趙曉燕，周方園，吳曉青，史亞微，周紅姿，張廣志，范素素，謝雪迎，潘美霖，張新建*

（1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東 濟(jì)南 250103；2. 北京航天威科環(huán)?？萍加邢薰?，北京 豐臺 100071）

0 引言

【研究意義】隨著高毒農(nóng)藥的禁用，低毒農(nóng)藥逐漸占領(lǐng)市場。2015～2016 在工信部農(nóng)藥審批新發(fā)證的辛硫磷藥企有455 家，辛硫磷目前已是世界上生產(chǎn)和銷售量最大的有機(jī)磷農(nóng)藥之一[1]。辛硫磷是一種低毒有機(jī)磷殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和畜牧業(yè)中均有使用[2]，長期過量使用導(dǎo)致辛硫磷殘留超標(biāo)。據(jù)報道辛硫磷能使成年雄鼠的生殖系統(tǒng)發(fā)生異常，長期接觸辛硫磷會危害人們的心臟、肝臟等器官及生殖系統(tǒng)[3?5]。辛硫磷等有機(jī)磷殺蟲劑在糧倉、蘑菇拌料、土壤及根莖類作物比在果蔬上殘留時間長[6?7]。在糧食加工中，辛硫磷等有機(jī)磷殺蟲劑殘留主要在農(nóng)作物的外表皮部分，因此用作飼料的麥麩、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品均存在辛硫磷嚴(yán)重超標(biāo)的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對辛硫磷降解菌的報道主要有戴爾福特菌屬（Delftiasp.）[8]、淡紫擬青霉（Paecilamyces lilaciuns）[9]和鄰單胞菌屬（Plesiomonassp.）[10]、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）[11]等，主要探討降解菌對辛硫磷的降解和降解特性?！颈狙芯壳腥朦c】前人研究大多集中在降解菌對辛硫磷的降解率和降解特性的研究方面，而未見對辛硫磷降解活性的追蹤及應(yīng)用方面的研究。本課題組篩選到1 株兼具防病作用的辛硫磷降解菌D39，該菌株為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）的新菌株。本研究對D39 降解活性進(jìn)行定位，并提取胞內(nèi)粗酶液在含辛硫磷的麩皮上進(jìn)行降解活性檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】辛硫磷降解菌D39 及其降解酶系能高效降解辛硫磷殘留，是安全降解糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中辛硫磷殘留的有效途徑，該研究的高效降解菌及其胞內(nèi)降解酶為糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中辛硫磷污染的降解提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白 菜 黑 腐 病 菌Xanthomonas campestrispv.campestris、玉米彎孢葉斑病菌Curvularia Lunata、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea和小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis均為山東省應(yīng)用微生物重點實驗室分離保存菌種。

1.2 供試培養(yǎng)基

基 礎(chǔ) 無 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基（SMM g·L?1）：NaCl 0.5、NH4NO31.00、 K2HPO41.50、 KH2PO40.50、MgSO4·7H2O 0.20，pH 7.0，以辛硫磷作為碳源（固體加瓊脂15 g）。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL（固體加瓊脂15 g）。

1.3 儀器與試劑

儀器設(shè)備: DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；HZQ-Q 全溫振蕩器（哈東聯(lián)）；Q10 超純水儀（Millipore）Universal Hood；核 酸 凝 膠 成 像 儀（Bio-Rad）flexlid；PCR 儀（Eppendorf）；Centrifuge5418臺式離心機(jī)（Eppendorf）；CR22G 低溫高速離心機(jī)（HITACHI）XMTD-8222 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）；Sub-Cell GT 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）；Mini Vortex 渦旋震蕩儀（北京東林昌盛）；HPLC 高效液相色譜儀UltiMate 3000（美國賽默飛公司）。

試劑: DNA MarkerTaq聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；2XTaqPCR Green Mix，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit），北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。辛硫磷原藥購自濟(jì)南嘉禾化工有限公司。

