左明雪，孫 杰，徐如玉，袁銀龍，顧文杰，盧鈺升，徐培智 ，解開治

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東 廣州 510640）

0 引言

【研究意義】甜玉米（Zea maysL.）富含多種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)，含糖量高，享有“水果玉米”和“保健水果玉米”的美稱[1?2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國甜玉米種植面積占世界種植面積的21%，其中廣東省是我國甜玉米主產(chǎn)區(qū)和消費(fèi)區(qū)[3]。氮素是甜玉米需要量最高、影響甜玉米生長和產(chǎn)量品質(zhì)的必需礦質(zhì)營養(yǎng)元素。但目前甜玉米氮肥利用率低于全國玉米氮肥利用率水平，盲目增施氮肥追求高產(chǎn)不僅造成資源浪費(fèi)還會(huì)帶來一系列的環(huán)境問題[4]。叢枝菌根真 菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）能 與90%以上植物形成菌根共生體，并且促進(jìn)宿主對氮磷鉀等營養(yǎng)元素的吸收和利用[5]。但也有研究指出AMF只有當(dāng)自身N 素被滿足后才可能將多余氮素傳遞給宿主，增加碳源能刺激AMF 共生體內(nèi)的N 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。有機(jī)無機(jī)肥配施作為氮肥高效管理的關(guān)鍵施肥措施，通過增加土壤有機(jī)碳含量為氮循環(huán)微生物提供碳源，來間接或直接調(diào)控土壤氮素循環(huán)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而提高土壤氮肥利用效率以及作物產(chǎn)量，減少化學(xué)氮肥投入和削減氮素?fù)p失對環(huán)境的負(fù)面影響?，F(xiàn)有研究表明，有機(jī)無機(jī)肥配施能實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，增強(qiáng)土壤氮素有效性，提高氮素利用率，具有改良土壤、保水保肥、減肥增產(chǎn)等作用[7?8]。研究AMF 配施有機(jī)肥對甜玉米根際土壤氮素轉(zhuǎn)化以及氮循環(huán)微生物功能基因的影響有助于為甜玉米增產(chǎn)、氮素減施提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有機(jī)肥含有大量有機(jī)碳源，能促使微生物將更多的銨態(tài)氮同化進(jìn)入到土壤活性有機(jī)碳庫[9]，提高氮素礦化同化速率，通過后續(xù)微生物作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹参镉行У?，有效固氮降低氮素?fù)p失[10?11]。有機(jī)肥通過調(diào)節(jié)土壤碳氮比能使土壤中的異氧微生物在吸收利用NH4+-N的同時(shí)也進(jìn)行NO3?-N 同化，激發(fā)自養(yǎng)硝化和異氧硝化，為反硝化提供底物[12?14]。Leininger 等[15]研究表明，有機(jī)無機(jī)肥配施提供的基質(zhì)、養(yǎng)分有利于氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria, AOB）以及氨氧化古菌（Archaea-oxidizing ammonia, AOA）的生長，顯著提高土壤中AOB 的豐度。而AMF 在玉米減肥增產(chǎn)方面具有重要的作用。趙乾旭等[16]通過盆栽試驗(yàn)證明叢植菌根真菌能與玉米形成良好共生體，增加作物含氮量和生物量，提高19.51%的氮吸收利用率；劉銘銘等[17]通過盆栽試驗(yàn)表明增施AMF能提高玉米27.8%的氮肥利用率。李芳等[18]通過大田試驗(yàn)，菌根化育苗指出接菌植株根系的菌根侵染強(qiáng)度和叢枝豐度均顯著高于不接菌植株，但焦點(diǎn)著力于作物對于磷的吸收利用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對于AMF 促進(jìn)化肥減量主要局限于盆栽試驗(yàn)，并且大部分學(xué)者關(guān)注磷肥減施。而AMF 配施有機(jī)肥的研究也主要集中在土壤微生物群落多樣性差異以及具體的某一個(gè)氮循環(huán)轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)，針對有機(jī)無機(jī)肥配施后土壤氮素轉(zhuǎn)換以及氮循環(huán)微生物功能基因的研究甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用大田區(qū)組設(shè)計(jì)，利用功能基因芯片（GeoChip 5.0）技術(shù)，研究AMF 配施有機(jī)肥對甜玉米根際土壤氮素轉(zhuǎn)化以及氮循環(huán)微生物功能基因的影響，探索其對甜玉米-土壤氮循環(huán)的微生物學(xué)過程，為氮肥利用率提高、化學(xué)氮肥減施和氮肥增效等提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本次定位試驗(yàn)在廣東省惠州市惠陽區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心試驗(yàn)基地（N23°8′46.19″, E113°20′47.84″）進(jìn)行。于2018 年春季開始，一年春秋兩季栽培，結(jié)束于2018 年秋季。試驗(yàn)地屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，土壤類型為磚紅壤。試驗(yàn)初始基本地力養(yǎng)分指標(biāo)為有機(jī)質(zhì)含量22.8 g·kg?1，堿解氮191.54 mg·kg?1，速效磷49.56 mg·kg?1，速效鉀149.41 mg·kg?1，pH 值5.18。

