周弟彌 甘露 周成芳 陳琳

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（湖南衡陽421001）

癲癇是由于大腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作的腦功能失調(diào)綜合征。癲癇的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前的抗癲癇藥物僅控制癲癇癥狀，而不影響疾病的病理過程［1］，并且約有三分之一的患者為難治性癲癇［2］。因而探討癲癇的發(fā)病機(jī)制，尋找新的抗癲癇藥物有著重要意義。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of repamycin，mTOR）是一種與PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶［3］。研究報(bào)道，mTOR不僅可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的多種生理過程，還參與了突觸結(jié)構(gòu)和可塑性，這可能導(dǎo)致在病理?xiàng)l件下異常的神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)［4-5］。筆者推測(cè)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路很可能參與了癲癇的病理過程。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，是促炎癥因子和氧化應(yīng)激的重要來源。研究［6］表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可激活mTOR信號(hào)通路，引起神經(jīng)元樹突狀損傷，并可能引起隨后癲癇的病程［7］?；谝陨显?，本研究選取了小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象。

雷帕霉素（Repamycin，RAPA）是一種mTOR抑制劑，研究［8-9］表明RAPA對(duì)mTOR的抑制作用可減少癲癇發(fā)作的強(qiáng)度和頻率，但是對(duì)于RAPA是否可以用于癲癇的治療及其作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠癲癇模型，并予RAPA干預(yù)治療，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化，PI3K/Akt/mTOR及NF?kB/IL?6信號(hào)通路的表達(dá)變化，探討RAPA在癲癇后腦損傷中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑KA和RAPA（美國(guó)Sigma?Aldrich），BCA蛋白定量試劑盒（中國(guó)碧云天公司），PVDF膜（Millipore公司），ECL化學(xué)發(fā)光劑（Santa Cruz公司），Trizol試劑（GIBCO BRL公司），PI3K、Akt、mTOR、NF?kB、IL?6及β?actin小鼠抗大鼠抗體（Ab?cam公司），活化小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1（美國(guó)Cell Signaling Technology），qRT?PCR及cDNA合成試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific）。

1.2 癲癇模型的建立及分組選取40只6 ～8周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組，Control組、KA組、KA+ RAPA 5 mg/kg組及KA+RAPA 10 mg/kg組，每組10只，通過腹腔注射海人酸KA 15 mg/kg制作大鼠癲癇模型，參考Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)Ⅳ～V級(jí)癇性發(fā)作為造模成功［10］；KA誘導(dǎo)癲癇前2 h腹腔注射RAPA（5 mg/kg或10 mg/kg）預(yù)治療，Control組僅注射生理鹽水。大鼠癲癇后24 h斷頭取腦，收集大腦皮層組織，保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫組化染色觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化大鼠癲癇后24 h先用10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉，斷頭，沿中線切開頭皮并沿矢狀縫剪開顱骨，取出大腦，分離大腦皮層組織，浸入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后，在皮質(zhì)區(qū)連續(xù)切片，片厚5 μm。石蠟切片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，脫蠟至水，用pH 7.4的PBS沖洗三次。將脫蠟水化后的組織切片放入沸騰的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，10 min后從緩沖液中取出玻片，用PBS沖洗3次。每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗后每張切片加小鼠抗大鼠一抗Iba1（1∶100），室溫下孵育2 h。PBS沖洗后每張切片加兔抗小鼠二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗后每張切片加1滴新鮮配制的DAB液顯色，顯微鏡下觀察切片染色情況。光鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)面積相同的高倍視野（積相同的倍），肉眼計(jì)數(shù)每個(gè)視野Iba1染色陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值即為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)。