1.4 辛硫磷降解菌的分離

采用富集培養(yǎng)法[10]分離辛硫磷降解菌。2016 年2 月從菏澤巨野后屯村不同的麥地和棉花地取樣10 個樣品。（通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)辛硫磷高用藥量的地塊為10 塊地，每塊地五點取樣法混合在一起為一個樣品）在實驗室內(nèi)取樣品土壤10 g，置于100 mL 的SMM 培養(yǎng)基中，加入100 mg·L?1的辛硫磷，30 ℃，150 r·min?1培養(yǎng)1 周，以10%的接種量接入新鮮的SMM 培養(yǎng)基中，并逐步提高（100、200、300、400、500）至辛硫磷的質(zhì)量濃度達(dá)500 mg·L?1。搖瓶五周結(jié)束后，取0.1 mL 的富集液涂布于含300 mg·L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板中，放置恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3 d 后挑取透明圈最大的3 株降解菌，分離純化后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于含5 mL 液體LB 的滅菌試管中搖床30 ℃、150 r·min?1培養(yǎng)6 h 生長至對數(shù)生長期做為種子培養(yǎng)液，備用。取上述各種子培養(yǎng)液1 mL 轉(zhuǎn)接于含300 mg·L?1辛硫磷原液的液體SMM 培養(yǎng)基中，搖床30 ℃、150 r·min?1液體搖培5 d 后選取降解效果最好的菌株，以只接300 mg·L?1辛硫磷原液的液體SMM 培養(yǎng)基為CK，每處理3 個重復(fù)。取降解效果最好的菌株再次在含300 mg·L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板上分離純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株的鑒定

菌株D39 形態(tài)及生理生化特征鑒定: 以劃線分離法在LB 平板上劃出菌株D39 單菌落，在顯微鏡下觀察D39 采用結(jié)晶紫染色后的菌體細(xì)胞形態(tài)特征，生化活性測定參照常見細(xì)菌鑒定手冊[12]進(jìn)行。

菌株16S rDNA 基因的克隆及序列比對：提取D39 的基因組DNA 作為模板，進(jìn)行16S rDNA 基因的擴(kuò)增。一對引物分別為，正向引物：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-TACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′；25 μL 體系為：模板1 μL，引物（1 mmol·L?1）各1 μL，Mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) 條 件:94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；52.3 ℃，45 s；72 ℃，1.5 min；循 環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min。采用PCR 回收試劑盒回收16S rDNA的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。?.5 kb 左右）后，將其TA 克隆后進(jìn)行測序（由上海生工測序公司完成）。測序結(jié)果通過在線分析（http//:www.ncbi.nlm.nih.gov），與GenBank 中的16S rDNA 基因序列進(jìn)行相似性比較。

1.6 D39 降解活性的定位

D39 接入LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后5 000 r·min?1離心10 min，分別收集離心得到的菌體和上清。用無菌牙簽分別蘸取菌體和上清于含有300 mg·L?1辛硫磷的SMM 平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，每天觀察平板有無透明圈出現(xiàn)。

將培養(yǎng)好的菌株用低溫冷凍離心機(jī)在15 ℃、8 000 r·min?1離心10 min，收集離心得到的菌體。將菌體用20 mL、pH 為9.0 的0.05 mol·L?1磷 酸 鹽 緩 沖 液（Na2HPO4-NaH2PO4）洗滌，然后再以8 000 r·min?1離心10 min 收集菌體，按菌體∶緩沖液=3∶1 的量加入少量緩沖液置于冰浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理10 次，每次1 min，以8 000 r·min?1離心10 min，除去細(xì)胞碎片，得胞內(nèi)粗酶液。

將胞內(nèi)粗酶液和上清中的胞外粗酶液分別接入含有300 mg· L?1辛硫磷的SMM 平板上，放于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，每天觀察平板有無透明圈出現(xiàn)。

1.7 HPLC 檢測D39 胞內(nèi)酶對麩皮上辛硫磷的降解作用

（1）樣品制備

室內(nèi)先將辛硫磷均勻拌入麩皮，使辛硫磷在麩皮中的含量為300 mg·kg?1，等麩皮陰干后再將胞內(nèi)粗酶液噴霧加入含辛硫磷的麩皮，麩皮中酶液濃度為0.1 mg·kg?1，在溫度為25 ℃的條件下，反應(yīng)11 h。在胞內(nèi)粗酶液噴霧加入麩皮后的2、4、6、8、10、11 h 分別取樣用HPLC 法測辛硫磷的降解率。以不噴酶液的含藥麩皮為對照，試驗設(shè)3 次重復(fù)。辛硫磷原藥用乙腈稀釋成0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg·mL?1五個質(zhì)量濃度，進(jìn)樣量10 μL，用于制作辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品提取和凈化

取上述制備好的麥麩樣品2 g 于50 mL 離心管中經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，加入乙腈20 mL，于200 r·min?1下?lián)u床高速振蕩1 h，再于6 000 r·min?1下離心5 min，移取上層乙腈相10 mL，經(jīng)氮吹至近干，待凈化。待凈化樣品中加入5 mL 二氯甲烷，劇烈振蕩后靜置分層，棄去上層乙腈相，下層二氯甲烷經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，取1 mL 于微量離心管中，氮氣吹干后加入1 mL 甲醇溶解（色譜純），用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后，待測。