1.2 試驗(yàn)材料

供試甜玉米（Zea MaysL.）品種為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供的粵甜28 號(hào)。供試菌種為購自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所的變形球囊霉菌（Glomuse versiforme, BGC GD01C）。其菌劑本身含有被侵染的玉米植物根段、菌根真菌孢子及根外菌絲的根際沙土混合物，經(jīng)檢測，其孢子密度為38 個(gè)·g?1。參照畢銀麗等[19]的室內(nèi)盆栽砂土擴(kuò)繁方式進(jìn)行擴(kuò)繁?；|(zhì)采用風(fēng)化煤∶砂∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1∶1 組合，經(jīng)過高壓滅菌（121℃，30 min）后備用。采用10% H2O2對甜玉米種子進(jìn)行10 min 的消毒后洗凈置于培養(yǎng)箱28℃催芽備用。將2.0 kg 滅菌基質(zhì)放入盆缽（75%酒精消毒）中，澆水至土壤持水量75%后將15 g 菌劑平鋪，放入6 粒催芽后的甜玉米種子，最后用0.5 g 基質(zhì)覆蓋住種子；出苗一周后每盆定苗4 株，采用自然光照、空調(diào)控溫的方式，白天控溫（25±2）℃，夜間（19±2）℃，相對濕度保持在65%。在播種后45 d 每盆分別補(bǔ)施100 mL Hoagland 營養(yǎng)液，最后于甜玉米收獲期，采集土壤并測定孢子含量，作為大田試驗(yàn)備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)處理 根據(jù)當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培方式優(yōu)化最佳施肥量為：氮肥（N）330 kg·hm?2、磷肥（以P2O5計(jì)）150 kg·hm?2、鉀肥（以K2O 計(jì)）225 kg·hm?2。試驗(yàn)共設(shè)7 個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，各小區(qū)面積67.5 m2（4.5 m×15 m），隨機(jī)區(qū)組排列。各處理磷、鉀肥施用量相同，施磷肥（以P2O5計(jì)）150 kg·hm?2、鉀肥（以K2O 計(jì)）225 kg·hm?2，磷肥品種為過磷酸鈣（P2O512%），鉀肥品種為硫酸鉀（K2O 50%）。氮肥使用尿素（N 46%），在基肥、苗期、拔節(jié)期分別以2∶3∶5 的比例施入，有機(jī)肥的主要養(yǎng)分為N 2%、P 1.5%、K 1.5%，有機(jī)肥和磷肥一次性基施，鉀肥在基肥和拔節(jié)期分別以5∶5 的比例施入。所有基肥按試驗(yàn)設(shè)計(jì)施用量起壟撒施旋耕。甜玉米幼苗移栽時(shí)每棵定殖增施7 g 變形球囊霉（F. versiforme）菌劑，種植密度為45 000 株·hm?2，起壟種植。其他的田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理。試驗(yàn)于2019 年9 月18 日移苗，12 月10 日收獲。

