劉 琳，姜世敏，卓 莉，徐 波，許世清，向 青，高紅梅，李文歌★

（1.中日友好醫(yī)院 腎病科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 臨床研究所，北京 100029）

腺苷和腺苷A1 受體（adenosine A1 receptor，A1AR）介導了管球反饋（tubular golmerular feedback，TGF），A1AR 的阻斷能夠消除TGF。但近年來進一步的研究顯示，選擇性阻斷入球小動脈平滑肌上的A1AR 仍有約36%的TGF 現(xiàn)象存在，提示腎小球其他細胞表達的A1AR 也在參與TGF調節(jié)[1]。系膜細胞作為腎小球毛細血管襻的支撐，被血管活性物質刺激后可發(fā)生收縮，參與調節(jié)腎小球濾過率，但其A1AR 表達情況以及A1AR 究竟是否參與系膜細胞收縮的調節(jié)，尚缺乏確切的證據(jù)。本研究在原代腎小球系膜細胞中觀察A1AR 的表達情況，使用腺苷、A1AR 激動劑及抑制劑刺激系膜細胞，動態(tài)觀察細胞收縮能力的變化，為系膜細胞在TGF、腎小球濾過率調節(jié)中的作用及機制提供更多依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級野生型6～8 周雄性C57BL/6 小鼠購自北京維通利華公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、2.5g/L 胰蛋白酶-EDTA、DMEM 培養(yǎng)基（含葡萄糖5.5mmol/L）購于GIBCO 公司。Ⅰ型膠原蛋白購于Corning 公司（354236），Ⅳ型膠原酶購于Gibco 公司（17104-19）。CCK-8 試劑盒購于上海東仁化學科技有限公司。抗小鼠desmin 抗體購于Proteintech 公司 （16520-1-AP），抗小鼠synaptopodin 抗體購于Progen 公司 （61094），抗小鼠A1AR 受體抗體購于Abcam 公 司（ab82477）。FITC 標記的山羊抗小鼠二抗、辣根標記的山羊抗小鼠二抗購于北京中杉金橋公司。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、腺苷、N6-cyclohexyladenosine（CHA）、8-Cyclopentyl-1，3-dipropylxanthine （DPCPX） 購于Sigma 公司。

1.2 原代小鼠系膜細胞的提取、培養(yǎng)與鑒定

參照文獻[2]中的分樣篩法，斷頸處死3 只C57BL/6 小鼠，于75%酒精浸泡1min。無菌條件下剖開腹部取出兩側腎臟，用冰冷的無菌PBS 清洗2 遍。剪下腎皮質，放入少量Ⅳ膠原酶中（1mg每個腎臟），將皮質剪成碎末，使用研缽一定程度的研磨后轉移至50ml 離心管中，37℃水浴消化40min 后加適量含血清的培養(yǎng)基終止消化。收集腎組織混懸液體，用大量PBS 充分沖洗同時使其先后通過孔徑為70μm 和40μm 篩網，使用無菌吸管收集40μm 篩網上的腎小球懸液，移入15ml離心管。以1000r/min 離心5min，棄上清，加入含20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基制成腎小球懸液，隨后轉移入1 型膠原蛋白包被過的無菌培養(yǎng)皿，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每3d 換液（3d 內避免移動培養(yǎng)皿），7～10d 后腎小球明顯縮小甚至消失，爬出的細胞長滿瓶皿后進行傳代，前三代使用20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，此后使用15%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。5 代后細胞形態(tài)一致性良好，腎小球完全消失，經免疫熒光染色Desmin（+）、synaptopodin（-）鑒定為系膜細胞，8 代以內的系膜細胞用于實驗。

1.3 CCK-8 法檢測腺苷刺激系膜細胞生長曲線

以2000 個細胞/100μl/孔鋪96 孔板，每個濃度3 個復孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后吸出孔內培養(yǎng)液，加入100μl 無血清培養(yǎng)基和10μl CCK-8/孔，孵育2h 后于酶標儀檢測OD 值，此點設置為0 點。向培養(yǎng)板加入10μl 不同濃度的腺 苷，使 其 分 別 達 到0.1μM、1μM、10μM 及100μM 濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h 使用上述方法加入CCK-8 試劑進行檢測，并與不加腺苷的對照組進行對比。