（3）色譜分析條件

高效液相色譜法[13?14]測定條件如下，流動相為甲醇∶水 = 80∶20，流速為1 mL·min?1，進(jìn)樣量為 10 μL，色譜柱：TC-C18 色譜柱，5 μm，250 mm × 4.6 mm，可變波長檢測器的工作波長為230 nm，采用外標(biāo)法定量，試驗設(shè)3 次重復(fù)。

1.8 菌株D39 對供試菌株的拮抗性能測定

采用對峙培養(yǎng)法[15]分別測定降解菌D39 發(fā)酵液對白菜黑腐病菌Xanthomonas campestrispv. campestris、玉米彎孢葉斑病菌Curvularia lunata、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp. cucumerinum、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea和小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis的抑制作用。D39 發(fā)酵液為LB 液體搖培至活菌數(shù)為108CFU·mL?1，試驗設(shè)3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

含300 mg.L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板30 ℃培養(yǎng)3 d 后，從圖1 可以看出透明圈較大的3 株降解菌為25、26 和39。上述3 株菌培養(yǎng)至對數(shù)生 長 期 后 轉(zhuǎn) 接 于 含300 mg·L?1辛 硫 磷 原 液 的 液 體SMM 培養(yǎng)基中，搖床30 ℃、150 r·min?1液體搖培5 d后的效果見圖2。從圖2 中明顯能看出來含39、25和26 三株菌的三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)液和對照CK 相比乳白色明顯變淺，其中含39 的培養(yǎng)液已經(jīng)完全澄清透明，說明菌株39 的降解效果最好。

圖 1 各菌株在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈Fig. 1 Hydrolytic halos generated by bacteria on mineral salt medium with phoxim as sole carbon source

圖 2 3 株菌（39、25、26）對液體SMM 中辛硫磷的降解Fig. 2 Degradation of phoxim in liquid SMM by bacterialstrains 39, 25 and 26

最終選取39 號菌為高效降解菌進(jìn)行后述試驗，將其命名為D39。將D39 在含辛硫磷的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基SMM 平板上分離純化（圖3）后4 ℃和?80 ℃分別保存?zhèn)溆谩?/p>

圖 3 菌株D39 在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈Fig. 3 Hydrolytic halos generated by D39 on mineral salt medium with phoxim as sole carbon source

D39 結(jié)晶紫染色后，顯微鏡檢表明該細(xì)菌菌株為革蘭氏陰性，菌落呈圓形，乳白色，有凸起，邊緣平整，形態(tài)飽滿，光滑濕潤，細(xì)胞呈短桿狀（圖4），無芽胞。

圖 4 D39 的顯微形態(tài)Fig. 4 Microscopic morphology of D39

2.2 菌株的鑒定

菌株D39 的生理生化特性為: 接觸酶反應(yīng)為陽性，V～P 反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗均為陰性，革蘭氏染色顯陰性。

以菌株D39 的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示有1 條特異性目的片段，大小1 500 bp 左右（圖5）?；厥赵撈嗡蜕虾Ｉy序，測序結(jié)果表明菌株D39 的16S rDNA 核苷酸序列全長為1 439 bp，將該序列提交GenBank，序列號為MT912949。測序結(jié)果通過在線分析（http : www.ncbi.nlm.nih.gov），與GenBank中的16S rDNA 基因序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)菌株D39 的 序 列 與Delftiasp.的16S rDNA 序 列 同 源 性 為99%。結(jié)合生理生化特征鑒定該菌株D39為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）。

圖 5 16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 16S rDNA PCR product of D39

2.3 D39 降解活性的定位

D39 液體搖培離心后的上清和菌體分別進(jìn)行降解活性檢測，從圖6-A 中可以看出菌株D39 的降解活性部位在菌體部分。點接菌體部位原本白色的培養(yǎng)基，因培養(yǎng)基中的辛硫磷已經(jīng)被菌體降解掉而變?yōu)橥该?。而接種上清液的部位，培養(yǎng)基依然為白色，即上清液對辛硫磷沒有降解作用，說明起降解作用的是菌體的胞內(nèi)酶，而不是上清液中的胞外酶。進(jìn)一步提取D39 的胞內(nèi)粗酶液，將胞內(nèi)粗酶液和上清中的胞外酶再次接入含藥平板內(nèi)檢測降解活性（圖6-B）。從圖6-B 中可以看出有降解活性的是胞內(nèi)酶，而胞外酶沒有降解活性。

2.4 D39 胞內(nèi)酶對麩皮上辛硫磷的降解作用

辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。從圖7 中可以看出以辛硫磷的濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收峰面積為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相對應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。辛硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)分別為y=911.05x?3.0448，R2=1，呈極顯著相關(guān)。