1.3.2 樣品采集方法 供試土壤、植株、根系樣品均于2019 年秋季甜玉米成熟期（12 月10 日）采集。供試植株（根系）樣品選取各處理中10 株長勢均勻的植株整株挖出（避免損壞根系），地上部分稱重、105 ℃下殺青30 min、75 ℃烘至恒重計(jì)算干物質(zhì)重量。挑選不同代表性部位的烘干樣品粉碎后測定地上部分全氮含量。地下部分（甜玉米根系）用清水洗凈后分為兩份，一份用于侵染率和侵染強(qiáng)度的測定，一份置于?80 ℃冰箱保存，用于測定氮代謝相關(guān)酶活性。按照Zhao 等[20]的方法采集根際土，均勻混合后分為兩份，一份2 000 g 室溫保存用于常規(guī)理化性質(zhì)以及孢子量測定；一份500 g 放入無菌密封袋后用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室?80℃保存，用于基因芯片檢測。

表 1 不同處理間施肥方案Table 1 Fertilization treatments

1.3.3 酶活性、土壤理化性質(zhì)、侵染率和孢子量測定

硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）采用北京索萊寶科技有限公司試劑盒進(jìn)行檢測[21]。常規(guī)理化性質(zhì)等環(huán)境因子按照鮑士旦土壤農(nóng)化分析方法測定[22]。土壤呼吸采用室內(nèi)密閉培養(yǎng)法進(jìn)行測定[23]；采用氯化鉀浸提流動(dòng)注射分析法對硝態(tài)氮和銨態(tài)氮進(jìn)行測定[23]。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行染色、脫色、制片、鏡檢[24]對菌根侵染率和強(qiáng)度進(jìn)行測定。土壤孢子量測定采用濕篩傾注蔗糖離心法[25]。

1.3.4 土壤氮利用率和侵染統(tǒng)計(jì) 氮素利用效率相關(guān)參數(shù)的計(jì)算方法[26?27]：

氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE，kg 籽粒/kgN）=（施氮區(qū)產(chǎn)量?對照產(chǎn)量）/施氮量

氮肥偏生產(chǎn)力（PFP，kg 籽粒/kgN）=施肥區(qū)鮮苞產(chǎn)量/施氮量

氮肥吸收利用率（NRE，%）=（施氮區(qū)地上部吸氮量?對照區(qū)地上部吸氮量）×100/施氮量

氮素生理利用率（NPE，kg 籽粒/kgN）=（施氮區(qū)鮮苞產(chǎn)量?對照區(qū)鮮苞產(chǎn)量）/（施氮區(qū)地上部吸氮量?對照區(qū)地上部吸氮量）

根系侵染率以及侵染強(qiáng)度的計(jì)算方法[28]：

根系中的菌根侵染率/%=有菌根根段數(shù)/總根段數(shù)×100

根系中的菌根侵染強(qiáng)度/%=（95×侵染率90%以上根段數(shù)+70×侵染率50%至90%的根段數(shù)+30×侵染率10%至50%的根段數(shù)+5×侵染率10%以下1%以上根段數(shù)+侵染率1%以下根段數(shù)）/總根段數(shù)×100

1.3.5 根際土微生物功能基因芯片 采用土壤DNA提取試劑盒（MinkaGene Soil DNA Kit）對甜玉米根際土壤樣品進(jìn)行總DNA 的提取，利用NanoDrop One檢測DNA 的完整性、純度和濃度。采用Cy3 染料和DNA 聚合酶I 對純化后的DNA 進(jìn)行標(biāo)記，采用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen, Valencia, CA,USA）純化標(biāo)記的DNA，置于Labconco Centrivap濃縮器中50 ℃干燥45 min，DNA 稀釋至相同濃度后在95 ℃下孵育5 min，并在42 ℃下進(jìn)行雜交16 h，將標(biāo)記的DNA 置于陣列上，然后在雜交站（BioMicro Systems, Inc., Salt Lake City, UT）將陣列預(yù)熱至42 ℃（5 min），最后用NimbleGen MS200 掃描儀進(jìn)行預(yù)處理和信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

圖表制作和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2010 和SPSS 20.0，施菌處理和有機(jī)無機(jī)配施水平及其交互作用的差異顯著性采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，不同處理之間的差異顯著性采用Duncan’s多重檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)（P＜0.05）。除趨勢對應(yīng)分析和不相似性分析使用R 軟件（R-3.2.2）進(jìn)行分析繪圖；RDA 分析和繪圖采用QIIME2 和ggplot2 包。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤氮素轉(zhuǎn)化及利用率分析

