭體實驗檢測不同劑量NPS側腦室注射對瑞芬太尼所引起的痛覺過敏小鼠甩尾潛伏期、應答潛伏期、扭體反應次數的影響。 結果 制作切口痛-瑞芬太尼小鼠術后痛覺過敏模型，在甩尾實驗、熱板實驗和醋酸扭體實驗中，側腦室注射NPS后，小鼠的甩尾潛伏期和熱板實驗潛伏應答期明顯延長，小鼠醋酸扭體反應的次數減少，其作用強度與給藥劑量呈一定的量效關系，10 nmol/L NPS引起的鎮(zhèn)痛作用強于0.1 nmol/L NPS。 結論 側腦室注射神經肽S對瑞芬太尼痛覺敏感小鼠能產生濃度依賴性的鎮(zhèn)痛作用。

[關鍵詞] 神經肽S;瑞芬太尼;痛覺敏感;鎮(zhèn)痛

[中圖分類號] R441.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）28-0051-04

Analgesic effect of different doses of neuropeptide S injected into the lateral ventricle on remifentanil pain-sensitive mice

DING Chen? ?TAO Honglei? ?FU Zhimei? ?ZHANG Hang? ?MA Tingting

Department of Anesthesiology， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou? ?310015， China

[Abstract] Objective To explore the analgesic effect of different doses of neuropeptide S lateral ventricular injection on remifentanil pain-sensitive mice. Methods A total of 42 mice were divided into group A（control group）， group B （incision pain）， group C（remifentanil）， and group D（incision pain-remifentanil）. The incision pain-remifentanil mice were successfully tested and divided into Saline group， 0.1 nmol/L NPS lateral ventricle injection group， 1 nmol/L NPS lateral ventricle injection group，10 nmol/L NPS lateral ventricle injection group， with 6 mice in each group. Mouse hot plate test， mouse hot tail flick test， and mouse acetic acid writhing test were used to detect the tail-flick latency， response latency， and the number of writhing reactions in the pain-sensitive mice induced by different doses of NPS injected in the lateral ventricle. Results The incision pain-remifentanil mouse postoperative hyperalgesia model was made. In the tail flick， hot plate and acetic acid writhing experiment， after the injection of NPS in the lateral ventricle， the tail flick latency and hot plate latency response period in mice was significantly prolonged， and the number of writhing reactions of acetic acid in mice was reduced. The intensity of the action was in a dose-effect relationship with the dose administered. The analgesic effect caused by 10 nmol/L NPS was stronger than that by 0.1 nmol/L NPS. Conclusion Lateral ventricle injection of neuropeptide S can produce concentration-dependent analgesia in remifentanil pain-sensitive mice.

[Key words] Neuropeptide S; Remifentanil; Hyperalgesia; Analgesia

大量使用阿片類鎮(zhèn)痛藥能夠激活體內的促傷害系統(tǒng)，導致周圍和中樞神經系統(tǒng)感受傷害性刺激通路敏感化，提高機體對傷害性刺激的敏感性，即痛覺超敏（Opioidinduced hyperalgesia，OIH）[1-2]。瑞芬太尼是一種新型的μ阿片受體激動劑，具有獨特的藥代動力學特性，起效快、作用時間短、分布容積小、連續(xù)用藥無蓄積、不依賴肝腎代謝[3]。相比于其他阿片類藥物，大劑量或長時間應用瑞芬太尼后發(fā)生的痛覺過敏現象更強烈、更頻繁，易誘發(fā)蘇醒期躁動，心律不齊，影響麻醉蘇醒質量和患者生命安全[4-5]。獲得滿意鎮(zhèn)痛的效果，減少術后鎮(zhèn)痛藥的用量，減少并發(fā)癥發(fā)生，維持患者術后各臟器正常的生理功能，是目前鎮(zhèn)痛工作研究的熱點。神經肽S（Neuropeptide S，NPS）是一個具有20個氨基酸殘基的神經短肽，通過其受體NPSR調節(jié)覺醒與睡眠、焦慮與抑郁、認知與記憶、攝食與結腸運動、促進藥物成癮、免疫和抗氧化、炎性反應等多種重要的生理病理過程[6-9]。NPS的鎮(zhèn)痛作用主要通過多巴胺D2樣受體信號傳導與多巴胺能神經傳遞有關[10]。本實驗采用不同劑量NPS側腦室注射，探討其對瑞芬太尼痛覺敏感小鼠的鎮(zhèn)痛效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次研究所采用的實驗動物為昆明系小鼠，體質量（20±2）g，動物由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SYXK（浙）2019-0003，動物實驗經浙江省立同德醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。小鼠飼養(yǎng)在實驗動物中心的SPF級動物房內，室溫22～24℃，室內相對濕度40%～70%，保持室內12 h進行燈的明暗自動切換，小鼠可以自由進行水和食物的攝取。

1.2 藥物與試劑

鹽酸瑞芬太尼粉劑（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H20143315）。NPS：上海欽誠生物科技有限公司。冰醋酸：沈陽伊威隆化工原料有限公司。Von Frey測痛儀：上海玉研科學儀器有限公司。KW-RB智能熱板儀：南京卡爾文生物科技有限公司。HH-ZKS8恒溫水浴鍋：上海科升儀器有限公司。

