武華周，婁德釗,2，涂娜娜,2，耿 濤，盧芙萍，吉訓(xùn)聰，王樹昌

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101；2. 海南大學(xué)，海南 海口 570228；3. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 海南 ?？?571100；4. 海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100）

0 引言

【研究意義】植物根際微生物對于植物生長、營養(yǎng)與健康有著深遠(yuǎn)的影響。植物根際包含有巨大數(shù)量微生物與無脊椎動物，被認(rèn)為是地球上動態(tài)性最強(qiáng)、最有活力的一種交界面[1?2]。根際微生物的結(jié)構(gòu)和豐度的改變是植物健康的重要預(yù)警器。已有研究表明植物在受到病蟲害攻擊時，會特異招募有益微生物，形成微生態(tài)系統(tǒng)-植物根部的“生物屏障”，達(dá)到阻止病原菌入侵的目的[3]。在自然條件下，植物及多種生態(tài)因子復(fù)雜的多變性，使得不同植物或同一物種不同基因型的根際微生物群落結(jié)構(gòu)不同[4]。因此，研究植物不同基因型根際土壤的微生物結(jié)構(gòu)和多樣性對其抗病機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明每克植物的根部約含1011個微生物細(xì)胞，可以提供巨大的潛在功能，被稱為寄主植株的“額外”基因組[5]。一是土壤微生物在營養(yǎng)元素循環(huán)、肥力提高、生態(tài)環(huán)境改善、植物生長發(fā)育、作物病蟲害防治等方面具有重要作用[6?7]。二是微生物影響植物生長健康，如根際微生物群落結(jié)構(gòu)與土傳病害的發(fā)生有一定內(nèi)在聯(lián)系，某些微生物代謝產(chǎn)物抑制植物的生長等[8]。根際微生物在特定生態(tài)環(huán)境和植物類型存在的群落結(jié)構(gòu)差異可促使植物產(chǎn)生特定的根際效應(yīng)，根際效應(yīng)直接影響著根際微生物的營養(yǎng)選擇和富集[9]。Kwak 等研究結(jié)果表明抗青枯病番茄Hawaii 7 996 可以富集更多的黃桿菌基因組，抑制青枯菌的生長[5]。此外，小麥、水稻、西瓜、黃瓜等作物根際微生物與土傳病害發(fā)生關(guān)系的研究也說明作物抗感品種間根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異[10?11]。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中客觀分析根際土壤微生物多樣性以及微生物群落結(jié)構(gòu)特征對研究和控制土傳病害有很好的幫助?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由青枯菌5 號小種引起的桑樹青枯病是最主要的桑樹細(xì)菌性病害之一，已成為制約我國蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[12]。由于桑樹青枯病很難防治，一旦爆發(fā)會造成嚴(yán)重的損失，當(dāng)前疫區(qū)主要利用抗性品種進(jìn)行防控[13]。海南目前主要栽培葉桑樹品種有抗青283×抗青10、抗青10、桂桑優(yōu)62 及其他嫁接苗等[14]。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，抗青10、抗青283×抗青10 對青枯病抗性強(qiáng)，較少有發(fā)病，桂桑優(yōu)62 對青枯病抗性弱，在瓊中地區(qū)多發(fā)病。這種差異與根際土壤微生物結(jié)構(gòu)及多樣性之間有何關(guān)系目前尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于此，本研究對抗青枯病桑樹種質(zhì)抗青283×抗青10 和敏感種質(zhì)桂桑優(yōu)62，采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)研究其根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，擬找出抗、感桑樹根際細(xì)菌群落的差異，為進(jìn)一步研究桑樹根際微生態(tài)特征、根際功能菌株的篩選和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗青283×抗青10 雜交組合是湛江市蓖麻蠶科學(xué)研究所黃富等采用有性雜交、病地添菌、人工誘變等方法，于1994 年3 月17 日通過廣東省農(nóng)作物品種審定委員會桑桑專業(yè)組的審定，對青枯病達(dá)到中抗水平[15]。桂桑優(yōu)62 是廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站1995 年選育出的優(yōu)良組合，于2000 年通過廣西農(nóng)作物品種審定委員會審定，耐高溫，適于珠江流域等熱帶、亞熱帶種植[16]。桑樹均為2016 年種植，樹齡為3 年。