2.1.1 不同處理AMF 在甜玉米根際土壤中的定殖與侵染 如表2 所示，每個(gè)處理的甜玉米根系都有不同程度的AMF 侵染。單施菌肥CK+AMF 處理侵染率、侵染強(qiáng)度最高，對照CK 處理最低。CK+AMF處理侵染率、侵染強(qiáng)度分別達(dá)81.0%和45.34%。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理ORF20+AMF 處理孢子密度和侵染強(qiáng)度與OF、ORF10、ORF20、ORF10+AMF處理之間達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但侵染率無顯著差異（P＞0.05）。增施變形球囊霉配施有機(jī)肥處理 組（CK+AMF、 ORF10+AMF、 ORF20+AMF）中的AMF 孢子密度、侵染強(qiáng)度顯著高于相應(yīng)未施菌處理組（CK、OF、ORF10、ORF20），增施變形球囊霉能極顯著影響孢子密度和侵染強(qiáng)度（P＜0.001），且與有機(jī)無機(jī)肥配施存在正交互效應(yīng)（P＜0.05），有機(jī)無機(jī)配施組間無顯著差異。說明增施AMF 有助于提高根際土壤孢子量和侵染率，增加侵染強(qiáng)度。

2.1.2 不同處理甜玉米根際土壤氮素利用率 各處理間氮素養(yǎng)分吸收利用存在一定差異（表3）。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（ORF20+AMF、ORF10+AMF）的氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE）和氮肥偏生產(chǎn)力（PFP）顯著高于對應(yīng)未施菌處理組（ORF20、ORF10），氮肥吸收利用率表現(xiàn)為變形球囊霉配施處理ORF20+AMF 處理顯著高于ORF20 處理，氮素生理利用率表現(xiàn)為變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（ORF20+AMF、ORF10+AMF、CK+AMF）大于對應(yīng)不施菌處理組（ORF20、ORF10、CK），組間差異不顯著。綜合來看，ORF20+AMF 氮肥利用率最高，顯著高于包括優(yōu)化施肥的其他6 個(gè)處理。增施變形球囊霉和有機(jī)無機(jī)配施均極顯著影響氮肥農(nóng)學(xué)效率、氮肥偏生產(chǎn)力，但二者無顯著的交互效應(yīng)。

表 2 不同施肥處理對甜玉米孢子量、侵染率、侵染密度的影響Table 2 Spore quantity, infection rate, and infection density on sweet corn under treatments

2.1.3 不同處理對甜玉米根際酶活性影響分析 各處理與氮代謝相關(guān)的甜玉米根系硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性存在差異（表4）。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（ORF10+AMF、ORF20+AMF）硝酸還原酶（NR）活性顯著低于對應(yīng)未施菌處理組（ORF10、ORF20）。谷氨酸合酶（GOGAT）活性表現(xiàn)為變形球囊霉配施有機(jī)肥處理（ORF20+AMF、CK+AMF）顯著低于未施菌處理組（ORF20、CK）處理。變形球囊霉配施有機(jī)肥ORF20+AMF 處理的谷氨酰胺合成酶（GS）顯著高于未施菌處理ORF20。有機(jī)無機(jī)配施以及增施AMF 之間的交互作用表明，有機(jī)無機(jī)配施與增施變形球囊霉對硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性具有極顯著的正交互效應(yīng)（P＜0.001）。

表 3 不同施肥處理甜玉米氮利用率Table 3 Nutilization efficiency of sweet corn under treatments

表 4 不同施肥處理甜玉米根內(nèi)系氮代謝相關(guān)的酶活性Table 4 Activity of microbial N metabolizing enzymes in sweet corn under treatments