1.3 動物模型的建立

參照Brennan等[11]的方法制備切口痛模型：七氟酸吸入麻醉后，將小鼠仰臥固定于操作臺。右后爪消毒后，從足跟近端0.5 cm處縱行切開小鼠足底皮膚，長約1 cm，眼科鑷挑起皮膚和筋膜并縱向切割足底部肌肉，保持肌肉的起止和附著完整，按壓止血后縫合皮膚，碘伏消毒傷口預防感染。

1.4 動物分組

采用隨機數字表法將42只小鼠分為4組，A組、B組、C組，每組6只，D組24只。A組：不行切口操作，靜脈輸注生理鹽水0.1 mL/（kg·min），60 min;B組（切口痛）：制作大鼠切口痛模型同時靜脈輸注生理鹽水0.1 mL/（kg·min），60 min;C組（瑞芬太尼）：不行切口操作;靜脈輸注瑞芬太尼1.0 μg/（kg·min），60 min;D組（切口痛-瑞芬太尼）：切皮同時，靜脈輸注瑞芬太尼1.0 μg/（kg·min），60 min。根據文獻報道，經尾靜脈以1.0 μg/（kg·min）速率輸注瑞芬太尼60 min可誘發(fā)切口痛小鼠OHI[12-13]。

1.5 實驗分組

觀察NPS的鎮(zhèn)痛作用時，將切口痛-瑞芬太尼組造模成功的24只小鼠分別分為Saline組、0.1 nmol/L? NPS注射組、NPS 1 nmol/L NPS注射組和 NPS 10 nmol/L NPS注射組，每組6只。

1.6 側腦室注射

注射部位位于正中線與兩耳連線的交點偏左或右1.5 mm，采用10 μL的微量注射器進行側腦室注射，垂直顱骨進針2.5 mm，避免進針過深而破壞腦組織。側腦室注射 NPS（0.1、1.0、10 nmol/L）和Saline，5 min后開始進行小鼠甩尾實驗、小鼠熱板實驗、醋酸扭體實驗。

1.7 小鼠甩尾實驗

環(huán)境溫度為（20±1）℃，選擇正常痛閾值在（3～6 s）內的合格小鼠。側腦室注射藥物后，將小鼠尾部放置在（48.0±0.5）℃水浴鍋內，從小鼠尾巴進入熱水中到尾部甩離水面的時間計為小鼠的熱甩尾潛伏期（TWL），測定給藥后5、10、30、60 min時的TWL。為防止燙傷，浸入時間不超過15 s（這個時間是造模成功后的小鼠做實驗的時間）。

1.7 小鼠熱板實驗藥物

注射前，設定熱板溫度為（55±0.5）℃，選擇正常痛閾值在5～30 s內的合格小鼠。將小鼠置于熱板上，以其足部接觸熱板到出現明顯縮足、舔足、抬足行為的時間為應答潛伏期（HPPT）。側腦室注射藥物后，測定給藥后5、10、30、60 min時的HPPT。為防止燙傷，30 s為上限。

1.8 小鼠醋酸扭體實驗

環(huán)境溫度為（20±1）℃。小鼠腹腔內注射0.60%醋酸0.1 mL/10 g，觀察15 min內各組大鼠出現腹部內凹、后肢伸張、臀部高起等扭體反應出現次數，計算藥物對扭體反應的抑制率。

1.9 統(tǒng)計學方法

數據應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較應用單因素方差分析和重復測量方差分析，并進行組間Dunnet t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 構建動物模型

B組、C組、D組術后各時間點TWL短于少于術前，提示各組小鼠痛覺敏感性較術前明顯增強。B組、C組、D組術后各時間點TWL短于對照組，提示B組、C組、D組敏感性強于A組。C組和D組術后24 h TWL較術后6 h、術后48 h縮短，提示模型最佳實驗時間為術后24 h。見表1。

2.2 側腦室不同劑量NPS注射對小鼠TWL的影響

注射NPS 5、10、30、60 min后各時間點小鼠TWL長于注射前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），隨著時間的延長，小鼠TWL也逐漸延長，并在注射后30 min達到最高點，之后逐漸降低;注射NPS5、10、30、60 min后各時間點，側腦室0.1 nmol/L NPS注射組、側腦室1 nmol/L NPS注射組、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠TWL均高于同時間點的Saline組，側腦室1 nmol/L NPS注射組小鼠TWL、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠TWL高于同時間點的側腦室0.1 nmol/L NPS注射組，10 nmol/L注射組小鼠TWL高于同時間點的側腦室1 nmol/L NPS注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 側腦室不同劑量NPS注射對小鼠熱板實驗HPTT的影響

