柳新宇，石韶琦，武宇昊，李寧陽

（山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安 271018）

高級醇是指含有2 個碳原子以上的一類醇的統(tǒng)稱，沸點高，不溶于水，但溶于酒精，酒精度低時析出呈油狀，俗稱“雜醇油”[1]。這類物質是酒類發(fā)酵過程中的主要副產物，同時也是酒體主要的呈香物質，能提升酒的協(xié)調性和濃郁感，酒中約50%的香氣由這類物質提供。高級醇結構復雜，在人體中代謝緩慢，含量過高時會對人體造成一定的毒副作用，使人產生面紅耳赤、心跳加速、惡心嘔吐、頭暈頭痛等不良反應，也就是俗稱的“上頭”，嚴重時還會產生神經中毒、出現幻覺等嚴重的身體損害現象[2-3]，因此控制酒中高級醇含量有重要的意義。我國一些酒類生產廠家有較嚴格的高級醇限量標準，大多按照GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》中的有關規(guī)定，以每100 mL 飲料酒中高級醇含量不超過0.15 g（以戊醇計）或0.3 g（以異丁醇和異戊醇計）來評判酒中高級醇含量是否符合標準[4]。加入WTO 前，我國酒類的高級醇限量為2.0 g/L，但進口酒中的高級醇含量均高于此標準，為了使進口酒順利進入中國市場，我國不得不刪除了《蒸餾酒及其配制酒》GB 2757—2012 修訂版中關于高級醇限量的部分，但從把身體健康擺在首位的角度考慮，控制酒類產品中高級醇的含量具有一定的意義。

高級醇是釀酒過程中酵母合成細胞蛋白質時產生的副產物[5]，主要由兩種途徑合成，即生物合成途徑和糖代謝合成途徑，在釀酒過程中，可以通過改變發(fā)酵的工藝條件，來抑制高級醇的生成，本文主要總結了高級醇的形成路徑、測定方法、影響高級醇生成的因素及控制方法，為優(yōu)質酒類的工業(yè)化生產提供理論依據。

1 酒中高級醇的形成路徑

1.1 氨基酸降解代謝路徑

顧國賢[6]闡述了氨基酸降解生成高級醇的途徑，即發(fā)酵過程中氨基酸通過轉氨基作用形成α-酮酸，再經過脫羧、還原生成比原氨基酸少一個碳原子的高級醇[6-7]。特定的氨基酸會形成特定的高級醇，例如纈氨酸生成異丁醇，亮氨酸生成異戊醇，蘇氨酸生成異丙醇，異亮氨酸生成活性戊醇等[8]。

1.2 糖代謝合成路徑

顧國賢[6]闡述了由糖代謝通過丙酮酸合成高級醇的途徑，即糖代謝合成路徑。酵母通過糖類物質形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰羥酸合酶的作用下為氨基酸降解途徑提供骨架，在其合成代謝階段生成α-酮酸中間體，然后經脫羧、還原生成相應的高級醇[5,9]。

2 高級醇的測定方法

2.1 比色法

2.1.1 分光光度計法

分光光度計法是指在一定波長范圍內，利用被測物質的吸光度值對該物質進行定性或定量分析的一種方法。在高級醇含量的測定中，本法是利用高級醇（正丙醇除外）在濃硫酸的作用下脫水生成不飽和烴，進而與對二甲基苯甲醛發(fā)生反應生成橙黃色物質，該物質在520 nm波長下有最大吸收峰，且含量與吸收值的比值符合朗伯-比爾定律，故可用此法進行定量分析[10]。甄會英等[11]通過對顯色后的高級醇標準溶液和蘋果酒樣進行可見光區(qū)的全波長掃描，發(fā)現蘋果酒中的高級醇在477 nm 下有最大吸收峰；徐文華等[12]通過試驗發(fā)現高級醇在495 nm處有最大吸收峰。此方法操作簡便，成本低，但是存在顯色不穩(wěn)定、重現性差及線性關系不理想等問題[5]，對高級醇只能定量并不能定性分析，且由于高級醇種類復雜，各醇類顯色強度不同，故其結果比用氣相色譜測得的結果偏低[13]。每種酒中高級醇種類不同，會導致最大吸收峰不同，故常需要進行全波長掃描確定最佳波長，增加了操作的復雜性。