2.2 根際土微生物氮循環(huán)功能基因群落差異

7 個(gè)處理21 個(gè)樣品中共檢測到7 個(gè)氮循環(huán)功能亞類，包括固氮、氨化、硝化、反硝化、同化氮還原、異化氮還原和氨氧化作用（圖1）。7 個(gè)功能亞類強(qiáng)度表現(xiàn)為：反硝化＞同化氮還原＞氨化＞固氮＞異化氮還原＞硝化＞氨氧化。除氨氧化作用各處理間差異不顯著外，其他6 個(gè)氮循環(huán)亞類功能強(qiáng)度在各處理間均有顯著差異（P＜0.05）。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（CK+AMF、ORF10+AMF、ORF20+AMF）的6 個(gè)氮循環(huán)亞類功能強(qiáng)度整體上顯著高于對應(yīng)不施菌處理（CK、ORF10、ORF20），并且ORF20+AMF 處理的7 個(gè)氮循環(huán)亞類功能強(qiáng)度均為最高。

除趨勢圖對應(yīng)分析（DCA）結(jié)果表明（圖2），7 個(gè)處理甜玉米根際土壤氮循環(huán)微生物功能基因組間差異大于組內(nèi)差異。DCA 排序圖中，7 個(gè)處理分異為3 個(gè)集中區(qū)域，各區(qū)域內(nèi)的各處理在微生物氮循環(huán)功能上較為相近。其中，CK、OF 和ORF10 處理分異到一個(gè)區(qū)域，ORF20 和ORF10+AMF 處理分異為一個(gè)區(qū)域，CK+AMF 和ORF20+AMF 處理分異為一個(gè)區(qū)域。進(jìn)一步進(jìn)行各處理間微生物氮循環(huán)功能基因不相似性檢驗(yàn)，結(jié)果表明微生物功能基因結(jié)構(gòu)在各處理間具有極顯著的差異性（P＜0.001，表5）。

2.3 根際土微生物氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因特征

所有樣品共檢測到2 752 個(gè)氮循環(huán)基因，其中固氮基因439 個(gè)、氨化基因426 個(gè)、硝化基因82 個(gè)、反硝化基因1 263 個(gè)、同化氮還原285 個(gè)、異化氮還原189 個(gè)、氨氧化基因9 個(gè)。

各處理中土壤微生物氮循環(huán)基因強(qiáng)度組間差異如圖3 所示。同化氮還原基因共有NiR、narB、nasA、nirA和nirB等5 個(gè)基因，其中相對強(qiáng)度最大的是nasA；異化氮還原基因共有napA、nrfA兩個(gè)基因；固氮基因中有編碼固氮酶的nifH基因；氨化作用中的ureC、glnA、gdh基因，相對強(qiáng)度表現(xiàn)為glnA＜gdh＜ureC；硝化作用中的氨單加氧酶amoA、hao編碼基因；反硝化作用中的conrB、narG、nirK、norB、nosZ、nirS等7 個(gè)基因，其中narG相對強(qiáng)度最高，其次是nosZ、nirS、nirK，conrB相對強(qiáng)度最低。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理ORF10+AMF 的反硝化基因cnorB、norB、nirS與對應(yīng)不施菌處理間差異不顯著。但變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（CK+AMF、ORF20+AMF）處理的反硝化基因cnorB、norB、nirS顯著高于對應(yīng)不施菌處理組（CK、ORF20）；變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（ORF10+AMF、ORF20+AMF）硝化hao基因相對強(qiáng)度與對應(yīng)未施菌處理組（ORF10、ORF20）之間差異不顯著，其他同化氮還原基因、異化氮還原基因、氮固定基因、氨化作用基因均表現(xiàn)為變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（CK+AMF、ORF10+AMF、ORF20+AMF）顯著高于對應(yīng)未施菌處理組（CK、ORF10、ORF20）。

圖 1 不同處理亞類氮循環(huán)功能基因標(biāo)準(zhǔn)化相對信號(hào)強(qiáng)度Fig. 1 Relative signal intensity of normalized microbial N-cycling genes under treatments

圖 2 各處理土壤微生物氮代謝功能基因結(jié)構(gòu)DCA 排序圖Fig. 2 DCA ordination diagram on structure of N-metabolizinggenes in soil microorganisms

表 5 不同施肥處理間微生物氮循環(huán)功能基因不相似性檢驗(yàn)Table 5 Dissimilarity test on microbial N-cycling genes under treatments