注射NPS 5、10、30、60 min后各時間點小鼠HPTT長于注射前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），隨著時間的延長，小鼠HPTT也逐漸延長，并在注射后30 min達到最高點，之后逐漸降低;注射NPS 5、10、30、60 min后各時間點，側腦室0.1 nmol/L NPS注射組、側腦室1 nmol/L NPS注射組、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠HPTT均高于同時間點的Saline組，側腦室1 nmol/L NPS注射組小鼠、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠HPTT高于同時間點的側腦室0.1 nmol/L NPS注射組，10 nmol/L注射組小鼠HPTT高于同時間點的側腦室1 nmol/L NPS注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 側腦室不同劑量NPS注射對小鼠醋酸扭體實驗的影響

側腦室0.1 nmol/L NPS注射組、側腦室1 nmol/L NPS注射組、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠的扭體次數少于Saline組，側腦室1 nmol/L NPS注射組小鼠、側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠扭體次數少于側腦室0.1 nmol/L NPS注射組，側腦室10 nmol/L NPS注射組小鼠扭體次數少于1 nmol/L NPS注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。NPS隨著劑量從0.1 nmol/L到10 nmol/L，小鼠的疼痛抑制率逐漸增加。見表4。

3 討論

瑞芬太尼屬于高選擇性μ阿片受體激動劑，因其良好的鎮(zhèn)痛效果，預防拔管相關咳嗽，有效控制血流動力學波動，對患者肝腎功能及蘇醒影響輕微，已在神經外科、婦科各類疾病手術的麻醉中應用廣泛[14-15]。但使用瑞芬太尼藥物麻醉導致患者停藥后疼痛敏感度增加，痛覺閥值降低，皮膚疼痛耐受性降低，常引起熱痛覺過敏和機械性異常性疼痛，增加了術后疼痛管理難度和術后并發(fā)癥的發(fā)生率，嚴重影響患者術后身心健康和術后恢復[16]。

NRS為含有20個氨基酸的新型神經肽，NRS受體（NRSR）是具有典型的七次跨膜結構的蛋白偶聯(lián)受體。NRS及其受體系統(tǒng)在多種生理過程中發(fā)揮著重要作用，促進覺醒、各種精神疾病、藥物成癮、調節(jié)攝食、炎癥和免疫反應、應激反應和抗神經退行性疾病[16-17]。多項研究證實NPS通過受體產生明顯的鎮(zhèn)痛作用。中腦導水管周圍灰質、中縫核、側臂旁核是調節(jié)痛覺傳導的重要區(qū)域，NRS前體和受體在其中具有廣泛和高水平的表達。研究表明，NPS/NPSR系統(tǒng)調節(jié)神經元興奮性，從而影響疼痛行為[18]。NPS/NPSR神經肽系統(tǒng)通過作用于杏仁核信息傳遞相關通路參與調控疼痛伴發(fā)的厭惡、焦慮、恐懼等痛情緒行為，并在其中發(fā)揮了重要的作用[19]。神經肽S可以通過杏仁核NPSR上調劑量依賴性地逆轉慢性壓迫性神經損傷大鼠的疼痛行為[20]。ERK1/2信號通路參與外周和中樞痛覺信號的調制，通過轉錄或非轉錄途徑促進多種類型疼痛的形成和維持，是維持痛覺過敏的重要因素[21]。NPS激活受體以后可優(yōu)先作用于ERK1/2的磷酸化，降低ERK1/2的磷酸化程度。劑量的不同、藥物種類和給藥方式的不同、給藥后作用時間的不同會對痛敏程度、種類或范圍產生不同的影響。本文旨在討論NPS的濃度對于瑞芬太尼痛覺敏感小鼠的鎮(zhèn)痛效果有何影響。

作為常用的熱刺激致痛模型，熱板實驗和光照熱甩尾實驗評估機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏，評價了NPS在脊髓上水平的痛覺調節(jié)作用[22]。小鼠醋酸扭體實驗敏感、簡便，是判斷藥物是否具有鎮(zhèn)痛作用的化學方法。實驗結果顯示，側腦室注射NPS能延長熱板實驗和甩尾實驗小鼠的痛閾潛伏期，減少小鼠醋酸扭體反應的次數，高劑量組的TWL、應答潛伏期、扭體反應次數均優(yōu)于低劑量組，提示NPS提高瑞芬太尼誘發(fā)小鼠痛覺過敏的痛閾值，對痛覺過敏有一定的抑制作用，其作用強度與給藥劑量呈一定的量效關系，10 nmol/L NPS引起的鎮(zhèn)痛作用強于0.1 nmol/L NPS。

綜上所述，本實驗研究利用瑞芬太尼聯(lián)合切口痛構建了痛覺過敏模型，并以此模型為基礎進行后續(xù)實驗研究。觀察不同劑量NPS側腦室注射對瑞芬太尼所引起的痛覺過敏小鼠即時TWL、應答潛伏期、扭體反應次數的影響，是NPS劑量對痛閾影響的一次初步研究，NPS能夠有效抑制動物模型中的炎癥疼痛和神經病理性疼痛，緩解由于瑞芬太尼所引起的痛覺過敏，鎮(zhèn)痛作用強度與劑量呈一定的量效關系，為臨床用藥防治瑞芬太尼引起的OIH提供重要的參考依據。

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（收稿日期：2020-01-10）