2.1.2 酶標儀比色法

酶標儀比色法是基于朗伯-比爾定律實現對目標化合物的定量分析的一種檢測方法，其工作原理、主要結構與光電比色計幾乎相同[14]。袁國億等[15]采用酶標儀法，測定濁米酒在408、450、500、520 nm 下1 h 內的吸光度值，分析得出其標準曲線R2受檢測波長和檢測時間的影響；再將其結果與氣相色譜所測結果進行比較，發(fā)現波長為520 nm，檢測時間為15 min 時標準偏差均小于0.001 5，變異系數小于3.1%，故酶標儀比色法重現性好、精密度高。但通過與氣相色譜法對比發(fā)現，酶標儀比色法結果會受高級醇含量的影響，且無法直接對酒中的高級醇進行單一定量。

2.2 氣相色譜法

氣相色譜法是一種以氣體為流動相的色譜法，分為內標法和外標法，具有選擇性高、效能高、檢測限低、分析速度快、應用范圍廣等優(yōu)點[16]，能對酒中的高級醇進行定性和定量分析，且結果較分光光度計法更準確，但氣相色譜操作復雜、前處理較多且機器運行及維修費用均較高，不適合在生產過程中進行快速檢測。其中外標法要求標準物與被測組分為同一種物質且濃度接近，并且需要在試驗操作過程中嚴格控制進樣量，以提高試驗結果的精確度[16]。內標法較外標法更準確，不受進樣量誤差的影響，但也存在內標物易在樣品里混合不均勻或與樣品組分發(fā)生反應、內標物純度易受影響等問題。黃建明等[17]采用外標法定量測定黃酒中的高級醇，試驗結果的相對標準偏差為0.01%～1.03%；甄會英等[18]在葡萄酒的測定中，試驗結果相對標準偏差為0.012 0%～1.070 7%；董永鑫等[19]在石榴葡萄酒的測定中，得出試驗結果的相對偏差為2.179 7%～3.212 5%，由此可知氣相色譜法精密度好、準確度高。

2.2.1 填充柱氣相色譜法

填充柱氣相色譜法以惰性氣體為載氣，根據不同物質在固定相中的停留時間不一致，并具有一定的保留時間，利用保留時間與標準品進行比較來定性，利用峰面積或峰高來定量[5]。李惠民等[20]采用401 微球填充柱對桑葚酒中的醇類物質進行分析，發(fā)現出峰時間間隔長且基線分離，對試樣分離效果好，但填充柱現在使用較少，多與儀器不適配，使用陳舊儀器，效果不佳且手動積分、計算繁瑣。

2.2.2 毛細管柱氣相色譜法

毛細管柱氣相色譜法滲透性好、柱效高且進樣量少，分析時間短。閔春艷[21]采用HP-INNOWax 毛細管氣相色譜柱測定鹿血酒中的高級醇，發(fā)現其分離良好，并且在一定濃度范圍內，線性關系良好，檢出限為1.6 μg/mL；彭松等[22]采用毛細管柱TG-WAXMS 測定棗酒中高級醇的含量，發(fā)現其標準偏差小于5%，最低檢出限為0.002～0.007 mg/mL，且操作簡單、分離效果好。

2.2.3 頂空固相微萃取-氣相色譜法

固相微萃取法是將待測樣品與熱力學平衡的蒸汽放置在一個密閉系統(tǒng)中進行，廣泛應用于揮發(fā)性及半揮發(fā)性有機物的分析，該方法無需有機溶劑、操作簡單。劉拉平等[23]采用固相微萃取方法分析獼猴桃酒中的香氣成分，該方法在縮短樣品處理時間的同時保留了大量的待測香氣組分，極大地提高了靈敏度與準確性。于洪梅[24]使用固相微萃取的方法測定啤酒中的高級醇，并比較了HP-5MS、TG-WAXMS、TG-35MS 三種色譜柱的分離效果，發(fā)現TG-WAXMS 色譜柱分離效果好，靈敏度高。

3 影響高級醇含量的因素及其控制方法

3.1 工藝條件

3.1.1 發(fā)酵溫度

酵母菌易受溫度的影響，在一定溫度范圍內，酵母菌的生長代謝能力隨發(fā)酵溫度的升高而增強，進而增強了高級醇生成相關轉化酶的活力，因此由氨基酸合成路徑和糖代謝合成路徑所產生的高級醇含量增加。相反若發(fā)酵溫度過低，酵母的生長代謝能力減弱，發(fā)酵周期延長，則會導致發(fā)酵不完全，影響最終酒類品質[25]。羅惠波等[25]在試驗中發(fā)現，高級醇含量在20 ℃以下時較低，在25 ℃以上時顯著增加；周揚等[26]在百香果酒釀造中發(fā)現20 ℃時高級醇含量最低；朱會霞[27]在葡萄酒釀造時發(fā)現，當溫度超過22 ℃會加快發(fā)酵速度，發(fā)酵提前終止，最終生成的酒類酒精度低、高級醇含量高。溫度較低時，發(fā)酵時間延長且發(fā)酵徹底，最終生成的酒類酒精度高、高級醇含量低，最終通過實驗得出發(fā)酵溫度控制在20 ℃較為合適。因此可知，發(fā)酵溫度對高級醇的生成有著顯著影響，適當降低發(fā)酵溫度有利于抑制高級醇的生成。