2.4 不同處理間氮代謝功能基因豐度的變化

各處理中7 個(gè)亞類功能中的具體基因在整個(gè)氮循環(huán)中的變化如圖4 所示，CK+AMF 處理除同化氮還原基因nasA、NiR豐度比CK 處理呈顯著增加，其余各個(gè)亞類功能基因均是極顯著增加（P＜0.01）。較ORF10 處理，變形球囊霉配施有機(jī)肥處理ORF10+AMF 的氨化基因gdh、同化氮還原基因nasA、nirK、nirS、顯著降低了14.12%、12.50%、11.61%和7.14%。較ORF20 處理，變形球囊霉配施有機(jī)肥處理ORF20+AMF 除氨氧化基因hzo 相對豐度降低了20%，其他亞類功能均有上升或顯著上升。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理ORF20+AMF 處理反硝化基因nirK、nirS，以及異化氮還原基因napA基因顯著高于OF 處理。

2.5 環(huán)境因子對微生物群落氮循環(huán)基因的影響

利用氮循環(huán)功能基因強(qiáng)度與土壤環(huán)境因子數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行冗余分析（RDA）。本文共挑選了11 個(gè)環(huán)境因子，分別是NR、NiR、GS、GOGAT、pH、硝態(tài)氮（NN）、全氮（TN）、堿解氮（AN）、土壤呼吸（Soil R）、孢子量（MC）和有機(jī)碳（OM）。結(jié)果如圖5 所示，圖5（a）第一排序軸和第二排序軸分別解釋了74.1%和11.9%，圖5（b）第一排序軸和第二排序軸分別解釋了74.1%和11.9%，都較好地解釋了氮轉(zhuǎn)化基因強(qiáng)度與根際土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系。不同環(huán)境因子對基因標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度的影響不同。在不施變形球囊霉處理中，固氮基因nifH、氨化作用基因（gdh、glnA、ureC）、硝化作用基因（amoA）、反硝化作用基因（narG、nirk、norB、nosZ、nirS）、同化氮還原基因（NiR、narB、nasA、nirA、nirB）、異化氮還原基因（napA、nrfA）、氨氧化基因（hzo）與 土 壤 呼 吸 強(qiáng) 度（Soil R）、 GS 活 性、NiR 活性、pH 呈正相關(guān)關(guān)系，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；硝化作用基因（hao）、反硝化作用基因（cnorB）與 土 壤 呼 吸 強(qiáng) 度（Soil R）、GS 活 性、NiR 活性、pH、孢子量（MC）、速效氮含量（AN）呈正相關(guān)關(guān)系，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在增施變形球囊霉處理中，固氮基因（nifH）、氨化作用 基 因（gdh、ureC）、 硝 化 作 用 基 因（amoA、hao）、反硝化作用基因（cnorB、narG、nirk、norB、nosZ、nirS）、同化氮還原基因（narB、nasA、nirA、nirB）、異化氮還原基因（napA、nrfA）、氨氧化基因（hzo）與NiR 活性、侵染強(qiáng)度（IM）呈正相關(guān)關(guān)系，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；氨化作用基因（glnA）、同化氮還原基因（NiR）與GS 活性、全氮含量（TN）、堿解氮（AN）、亞硝酸還原酶（NiR）活性、侵染強(qiáng)度（IM）呈正相關(guān)關(guān)系，與其他理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖 3 不同施肥處理氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因標(biāo)準(zhǔn)化相對信號(hào)強(qiáng)度Fig. 3 Normalized relative signal intensity of microbial N-cycling genes under treatments

注：括號(hào)中指示了根際土N 基因豐度的百分比變化。以增施變形球囊霉處理為準(zhǔn)，基因豐度增加用紅色標(biāo)記；降低用綠色標(biāo)記；其中*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001 水平存在顯著差異。此處使用的GeoChip 版本沒有將灰色基因作為目標(biāo)，也沒有發(fā)現(xiàn)或未發(fā)現(xiàn)未注釋。Note: The percentage change of N gene abundance in rhizosphere soil is indicated in parentheses. Subject to the treatment of increased application of cystic mildew, the gene abundance is increased and marked with red; the decrease is marked with green; the *, **, *** indicate significant difference at 0.05, 0.01, 0.001 level, respectively. The version of GeoChip used here does not target the gray gene, nor has it been found or found. Found uncommented.