1.4 Western blot 檢測(cè)PI3K、Akt、mTOR、NFkB、IL-6 蛋白含量大鼠癲癇后24 h斷頭取腦，分離大腦皮質(zhì)，用玻璃棒將皮質(zhì)勻漿至無肉眼可見碎片。加入RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑，再次勻漿直到組織充分破碎。4 ℃下12 000 r/min離心10 min，離心的上清液即是總蛋白。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按說明書配制10%分離膠和濃縮膠并放至電泳槽內(nèi)。樣品與5×Loading buf?fer按體積4∶1混合，98 ℃煮沸5 min；上樣時(shí)蛋白總量保持一致。向電泳槽中先加入電泳液，恒壓電泳，蛋白從濃縮膠移動(dòng)到分離膠；電泳結(jié)束后取出電泳架，切去多余的分離膠及濃縮膠；在轉(zhuǎn)膜槽中加入轉(zhuǎn)膜液，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用PBS浸泡PVDF膜，后用5%脫脂牛奶封閉，室溫下水平搖床封閉2 h；棄去封閉液，敷一抗（小鼠抗大鼠）：PI3K（1∶2 000）、Akt、（1∶1 000）、mTOR（1∶2 000）、NF?kB（1∶1 000）、IL?6（1∶5 000），4 ℃孵育過夜；用PBS洗膜后敷二抗（兔抗小鼠1∶2 000），在室溫下孵育2 h，用PBS清洗10 min。等體積混合ECL發(fā)光液A和B，將PVDF膜浸泡在發(fā)光液中；約5 min后用顯影儀掃描膠片；用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.5 qRT-PCR方法檢測(cè)PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)量取分離的大腦皮層組織，加入Trizol裂解液和氯仿，經(jīng)過分離、沉淀、干燥等步驟得到總RNA。按照Thermo Scientific cDNA合成試劑盒的說明，加入樣本RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、上游引物和下游引物合成模板cDNA。按照qRT?PCR試劑盒的要求，加入cDNA、上游引物和下游引物在PCR儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增。qRT?PCR循環(huán)擴(kuò)增條件如下：PI3K，變性：95 ℃，45 s；退火：58 ℃，45 s；延伸：72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；Akt，變性：95 ℃，45 s；退火：52 ℃，1 min；延伸：70 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；mTOR，變性：95 ℃，45 s；退火：56 ℃，45 s；延伸：72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；GAPDH（內(nèi)參），變性：95 ℃，30 s；退火：58 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s；28個(gè)循環(huán)；DNA擴(kuò)增結(jié)束后4 ℃冷卻，分析數(shù)據(jù)。qRT?PCR引物見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0軟件。兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析（ANOVA）。P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT?PCR 引物核苷酸序列Tab.1 qRT?PCR primer nucleotide sequence

2 結(jié)果

2.1 癲癇模型成功率共30只大鼠注射了KA，結(jié)果KA組有2只由于驚厥持續(xù)狀態(tài)而導(dǎo)致死亡，KA+RAPA 5 mg/kg組及KA+RAPA 10 mg/kg組分別有1只未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，造模成功率86.7%。最終每組選取8只大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RAPA減少小膠質(zhì)細(xì)胞的活化Iba1免疫組化觀察大鼠癲癇后24 h小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況（圖1），活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可被染成褐色或棕褐色。Control組背景為淡藍(lán)色，以靜止小膠質(zhì)細(xì)胞為主，胞體較小，有著細(xì)長(zhǎng)的放射狀分支，偶爾可見散在的活化小膠質(zhì)細(xì)胞（圖1A）。KA組背景呈黃褐色，細(xì)胞胞體變圓、體積變大，突起變短或消失，細(xì)胞呈阿米巴狀或圓形（圖1B）；與Control組比較，小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量顯著增加（P ＜0.05，圖2）。KA+RAPA 5 mg/kg及KA+RAPA 10 mg/kg組背景顏色變淺，細(xì)胞體積較前變?。▓D1C、D）；與KA組比較，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少（P ＜0.05，圖2）。免疫組化染色提示RAPA可以減少癲癇后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，對(duì)腦損傷有保護(hù)作用。

圖1 免疫組化觀察癲癇后24 h 腦皮層組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化（×400）Fig.1 Microglia activation was observed by Immunohistochemistry in cerebral cortex tissues 24 hours after epilepsy（×400）

圖2 Iba1 免疫組化染色并計(jì)數(shù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)Fig.2 The number of activated microglia were counted by Iba1 immunohistochemical staining

2.3 RAPA減少PI3K、Akt、mTOR蛋白水平為了探討RAPA對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，Western bolt測(cè)定了大鼠癲癇后24 h大腦皮層PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平（圖3A）。將條帶進(jìn)行光密度檢測(cè)進(jìn)一步得出了蛋白的相對(duì)表達(dá)量（圖3B）。由圖可以看出，癲癇后KA組PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)較Control組顯著增加（P ＜0.05），RAPA治療組PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)顯著低于和KA組（P ＜0.05）；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，KA+RAPA10 mg/kg組顯著低于KA+RAPA5 mg/kg組mTOR蛋白表達(dá)（P ＜0.05）。