1.2 根際土壤樣品的采集

樣地位于海南省瓊中縣營根鎮(zhèn)加釵農(nóng)場品種示范基地（N19.02′29″，E109.47′22″；H: 306 m），樣地 的 土 壤pH 為6.25，有 機(jī) 質(zhì)39.63 g·kg?1，銨 態(tài) 氮54.60 g·kg?1，電 導(dǎo) 率605.00 us·cm?1，鹽 分330.00 mg·L?1，總?cè)芙夤腆w物300.00 mg·L?1，全鉀為24.77 g·kg?1，全磷為1.37 g·kg?1。2019 年7 月采集根際土壤樣品，在抗青283×抗青10 和桂桑優(yōu)62 種植行中隨機(jī)選取4 行，每行選取5 株植株混合為一個樣品，去除地表土壤后，取根際土壤樣品，抗青283×抗青10 植株根際土壤樣本編號為QZ2K1、QZ2K2、QZ2K3、QZ2K4，桂桑優(yōu)62 植株根際土壤樣本編號為QZ2G1、QZ2G2、QZ2G3、QZ2G4。所有樣品置入冰盒，-80 ℃冰箱保存、備用。

1.3 土壤微生物DNA 提取

取充分混勻的土壤樣品0.50 g，采用DNeasy Power Soil Kit（100）試劑盒提取根際土壤DNA。抽提DNA 濃度和純度利用Nano Drop 2000 檢測，要求A 260 /A 280 值在1.8～2.0。

1.4 基因擴(kuò)增與測序

Takara 公司的Takara Ex Taq 高保真酶進(jìn)行PCR，利用16S V3-V4 區(qū)域引物343F 5′- TACGGRAGGC AGCAG -3′和798R5′- AGGGTATCTAATCCT-3′擴(kuò)增[17]。PCR 擴(kuò) 增 體 系：25 μL 2x PremixTaq（Takara Biotechnology），引物各1 μL（10 mmol·L?1），DNA 模板3 μL（20 ng·μL?1），加dd 水 溶 解 定 容 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性：94℃ 5 min；變性：94℃30 s，退火：52℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30 個循環(huán)；延伸：72℃ 10 min。采樣瓊脂糖電泳檢測，利用Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量回收產(chǎn)物并進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Trimmomatic（Version 0.35）軟件對原始數(shù)據(jù)（raw data）質(zhì)量部分剪切，拼接得到完整雙端序列（paired end tags）。 使 用 QIIME 中 的 Split Libraries（Version 1.8.0）軟件得到高質(zhì)量序列（clean tags）。去除高質(zhì)量序列中的嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列（valid tags）。 對質(zhì)控得到的優(yōu)質(zhì)序列使用Vsearch（Version 2.4.2）軟件按照97%的相似度進(jìn)行OTU 分類，以每個OTU 中豐度最大序列為該OTU 的代表序列，采用RDP Naive Bayesian Classifier分類算法進(jìn)行注釋。使用BioVenn 在線軟件進(jìn)行Venn 圖繪制；使用Excel 2013 和SPSS 19.0 軟件對相對豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制相對豐度柱狀圖；使用Qiime 軟件計(jì)算觀測物種數(shù)、Chao1 指數(shù)（Chao1）、香農(nóng)、辛普森、譜系多樣性指數(shù)（PD whole tree）和文庫覆蓋率（Goods-coverage）等多樣性指數(shù)，稀釋曲線和NMDS 圖用R 軟件繪制。通過LDA 對根際細(xì)菌群落進(jìn)行LEFSE 分析（LDA Score 2.5）尋找抗、感青枯病桑樹根際土壤細(xì)菌群落差異類群；使用PICRUSt 軟件，預(yù)測已知微生物基因功能的構(gòu)成。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌群落測序結(jié)果分析