圖 5 氮循環(huán)功能基因和理化性質(zhì)的RDA 分析Fig. 5 RDA analysis on microbial N-cycling genes and physicochemical properties of soil under treatments

3 討論

3.1 增施AMF 對根際土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響

近年來，由于不合理施用氮肥使得農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中投入成本增加的同時(shí)肥料利用率降低。梁元振等[29]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)無機(jī)肥配施能有效提高氮素利用率，并且氮素利用率達(dá)40%以上。薛玉晨等[7]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥的施入能有效促進(jìn)煤礦復(fù)墾土壤氮素礦化，從而提高土壤氮素有效性。何躍軍等[30]研究表明接種AMF 能顯著提高宿主根系侵染率，使光皮樹的大田侵染率達(dá)61%。裘浪等[31]的研究表明接菌后的玉米大田侵染強(qiáng)度可達(dá)30%。上述研究與本研究結(jié)果一致，增施變形球囊霉處理組的侵染率、侵染強(qiáng)度以及孢子量均顯著大于未加菌處理組（P＜0.05）。趙乾旭等[16]和劉銘銘等[17]通過盆栽試驗(yàn)分別得出增施AMF能提高27.8%和19.51%的氮肥吸收利用率。本研究與上述學(xué)者具有相似性，增施變形球囊霉處理ORF10+AMF 和ORF20+AMF 處理氮肥吸收利用率分別達(dá)36.39%和44.75%，比對應(yīng)不加菌處理分別提高5.17%和11.11%，說明增施變形球囊霉配施有機(jī)肥能有效提高氮素利用率。氮素利用率總體規(guī)律為：增施變形球囊霉處理組（ORF10+AMF、ORF20+AMF）＞OF處理＞有機(jī)無機(jī)配施處理組（ORF10、ORF20）。其 中ORF20+AMF 效 果 最佳，相對于優(yōu)化施肥OF 處理，氮肥農(nóng)學(xué)效率、氮肥偏生產(chǎn)力、氮肥吸收利用率和氮肥生理利用率分別提高了31.15%、28.08%、6.95%和10.41%。

硝酸還原酶（NR）是植株硝態(tài)氮還原同化中的第一個(gè)酶，也稱為限速酶，其活性大小直接影響植株氮代謝強(qiáng)弱，而谷氨酰胺合成酶（GS）處于氮代謝的中心位置，是將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮過程中的關(guān)鍵酶。Tian 等[32]研究表明AMF 是一種叢枝菌根真菌體內(nèi)存在和植物一樣的GS-GOGAT 氮代謝途徑，在這一代謝過程中能促進(jìn)宿主對土壤氮素的吸收利用。并且Hawkins 等[33]研究表明增施AMF 能提高宿主植物硝酸還原酶活性，這與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)增施變形球囊霉能顯著增加甜玉米根系谷氨酰胺合成酶（GS）和硝酸還原酶（NR）活性，從而增強(qiáng)甜玉米對氮素的吸收利用和轉(zhuǎn)化，且增施變形球囊霉與有機(jī)無機(jī)配施具有極顯著的正交互效應(yīng)（P＜0.01）。Hodge 等[34]研究也表明增施AMF 能提高宿主氮同化能力，通過大量根外菌絲網(wǎng)絡(luò)，擴(kuò)大根系吸收營養(yǎng)面積，尤其是增強(qiáng)土壤N 庫吸收能力，在滿足自身生長后能更高效幫助宿主吸收轉(zhuǎn)運(yùn)氮素。徐明崗等[35]和張麗等[36]通過對有機(jī)無機(jī)肥配施下的稻田氮素轉(zhuǎn)化與利用表明有機(jī)無機(jī)配施含有一定的碳源，并且供氮緩慢而持久。在本試驗(yàn)中有機(jī)無機(jī)配施能為共生體提供一定的碳源以及有機(jī)無機(jī)氮。共生體在滿足自身生長后成為宿主的一個(gè)重要N 庫，能增強(qiáng)宿主氮同化能力，提高宿主氮素利用率，最終達(dá)到減肥增效的作用。