3.1.2 初始pH 值

酒液初始pH 值會直接影響酵母菌的活性程度，從而影響了酵母的代謝活動，同時酵母菌的活性決定了酒液的發(fā)酵時間長短、發(fā)酵程度等，進而影響了酒中高級醇的生成。羅惠波等[25]在試驗中發(fā)現，高級醇的含量與桑葚汁的初始pH 值成正比。當初始pH 值>4.0 時，高級醇的含量明顯增加；pH 值<3.5 時，高級醇的含量明顯降低；于濤[28]在蘋果酒的釀造中發(fā)現，當pH≥3.0 時，高級醇的含量與初始pH 值成正比；當初始pH 值≤3.0 時，高級醇和初始pH 值成反比，在pH 為2.5 時，高級醇的生成量最低，為79.33 mg/L；周揚等[26]在試驗中發(fā)現，高酸組的百香果酒高級醇含量更低。由此可知，降低酒液初始pH 值，有利于抑制高級醇的生成，究其原因可能是酸度影響果膠酶的活性，從而間接抑制了高級醇的生成[29-31]，因此，適當降低pH 值能有效抑制高級醇的生成，減少酒中高級醇的含量。

3.1.3 起始糖度

釀酒是利用糖和酵母作用產生二氧化碳和酒精，每種果蔬固有糖度不同，故需要調節(jié)合適的糖度使發(fā)酵順利且達到目標所需的酒精度。高級醇合成的兩條路徑屬于競爭抑制關系，糖量過多，會抑制氨基酸合成路徑，促進了糖代謝路徑生成高級醇[28]，從而增加了高級醇的含量，故控制初始糖度對高級醇的生成具有重要意義。于濤[28]在蘋果酒的釀造中發(fā)現高級醇含量隨糖度的增大而增大，當糖度≤16%時，高級醇的生成量較少；楊東升等[31]在香蕉酒的釀造中，發(fā)現起始糖度對甲醇含量影響較小，但對異丁醇和異戊醇含量影響顯著，高級醇含量在起始糖度為22%時最低。張麗芝[32]在棗酒的釀造中通過比較添加濃縮棗汁、葡萄糖和蔗糖發(fā)酵后生成的高級醇含量，發(fā)現添加濃縮棗汁的酒液高級醇生成量最低。由此可知，起始糖度對酒中高級醇的含量有著一定的影響，降低外源糖量添加，利用果蔬自身的糖來發(fā)酵能有效降低高級醇含量。

3.2 酵母菌種類

果蔬發(fā)酵酒均在酵母菌的作用下進行發(fā)酵，一般采用純種發(fā)酵或自然發(fā)酵的方法。目前我國沒有果酒專用酵母，大多果酒的釀造使用的是釀酒酵母，也有部分人對酵母進行篩選，進而獲取更合適的酵母種類，通過相關試驗，發(fā)現酵母種類對酒中高級醇的含量有很大影響。鄒波等[33]在棗酒的釀造中通過接種4 種不同的酵母發(fā)現，不同酵母發(fā)酵的棗酒高級醇含量存在明顯差異，其中活性干酵母BO213 高級醇生成量最低；蔣成等[34]在無花果酒的釀造中也獲得了同樣的結果。因此，不同種類的酵母能改變酒中高級醇的含量，選擇合適的酵母能有效減少高級醇的產生。

3.3 酵母接種量

在一定范圍內，酵母的接種量與發(fā)酵時間、酒精度成正比。增加酵母的接種量可以抑制細胞的增殖從而加快發(fā)酵速度，氨基酸代謝活動會隨著酵母菌的生長代謝受到抑制而減弱，從而減少了氨基酸合成路徑生成的高級醇含量[29]。羅惠波等[25]在試驗中發(fā)現，高級醇的含量隨酵母接種量的增加而增加，高級醇含量在酵母菌接種量為4.0×106cell/mL 時最高，然后隨酵母接種量的增加而降低；于濤[28]在蘋果酒釀造中發(fā)現，高級醇含量在酵母接種量9%時最低，為169.74 mg/L；朱會霞[27]在試驗中發(fā)現，增加酵母菌接種量可降低高級醇含量，在接種量為3.5×107cfu 時高級醇含量最低，但是繼續(xù)增大酵母接種量高級醇含量不增反減[27]。由此可知，適當的增加酵母接種量可在一定程度上降低高級醇含量。