Western bolt結(jié)果顯示，癲癇后KA組PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而RAPA能抑制KA誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路改變；其中對(duì)mTOR蛋白表達(dá)抑制作用，KA+RAPA 10 mg/kg組顯著強(qiáng)于KA+RAPA 5 mg/kg組。

圖3 Western blot 檢測(cè)癲癇后24 h 大腦皮質(zhì)PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達(dá)量Fig.3 The protein expression of PI3K，Akt and mTOR were detected by Western blot in the cerebral cortex 24 h after epilepsy

2.4 RAPA減少PI3K、Akt、mTOR mRNA水平為了進(jìn)一步探討RAPA對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，qRT?PCR測(cè)定了大鼠癲癇后24 h大腦皮層PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平（圖4）。具體結(jié)果如下：（1）癲癇后KA組PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)顯著增加（P ＜0.05），而10 mg/kg RAPA治療組能抑制三者表達(dá)增加（P ＜0.05）；其中5 mg/kg RAPA治療組能抑制Akt mRNA表達(dá)增加（P ＜0.05）；（2）進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，KA+RAPA 10 mg/kg組顯著低于KA+RA?PA 5 mg/kg組PI3K、mTOR mRNA表達(dá)（P ＜0.05）。

qRT?PCR結(jié)果顯示癲癇后KA組PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，而RAPA能抑制KA誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路改變。RAPA對(duì)PI3K和mTOR的抑制作用與劑量有關(guān)。

2.5 RAPA 抑制NF-kB/IL-6 炎癥通路為了探討RAPA對(duì)NF?kB/IL?6信號(hào)通路的影響，Western blot測(cè)定了大鼠癲癇后24 h大腦皮層NF?κB、IL?6蛋白表達(dá)水平（圖5A）。將蛋白條帶進(jìn)行光密度分析（圖5B），可以發(fā)現(xiàn)癲癇后KA組NF?κB、IL?6蛋白表達(dá)較Control組顯著增加（P ＜0.05），RAPA（5 mg/kg或10 mg/kg）治療后顯著降低了兩者的表達(dá)水平（P ＜0.05）；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，KA+RAPA 10 mg/kg組顯著低于KA+RAPA 5 mg/kg組IL?6蛋白表達(dá)（P ＜0.05）。

圖4 qPCR 檢測(cè)癲癇后24 h 大腦皮質(zhì)PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達(dá)量Fig.4 The mRNA expression of PI3K，Akt and mTOR were detected by qPCR in the cerebral cortex 24 h after epilepsy

該結(jié)果提示癲癇后可以激活NF?kB/IL?6炎癥信號(hào)通路，而RAPA能抑制KA誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路改變；其中對(duì)炎癥因子IL?6抑制作用與劑量有關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中RAPA 10 mg/kg效果更佳。

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它的病理特征包括小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，神經(jīng)元數(shù)量的減少甚至消失，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之間的失衡等［11］。現(xiàn)有的抗癲癇藥物主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體（如γ?氨基丁酸、谷氨酸和乙酰膽堿受體）或離子通道從而抑制神經(jīng)元興奮性［12-13］，而不能從癲癇的發(fā)生機(jī)制去控制發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)選擇了海人酸KA誘導(dǎo)癲癇模型，因?yàn)樵撃Ｐ皖愃朴谌祟愶D葉癲癇模型，且該模型穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

圖5 Western blot 檢測(cè)癲癇后24 h 大腦皮質(zhì)NF?κB、IL?6 蛋白表達(dá)水平Fig.5 The protein expression of NF?κB and IL?6 were detected by Western blot in the cerebral cortex 24 h after epilepsy

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抗原呈遞細(xì)胞［14］。在正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，受到異常刺激時(shí)可被激活，迅速增殖并遷移到受傷的部位，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥以及誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［15］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖可能是減輕癲癇后損傷的有效措施。本實(shí)驗(yàn)用KA誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，免疫組化結(jié)果顯示KA組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增高，證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化參與了癲癇的病理過程。具體機(jī)制考慮活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種免疫效應(yīng)分子，例如白介素IL?1、IL?6、IL?8、腫瘤壞死因子和氧自由基等［16］，會(huì)破壞神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部或廣泛損傷，可引起癲癇發(fā)作并加重癲癇后腦損傷［17］。