1.4 細胞免疫熒光染色

以1×104個細胞/孔鋪24 孔板，待細胞生長至60%～80%融合時4%多聚甲醛固定液室溫固定15min。PBS 漂洗，室溫下用0.5%Triton/PBS 透化處理10min，3%BSA/PBS 37℃封閉30min。在細胞爬片上分別滴加約50μl 1：200 稀釋的desmin抗體、synaptopodin 抗體或A1AR 抗體，密封于濕盒中，37℃孵育30min，避免震蕩。漂洗后在細胞爬片上加約50μl 1：50 稀釋的FITC 標記的驢抗兔熒光二抗，37℃孵育30min。漂洗后加入1：2000稀釋的DAPI，室溫孵育5min。漂洗后取10μl 封片劑滴在載玻片上，將細胞爬片有細胞的一面朝下封片，盡快在激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.5 Western blot

使用SDS 裂解液提取細胞總蛋白，每孔加入20μg 細胞總蛋白進行10%SDS-PAGEs 凝膠電泳分離，之后將蛋白轉印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加入抗1：500 稀釋的A1AR 抗體、1：1000 稀釋的β-actin 抗體，4℃過夜。TBST洗滌后加入HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育1h。洗膜后加入ECL 化學發(fā)光劑，于凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.6 細胞收縮功能的檢測

以5×104個細胞/孔將小鼠腎小球系膜細胞鋪于直徑為35mm 的免疫熒光專用培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后（約4h），將細胞在不同條件下培養(yǎng)。正常對照組使用普通DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；腺苷刺激組在DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為100μmol/L的腺苷；A1AR 激動劑刺激組，DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L 的A1AR 激動劑CHA；A1AR 抑制劑刺激組，DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L 的A1AR 抑制劑DPCPX。培養(yǎng)48h后使用Olympus IX83 活細胞顯微成像系統(tǒng)觀察細胞收縮情況。將培養(yǎng)皿放入操作體系中，0 點拍照后原位更換為含1μM AngⅡ的培養(yǎng)基，關閉培養(yǎng)體系，維持溫度37℃，5% CO2濃度的條件，在40 倍物鏡同一視野下，連續(xù)觀察30min，每2min拍照1 張，最后制作為動態(tài)影像。應用Image J 軟件計算每個細胞在0 時和30min 時的面積變化絕對值，對比各組之間的差異。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以χ±s 表示，先行單因素方差分析，方差齊性檢驗后，組間比較采用LSD-t 檢驗。

2 結果

2.1 原代系膜細胞的培養(yǎng)及鑒定

提取出的腎小球使用20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下孵育3d 后，相差顯微鏡下觀察可見腎小球內有細胞爬出（圖1A，見封二）。10d 后腎小球明顯縮小甚至消失，爬出的細胞可長滿瓶皿（圖1B，見封二）。第一次傳代后每3d 傳代1 次，傳至第5 代，細胞一致性良好，腎小球完全消失。此時行Desmin 染色為陽性（圖2，見封二），Synaptopodin 染色陰性，鑒定為系膜細胞。

圖1 小鼠原代系膜細胞生長過程（×100）。A.提取小鼠腎小球并培養(yǎng)3d后細胞從腎小球內爬出；B.提取小鼠腎小球培養(yǎng)10d后細胞長滿瓶皿。圖2 小鼠系膜細胞desmin免疫熒光染色（×400）。圖3 免疫熒光染色觀察到A1AR于系膜細胞胞漿內呈顆粒狀表達（×200），箭頭所示為A1AR陽性區(qū)域。A.綠色為FITC標記陽性區(qū)域；B.藍色為DAPI染色陽性區(qū)域。