3.4 可同化氮素

可同化氮素是酵母在酒精發(fā)酵中優(yōu)先利用的氮源，例如銨鹽、尿素、α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽等，添加可同化氮素對酒中高級醇的生成有顯著影響[35]。傅紅雪[36]在藍莓酒的釀制中，加入345 mg/L 磷酸氫銨和0.336 mg/L 硫胺素，試驗結果表明高級醇含量下降了106.36 mg/L。VIDAL 等[37]發(fā)現，在可同化氮素含量低的甘蔗汁中添加一定量的銨態(tài)氮會降低高級醇的含量。孫時光等[38]在桑葚酒的釀制中，加入磷酸二氫銨，高級醇含量下降7.64%；加入丙氨酸，高級醇含量下降6.73%；加入精氨酸，高級醇含量下降6.33%。張斌等[39]在荔枝酒的釀制中發(fā)現，當加入100 mg/L 谷氨酸時，高級醇含量最低。此外，楊生智等[40]在小曲白酒中添加0.4%碳酸氫銨，高級醇含量下降了19%。由此可知，可同化氮素對酒中高級醇的含量有較大影響，合理控制可同化氮素能有效抑制高級醇的生成，且此類物質能被酵母有效利用，可成為未來工業(yè)化生產酒類時的氮源補償劑。

3.5 其他添加物

在釀酒過程中，除了主要原料，通常還會添加一些其他物質（如酶制劑）一同進行發(fā)酵，促進果蔬細胞壁的破碎，增加出汁量。同時也會加入SO2進行抑菌，但是硫含量對高級醇的生成也有一定的影響。孫時光等[38]在桑葚酒的實驗中發(fā)現，發(fā)酵1 d 后加入糖化酶、果膠酶、纖維素酶三種制劑，均能有效抑制桑椹果酒中高級醇的生成，分別使高級醇含量下降了5.95%、6.74%、9.01%。同時他還發(fā)現，加入20 mg/L K+會使高級醇含量下降8.66%，加入40 mg/L Ca2+使高級醇含量下降4.42%；朱會霞[27]在實驗中發(fā)現，高級醇的含量隨SO2添加濃度的增加而降低，在添加100 mg/L SO2時高級醇含量最低（176.18 mg/L）。由此可知，外源添加物對酒中高級醇的生成有一定影響。

3.6 催陳處理

催陳技術是指借用外力來加快老熟過程，以調節(jié)醇酸酯的比例，因此可以影響高級醇的含量。鄭新華[4]通過對半成品青梅酒進行超聲、微波、臭氧處理后，發(fā)現高級醇含量均有所下降。實驗得出半成品青梅酒在45 kHz、360 W 頻率下超聲30 min 后，高級醇含量降低19.63%；用3.6 mg/L 臭氧作用8 min 后，高級醇含量下降了25.34%；在微波中低檔火力處理2 min 后，高級醇含量下降了24.93%。因此，對半成品酒采取一定的物理技術處理進行催陳，亦能有效降低酒中高級醇的含量。

4 展望

綜上所述，酒中高級醇的生成主要由氨基酸分解代謝和糖代謝產生，兩條合成路徑在發(fā)酵過程中是同時存在的，降低高級醇含量主要從抑制這兩條路徑入手。通過控制工藝條件，例如發(fā)酵溫度、初始pH 值、起始糖度等來降低酒中高級醇含量，亦可以通過選擇適宜的菌種及接種量、合適的外源添加物，或采取一定的物理技術進行催陳處理等，均有利于降低酒中高級醇的含量。未來，可以主要把這些方法作為降低酒中高級醇含量的主要研究方向。

果酒釀造在我國有悠久的歷史，但是果酒中高級醇的含量一直沒有明確的限制，故研究果酒中高級醇的含量對提高果酒品質有重要意義。由于果酒的原材料種類廣泛，自身的含糖量及營養(yǎng)物質和需要控制的方面不同，致使果酒在釀造工藝上有所不同。果酒目前沒有專用酵母，對于果酒中高級醇的控制方法也尚未明確，形成統(tǒng)一標準，故在未來果蔬發(fā)酵酒的生產發(fā)展中，需要根據原材料的不同，在保證酒感官良好的情況下根據實際情況選擇相應的控制措施，從而制作出高品質、低高級醇含量的優(yōu)質果蔬發(fā)酵酒。