細(xì)菌16S rRNA 高通量測序共獲得優(yōu)化序列304 272 條，平均長度431.48 bp（表1）。8 個樣本序列均超過32 000 條reads，樣品測序深度都超過94%，測序效果理想。

表 1 高通量測序數(shù)據(jù)概況Table 1 Overview of high-throughput sequencing data

2.2 細(xì)菌群落組成比較

抗青枯病桑樹樣品共鑒定出細(xì)菌28 個門、76 個綱、151 個目、230 個科、388 個屬；易感青枯病桑樹樣品共鑒定出細(xì)菌27 個門、73 個綱、147 個目、225 個科、363 個屬。根據(jù)Venn 圖可知，共有OTUs數(shù)為2 089 個，其中QZ2K 特有的OTUs 為1 113 個，QZ2G 為898 個（圖1）。

圖 1 抗感青枯病桑樹根際土壤細(xì)菌OTUs 韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of bacteria OTUs in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G

桑樹根際土壤樣品中細(xì)菌群落門水平上組成結(jié)構(gòu)和豐度結(jié)果如圖2-A 根際土壤細(xì)菌主要分布在以下15 個門：變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、 酸 桿 菌 門（Acidobacteria）、 芽單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、匿桿菌門（Latescibacteria）、Entotheonellaeota、 Patescibacteria、 河 床 菌 門（Zixibacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、羅克菌門（Rokubacteria），其中變形菌門最為豐富，QZ2K和QZ2G 土樣中相對豐度分別為44.54%，46.23%，其次為放線菌門，QZ2K 和QZ2G 土樣中相對豐度分別為23.01%，28.86%。其中QZ2K 根際土樣中酸桿門、芽單胞菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、Patescibacteria、河床菌門、藍(lán)細(xì)菌門、羅克菌門的含量高于QZ2G 根際土樣的含量。

在屬水平上如圖2-B 所示，前十五的屬分別為MND1、Gaiella、 硝 化 螺 菌 屬 （Nitrospira）、Haliangium、鏈霉菌屬（Streptomyces）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌 屬（Bacteroides）、Subgroup 10、Acidibacter、分支 桿 菌 屬 （Mycobacterium）、 土 微 菌 屬（Pedomicrobium）、Ellin6067、mle1-7、鞘氨醇單胞菌 屬（Sphingomonas）。 芽 胞 桿 菌 屬 在 QZ2K土樣中占1.76%，而在QZ2G 土樣中僅為0.41%。另外，土微菌屬、擬桿菌屬、mle1-7、鞘氨醇單胞菌屬、類諾卡氏菌屬、硝化螺菌屬在QZ2K 土樣中的含量也高于其在QZ2G 土樣中的含量。

圖 2 細(xì)菌群落門（A）和屬（B）水平相對豐度Fig. 2 Phylum （A） and genus （B） distributions of OTUs

2.3 群落多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性 對抗、感桑樹根際土壤細(xì)菌群落進(jìn)行6 種α 多樣性指數(shù)計(jì)算（表2）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，抗感桑樹根際細(xì)菌群落的各個多樣性指數(shù)均無顯著性差異。譜系多樣性指數(shù)、Chao1 指數(shù)和觀測物種數(shù)在抗青枯病桑樹QZ2K 土樣中高于感青枯病桑樹QZ2G 土樣。

表 2 抗感青枯病桑樹根際土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4）Table 2 Alpha diversity indices of bacteria in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G（Mean±SE，n=4）