2.2 腺苷對系膜細胞生長的影響

表1 示，使用CCK-8 試劑盒檢測細胞生長，觀察到0.1μM、1μM、10μM 及100μM 濃度的腺苷在24h、48h、72h 內，與不加腺苷的正常對照組相比，細胞數(shù)量均無明顯差異，提示腺苷對小鼠原代系膜細胞的增殖無明顯影響（均P＞0.05）。

圖4 Western blot 方法驗證系膜細胞存在A1AR 表達

圖6 AngⅡ刺激前后系膜細胞面積變化

2.3 小鼠系膜細胞A1AR 表達情況

細胞免疫熒光染色顯示，A1AR 在小鼠腎小球系膜細胞中存在表達，并呈現(xiàn)細小顆粒狀分布于胞漿中（圖3，見封二）。同時，使用western blot技術也觀察到原代小鼠腎小球系膜細胞能夠表達A1AR，在36KD 水平可見深色條帶（圖4）。

表1 不同濃度腺苷刺激系膜細胞在各時間點的OD 值

2.4 腺苷及A1AR 對系膜細胞收縮能力的影響

如圖5（見封二）、圖6 所示，100μmol/L 腺苷刺激48h 后，小鼠系膜細胞在AngⅡ刺激下收縮明顯更為劇烈，30min 后細胞面積顯著縮小，面積變化值達到8947±3658pixels，顯著大于正常對照組4268±2131pixels（P＜0.05），面積變化的幅度達到正常對照組2 倍以上。1μmol/L A1AR 激動劑CHA 刺激48h 后，系膜細胞顯現(xiàn)出類似于腺苷的對AngⅡ的顯著收縮反應，面積變化值為9813±1640pixels，同樣顯著大于正常對照組（P＜0.05），與腺苷刺激組接近。使用1μmol/L A1AR 抑制劑DPCPX 刺激48h 后，系膜細胞對AngⅡ的收縮反應減弱，僅為2613±2546 pixels，顯著弱于腺苷及CHA 刺激組（P＜0.05），也低于正常對照組，但差異不具有顯著性。

圖5 AngⅡ刺激前后系膜細胞面積變化。A、B、C、D：AngⅡ刺激前；E、F、G、H：AngⅡ刺激30min后；A、E：正常對照組（NC）；B、F：腺苷刺激組；C、G：A1AR激動劑組（CHA）；D、H：A1AR抑制劑組（DPCPX）。腺苷和CHA組AngⅡ刺激前后面積變化顯著大于NC組；DPCPX組AngⅡ刺激前后面積變化不顯著，明顯弱于腺苷和CHA組。

3 討論

3.1 腺苷及A1AR 在腎臟血流動力學調節(jié)中的作用

近年來，腺苷及其受體在血管舒縮調節(jié)中的關鍵作用備受關注。腺苷是由糖苷鍵連接腺嘌呤和核糖而成的嘌呤核苷，在生理情況下以低濃度廣泛分布于身體各種組織的細胞間液中。低氧、缺血、炎癥、應激等刺激條件下，腺苷大量生成，目前大多研究認為在以上病理生理過程中腺苷可起到一定的保護作用[3，4]。腺苷通過腺苷受體發(fā)揮作用，目前已知的腺苷受體 （adenosine receptor，AR）有3 大類，包括A1AR、A2AR、A3AR，其中A2AR 又分為2 個亞類：A2aAR、A2bAR、均為G 蛋白耦聯(lián)受體。在大多數(shù)血管中，腺苷促進血管舒張主要由內皮細胞表達的A2aAR 和A2bAR 通過激活GSα和蛋白激酶A 通路介導[5]。而A1AR 僅表達在有限的部位，腎組織內主要表達在入球小動脈、球旁器顆粒細胞及近曲小管上皮細胞等[5～7]。入球小動脈給予A2AR 激動劑CGS21680 造成管壁舒張，給予A1AR 激動劑CHA 引起管壁收縮，提示與大多數(shù)血管相同，在入球小動脈，A2AR 主要舒張管壁，A1AR 則產生收縮管壁的作用[8～10]。A1AR 敲除的小鼠TGF 完全缺失[11，12]，人為上調A1AR 表達可使TGF 加強[13]，提示A1AR 是維持TGF 正常進行的關鍵蛋白。然而，隨著技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)選擇性敲除入球小動脈表達的A1AR，再通過顯微分離灌注觀察單個腎小球 （可除外腎素作用），發(fā)現(xiàn)其TGF 并非完全缺失，僅為部分降低[1]，提示入球小動脈并非唯一表達A1AR 并直接介導TGF調節(jié)的結構。