注：A 為D39 降解活性定位，B 為酶活部位檢測Note: A: activities of bacteria and supernatant; B: activities of endoenzymes and extracellular enzyme

圖 7 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 7 Standard curve of phoxim

胞內(nèi)粗酶液噴霧加入麩皮后在2 、4 、6 、8 、10 、11 h 分別取樣測辛硫磷的降解率。從圖8 中可以看出隨著時間的增加，辛硫磷的降解率越來越高，11 h 后胞內(nèi)酶液對麩皮上辛硫磷的降解率最高，為100%。為了進(jìn)一步確認(rèn)11 h 后胞內(nèi)酶液對麩皮上辛硫磷的降解率，進(jìn)行了HPLC 檢測（HPLC 圖譜見圖9），從圖9 中的對照CK 圖譜中能看出辛硫磷的出峰時間為4.361 min，而胞內(nèi)酶降解辛硫磷11 h 后的HPLC 圖譜在4.361 min 沒有任何物質(zhì)峰出現(xiàn)，辛硫磷已經(jīng)被完全降解掉，降解率100%。

圖 8 D39 的胞內(nèi)酶對麩皮上辛硫磷的降解作用Fig. 8 Phoxim degradation on wheat bran by endoenzyme from D39

圖 9 胞內(nèi)酶及對照11 h 對麩皮上辛硫磷降解的HPLC 圖譜Fig. 9 HPLC chromatograms of phoxim degradations on wheat bran by endoenzyme from D39 and by CK

2.5 降解菌D39 對病害的拮抗作用

菌株D39 對5 種病原菌的抑制作用結(jié)果見表1。從平板對峙培養(yǎng)5 d 后的結(jié)果中可以看出菌株D39 對各個病原菌均有一定的拮抗作用，各處理之間的差異性顯著。其中菌株D39 對小麥紋枯病菌的抑制效果最好，平均抑菌率為50.00%；對玉米彎孢葉斑病菌的平均抑制率最低，為21.05%。

表 1 菌株D39 對植物病原菌的抑菌作用Table 1 Inhibition activities of D39 on phytopathogens

3 討論與結(jié)論

通過富集培養(yǎng)法從山東菏澤農(nóng)田土壤中分離到一株辛硫磷降解菌，采用傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行D39 的16S rDNA序列分析與屬種間的生理生化測定，最終確定D39 為戴爾福特菌屬Delftiasp.的1 個新菌株。2007年沈雨佳[8]也報道了1 株辛硫磷降解菌XSP-1 為戴爾福特菌屬，該菌株中沒有質(zhì)粒，推測降解基因可能定位在染色體上。本研究中的D39 菌株全基因組完成圖中表明，D39 存在兩個質(zhì)粒，其辛硫磷降解基因存在于其中一個質(zhì)粒上（另文報道）。迄今為止，戴爾福特菌屬已發(fā)現(xiàn)了2 株辛硫磷降解菌。

采用對峙培養(yǎng)法分別測定降解菌D39 發(fā)酵液對白菜黑腐病菌、玉米彎孢葉斑病菌、黃瓜枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和小麥紋枯病菌的抑制作用，結(jié)果表明降解菌D39 發(fā)酵液對4 種病原菌均具有一定的抑制作用，其中對小麥紋枯病抑菌效果最好，對峙培養(yǎng)5 d 后平均抑菌率為50.00%。單一功能的降解菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不易推廣，兼具防病作用的降解菌不但拓寬了降解菌D39 的應(yīng)用范圍，也更加實用。

考慮到辛硫磷殘留在糧倉、飼料等農(nóng)副產(chǎn)品中無法直接用菌液的問題，對降解菌的降解活性進(jìn)行定位，并進(jìn)行胞內(nèi)粗酶液的提取和粗酶液對麩皮辛硫磷殘留的降解試驗。試驗結(jié)果表明，胞內(nèi)粗酶液在作用了11 h 后，經(jīng)HPLC 法檢測對麩皮上300 mg·kg?1辛硫磷的降解率為100%。目前我國食品中農(nóng)藥最大殘留限量（GB2763—2016）的標(biāo)準(zhǔn)中辛硫磷的最大殘留限量：水果、稻類、麥類中均為0.05 mg·kg?1，蔬菜中除大蒜、結(jié)球甘藍(lán)、普通白菜為0.1 mg·kg?1外，其余均為0.05 mg·kg?1。D39 的胞內(nèi)酶能快速降解食品和蔬菜中的各種辛硫磷殘留，未來采用酶降解糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中的辛硫磷殘留也更加安全，本研究為降解菌D39 以后進(jìn)一步的實際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。