2.3.2 Beta 多樣性 Beta 多樣性利用各樣本序列間的進(jìn)化關(guān)系及豐度信息來計(jì)算樣本間距離，反映樣本（組）間是否具有顯著的微生物群落差異。基于加權(quán)UniFrac 距離的非度量多維標(biāo)定法（Non - Metric Multi - Dimensional Scaling，NMDS）來研究不同基因型根際細(xì)菌群落之間的分離模式考慮了分類群豐度，對稀有的分類群更敏感。如圖3 所示，在UniFrac NMDS 中，stress=0.005＜0.05，說明很好地將抗青枯病桑樹根際土壤QZ2K 與感青枯病桑樹根際土壤QZ2G 樣本區(qū)分開來，表明桑樹不同基因型根際細(xì)菌群落之間存在顯著的差異。

圖 3 抗感青枯病桑樹根際土壤細(xì)菌NMDS 分析Fig. 3 Non-MetricMulti-dimensional scaling by UUF metric

圖 4 抗感青枯病桑樹根際土壤細(xì)菌LEfSe 分析Fig. 4 LEfSe analysis on bacteria in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G

2.4 抗感青枯病桑樹根際優(yōu)勢細(xì)菌差異分析

使用LEfSe 分析抗青283×抗青10 與桂桑優(yōu)62 根際土壤細(xì)菌群落中主要差異物種（LDA Score 預(yù)設(shè)值為2.5，小于2.5 視為沒有顯著差異）（圖4-A）。結(jié)果表明，酸桿菌綱（Acidobacteriia）、硝化螺旋菌門、硝化螺旋菌綱（Nitrospira）、硝化螺旋菌目（Nitrospirales）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、硝化螺旋菌科（Nitrospiraceae）、索利氏菌目、索利氏菌科（Subgroup 3）、 酸 桿 菌 目（Acidobacteriales）、Subgroup 2 未培養(yǎng)科未培養(yǎng)屬、酸桿菌目未培養(yǎng)科、Candidatus Solibacter、Subgroup 2 未培養(yǎng)科這幾類菌群在抗青283×抗青10 根際的相對豐度均顯著高于桂桑優(yōu)62 根際，抗青283×抗青10 根際酸桿菌綱LDA 值最大，桂桑優(yōu)62 根際MND1 LDA 值最大，說明這兩個類菌群的差異最大。從圖4-B 中可以看出抗青283×抗青10 根際重要作用的細(xì)菌類群包括：硝化螺旋菌綱、酸桿菌綱、硝化螺旋菌目、索利氏菌目、酸桿菌目、硝化螺旋菌科、酸桿菌目未培養(yǎng)科、索利氏菌科（Subgroup 3）和Subgroup 2 未培養(yǎng)科；而桂桑優(yōu)62 根際重要作用的細(xì)菌類群Ilumatobacteraceae 和TRA3 20 Other 兩個科。

2.5 抗感青枯病桑樹根際細(xì)菌群功能分析

基于16S rDNA 序列的PICRUSt 功能預(yù)測（圖5），抗青283×抗青10 和桑優(yōu)62 的根際細(xì)菌群落對應(yīng)的COG 類目排名前10 的相同，分別為氨基酸運(yùn)輸與代謝（E）、轉(zhuǎn)錄（K）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T）、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（C）、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生（M）、碳水化合物運(yùn)輸與代謝（G）、復(fù)制，重組和修復(fù)（Lr）、翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物源（J）、無機(jī)分子運(yùn)輸與代謝（P）、輔酶運(yùn)輸與代謝（H）（不包括未知功能和通用功能）；兩組根據(jù)Wilcoxon 算法差異COG 類目為763，僅占所有COG 類目的17.25%。

圖 5 抗感青枯病桑樹根際細(xì)菌預(yù)測得到的COG 相對豐度Fig. 5 Relative abundance of COG at QZ2K and QZ2G