系膜細胞是連接并支持腎小球毛細血管袢的主要結構，具有舒縮功能，能夠調節(jié)毛細血管袢濾過面積，有參與TGF 的結構和功能基礎。我們查閱到A1AR 在系膜細胞的表達此前偶有報道，但主要是集中在大鼠標本中[6，14]，對于小鼠的研究比較少，且其具體功能尚不完全清楚。因此我們希望通過本研究，證實A1AR 在小鼠系膜細胞的確有表達，并觀察其表達部位，進而探究腺苷和A1AR激動劑、抑制劑對系膜細胞舒縮功能的影響，旨在為系膜細胞參與TGF 調節(jié)提供更多理論依據(jù)。

3.2 A1AR 在系膜細胞中的表達以及腺苷和A1AR 參與系膜細胞收縮的作用

本研究嘗試使用文獻報道較多的分樣篩法分離小鼠原代系膜細胞[2，15]，將腎皮質成分研磨后通過不同孔徑的篩網，最終獲得純化并經過膠原酶消化的腎小球。此法獲得的腎小球固有細胞主要有3 種：系膜細胞、內皮細胞和上皮細胞。原代上皮細胞和內皮細胞的培養(yǎng)一般需要從幼年動物腎臟提取，本實驗選用6～8 周齡小鼠為青壯年，不利于上述2 種細胞存活。此外，內皮細胞的培養(yǎng)基通常需要依賴成纖維細胞生長因子，上皮細胞也需要特殊培養(yǎng)液，因此通過反復傳代可達到系膜細胞的逐步純化，最終通過標記物免疫熒光染色鑒定為系膜細胞。

我們使用免疫熒光染色和western blot 方法證實，A1AR 在小鼠系膜細胞的確也有表達，免疫熒光染色展示出A1AR 呈細顆粒狀分布于系膜細胞胞漿中。本研究中腺苷對系膜細胞的增殖并沒有明顯的影響。在此前提下，為更好觀察腺苷對系膜細胞收縮功能的影響，我們選擇生長曲線實驗當中的最高濃度，也是文獻當中使用較多的濃度——100μM 的腺苷濃度刺激小鼠系膜細胞，觀察收縮情況的變化。

1μM AngⅡ刺激下系膜細胞能夠在30min 內發(fā)生顯著的收縮，已經被多項研究采納用于其收縮功能的評估。在AngⅡ的刺激下，正常系膜細胞能夠表現(xiàn)出在數(shù)分鐘內收縮的現(xiàn)象，不同狀態(tài)的細胞收縮程度可能不同，因此被用作一種評估其收縮能力的常用指標[16，17]。本文中使用活體顯微鏡成像系統(tǒng)在Ang Ⅱ刺激后連續(xù)動態(tài)觀察30min，評估腺苷、A1AR 激動劑及A1AR 抑制劑對小鼠系膜細胞收縮功能的影響，尚屬首次嘗試。我們觀察到與正常對照組相比，系膜細胞在加入腺苷和A1AR 激動劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h 后，受到AngⅡ刺激后的30min 內收縮幅度明顯增加，而在A1AR 抑制劑培養(yǎng)48h 后，AngⅡ引起的收縮幅度有減弱，并通過動態(tài)影像獲得了更為確切的證據(jù)。同時，對AngⅡ刺激前和30min 時的細胞面積變化進行分析，得到更為量化的研究結果，證實了腺苷及A1AR 參與系膜細胞收縮的調節(jié)。

綜上，本研究證實了腺苷及A1AR 是調節(jié)系膜細胞收縮的重要機制，提示系膜細胞的舒縮很可能也發(fā)揮了協(xié)同參與TGF 的作用。