磷脂酰肌醇?3激酶（phosphatidylinositide 3?ki?nases，PI3K），是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物。Akt是PI3K下游的作用靶點(diǎn)，可通過磷酸化底物調(diào)控凋亡、蛋白合成、代謝和細(xì)胞周期［18-19］。mTOR是PI3K相關(guān)激酶家族的成員，也是PI3K/Akt信號(hào)的下游因子。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路通過抑制細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用，包括蛋白質(zhì)合成、腫瘤生長(zhǎng)和血管生成［20］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大鼠癲癇后大腦皮層PI3K/Akt信號(hào)通路變化，發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt、mTOR蛋白和mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，提示PI3K/Akt信號(hào)通路參與了癲癇的病理過程。考慮原因如下：（1）mTOR過度激活能導(dǎo)致大腦皮質(zhì)畸形和癲癇表型的基因表達(dá)［21］；（2）PI3K/Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞的合成與增殖，促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的合成，從而加劇了免疫炎癥反應(yīng)；（3）PI3K/Akt信號(hào)激活缺氧誘導(dǎo)因子，同時(shí)調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT），導(dǎo)致神經(jīng)元過度激活［22］。但也有報(bào)道指出，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)癲癇有保護(hù)作用，這是因?yàn)樵撏房梢詼p少神經(jīng)元的凋亡和缺血性腦損傷［23］，同時(shí)可能由于mTOR在細(xì)胞內(nèi)存在mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合體，可調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程有關(guān)。

NF?κB是細(xì)胞質(zhì)中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可啟動(dòng)或抑制有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。白介素?6（IL?6）是一種炎癥細(xì)胞因子，受到NF?κB的調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體的炎癥、免疫及應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用［24］。Western blot測(cè)定了大鼠癲癇后大腦皮層NF?κB、IL?6蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，提示NF?κB信號(hào)通路參與了癲癇的病理過程。主要病理機(jī)制可能是機(jī)體受到刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型活化狀態(tài)，激活了NF?κB炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致IL?6、IL?1β和TNF?α等炎癥細(xì)胞因子水平明顯增高以及誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡［25］；同時(shí)NF?κB可進(jìn)一步激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，這種細(xì)胞因子的釋放能夠增加局部神經(jīng)元興奮性，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)作［26］。

雷帕霉素RAPA是mTOR特異性抑制劑，既往的研究中，RAPA可能通過調(diào)節(jié)特定離子通道如鉀離子通道或控制神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)而間接影響神經(jīng)元興奮性［27］。在本實(shí)驗(yàn)中，KA誘導(dǎo)大鼠癲癇，觀察到PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活、小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加以及NF?κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)增加，而RAPA干預(yù)治療對(duì)這些病理過程有明顯的抑制作用，表明RAPA可以減少通過減少癲癇的病理過程從而起到腦損傷的保護(hù)作用。同時(shí)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，RAPA在劑量為10 mg/kg比5 mg/kg治療效果更好，說明RAPA對(duì)腦損傷的保護(hù)作用可能有劑量依賴性。

RAPA目前臨床上主要用于器官移植的抗排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病及抗腫瘤的治療［28］，在癲癇方面的研究還很有限。在本研究中，不僅證實(shí)了RAPA對(duì)癲癇后腦損傷有保護(hù)作用，同時(shí)也從病理學(xué)機(jī)制上做了進(jìn)一步闡述，為臨床上難治性癲癇藥物的開發(fā)提供了新的思路。由于實(shí)驗(yàn)的局限性，未能對(duì)RAPA更多的干預(yù)劑量進(jìn)行研究。在今后的試驗(yàn)中，將進(jìn)一步增加藥物對(duì)照組，以探討RAPA最合適治療劑量；同時(shí)將對(duì)癲癇后行為學(xué)的改變進(jìn)行研究，為臨床治療提供更多的理論基礎(chǔ)。

RAPA可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化，同時(shí)通過抑制NF?κB信號(hào)通路減少了炎癥因子的表達(dá)，表明RAPA對(duì)癲癇后腦損傷有潛在的保護(hù)作用，為癲癇和其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供了新的策略。