3 討論與結(jié)論

植物對青枯病的抗性是由數(shù)量性狀基因介導(dǎo)的，但植物對其表型是可變的，并受環(huán)境因素影響，其中植物根際微生物在抗青枯病上具有重要作用[5，7]。本研究發(fā)現(xiàn)抗青283×抗青10 根際細(xì)菌在門、綱、目、科、屬和OTU 分類水平均略高于桂桑優(yōu)62 根際細(xì)菌群落，但對根際細(xì)菌物種多樣性分析結(jié)果表明兩種桑樹根際細(xì)菌群落多樣性差異不顯著。這可能是因?yàn)閮煞N基因型桑樹種植在同一樣地，管理方式一致，土壤在根系細(xì)菌組裝過程中占主導(dǎo)地位。在門水平，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等為根際土壤的優(yōu)勢菌門，分別占抗青283×抗青10 和桂桑優(yōu)62 根際細(xì)菌總體的92.15%、94.27%。結(jié)果與邱潔等研究3 個品種桑樹（粵椹大10、嘉陵30 號和紅果1 號）根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)基本一致[18]。在屬水平，主要分布在MND1、Gaiella、硝化螺菌屬、Haliangium等15 個屬，但抗、感桑樹根際各屬含量有差異，抗青283×抗青10 根際細(xì)菌在放線菌的類諾卡氏菌屬和芽胞桿菌屬均高于桂桑優(yōu)62 根際細(xì)菌。邱潔等對3 種桑樹根際細(xì)菌研究也發(fā)現(xiàn)，隨著分類的細(xì)化，不同的桑樹品種對細(xì)菌群落組成和分布的影響越大，在科屬水平上差異更明顯[18]。

進(jìn)一步基于加權(quán)UniFrac 距離的非度量多維標(biāo)定法Beta 多樣性分析，抗青283×抗青10 和桂桑優(yōu)62 的根際細(xì)菌群落可以顯著區(qū)分開來。說明抗感桑樹根際分別富集了不同的優(yōu)勢細(xì)菌菌群，可能是基因型通過植物差異生長性能、凋落物和根系分泌物等影響植物根際微生物群組裝。通過LDA Score 進(jìn)行LEfSe 分析，發(fā)現(xiàn)抗、感青枯病桑樹根際重要作用的微生物類群存在差異。類諾卡氏菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬在抗性品種根際豐度也更高。研究表明類諾卡氏菌屬和芽胞桿菌屬分別屬于放線菌和芽胞桿菌，是生防菌，通常代表土壤的健康狀況對植物病害具有防病作用[19?20]。研究表明鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）在具有抑病性的煙草根際土壤中具有普遍存在的特征[18,21]，鞘脂單胞菌科的某些菌株也被報(bào)道與根部固氮作用密切相關(guān)[22]，因此，鞘氨醇單胞菌屬也可能與植物對病原體攻擊的抵抗力有關(guān)?？骨嗫莶∩涓H土壤富集了更多的類諾卡氏菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬，可能對其抵抗青桔病有關(guān)，這有待于研究證實(shí)。

本研究利用Illumina 高通量測序技術(shù)對抗感青枯病桑樹的根際土壤樣品進(jìn)行了測序分析，同一地點(diǎn)抗、感青枯病桑樹根際細(xì)菌群落多樣性差異不顯著，但其重要的細(xì)菌類群存在差異，抗青枯病桑樹根際土壤富集了更多的類諾卡氏菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等生防菌，這為進(jìn)一步研究桑樹青枯病的防治奠定了基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)品種抗性差異可能通過根系分泌物對病原菌的化感作用差異來體現(xiàn)[23]，根系分泌物通過刺激特定微生物的生長，富集特定微生物，在植物-微生物和微生物-微生物相互作用中發(fā)揮重要作用[24?26]。因此，為闡明抗感病桑樹根際微生物差異的機(jī)制及原因，尚需進(jìn)一步對抗、感青枯病桑樹種質(zhì)根系分泌物組分、含量差異及其對土壤微生物的影響作進(jìn)一步測定分析。