3.2 增施AMF 對根際土壤氮循環(huán)微生物功能基因的影響

微生物功能基因芯片主要獲取大量微生物群落參與生物化學(xué)過程的可靠信息，尤其是微生物功能基因。從DCA 排序圖以及不相似檢驗(yàn)可知，增施變形球囊霉能影響氮循環(huán)代謝功能基因。本研究中7 個(gè)處理21 個(gè)樣品共檢測出7 個(gè)亞類氮循環(huán)功能，分別是反硝化、同化氮還原、氨化、固氮、異化氮還原、硝化、氨氧化作用。7 個(gè)功能亞類功能強(qiáng)度表現(xiàn)為：反硝化＞同化氮還原＞氨化＞固氮＞異化氮還原＞硝化＞氨氧化。除氨氧化作用組間差異不顯著外，增施變形球囊霉配施有機(jī)肥處理在其他6 個(gè)氮循環(huán)亞類功能強(qiáng)度表現(xiàn)為ORF10≈ORF20＜ORF10+AMF＜ORF20+AMF 處理。儲(chǔ)成等[37]通過32 年定點(diǎn)試驗(yàn)指出有機(jī)質(zhì)的提升能夠顯著增加amoA基因以及反硝化基因narG和nirS，提升氨化作用基因glnA和gdh豐度。但在本研究中有機(jī)肥替代無機(jī)肥后并沒有顯著上升，其原因可能是由于施肥年限較短所致。但增施變形球囊霉有助于提高除氨氧化功能的其他6 個(gè)氮循環(huán)亞類功能強(qiáng)度。氮代謝基因的強(qiáng)度和豐度在一定程度上能夠表明氮代謝的強(qiáng)度，微生物群落的豐度在一定程度上也能反映基因的表達(dá)強(qiáng)度。Veresoglou 等[38]指出叢枝菌根真菌能夠顯著改變菌根固氮基因群落豐度，從而改變固氮生物過程。即叢枝菌根真菌具有固氮作用以及有助于宿主吸收營養(yǎng)元素。本研究結(jié)果從基因?qū)用嬷苯佑∽C了這一點(diǎn)，施菌有助于增加氮循環(huán)亞類功能的整體強(qiáng)度。增施變形球囊霉對于氨氧化基因的影響與Cavagnaro等[39]在田間原位條件下番茄進(jìn)行AMF 接種研究結(jié)果一致，接種AMF 不會(huì)顯著改變土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度。而Veresoglou 等[38]通過盆栽研究結(jié)果指出，增施AMF 易造成土壤中氨氧化菌豐度降低。Veresoglou等[13,38]通過對玉米接種AMF 結(jié)果表明反硝化細(xì)菌群落降低，顯著降低了土壤中AOA和AOB 的豐度，容易造成硝化速率下滑，并且還指出接種AMF 容易改變根際土壤nirK基因的群落組成，從而影響反硝化過程。變形球囊霉配施有機(jī)肥處理組（ORF10+AMF、ORF20+AMF）硝化作用hao基因相對強(qiáng)度與對應(yīng)未施菌處理組（ORF10、ORF20）之間差異不顯著，但增施變形球囊霉能顯著增加反硝化narG、nirK、nosZ、nirS的相對豐度。因此接種AMF 對于土壤氨氧化微生物功能基因并沒有得出一致結(jié)論，造成結(jié)果差異的原因可能是大田中微生物系統(tǒng)比盆栽更復(fù)雜，盆栽試驗(yàn)易于控制變量。

從整體氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因豐度變化可知，CK+AMF 處理相較于CK 處理各個(gè)氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因均有顯著或極顯著提升，增加幅度最大。這主要是由于AMF 在土壤氮素匱乏時(shí)更易與宿主形成菌根共生體，對周圍氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)作用更強(qiáng)[40?41]，AMF 會(huì)吸收有機(jī)氮以提供自身和宿主生長[42]，增施變形球囊霉（摩西管柄囊霉）能改善植物的氮素營養(yǎng)狀況[43]。但從實(shí)際應(yīng)用考慮，ORF20+AMF 處理是適于推廣的化學(xué)氮肥減施增效方案，其氮循環(huán)功能基因豐度顯著高于ORF10+AMF。這可能是由于AMF自身生長需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，而接種后根系分泌的有機(jī)碳化合物降低使得反硝化細(xì)菌數(shù)量降低[44]。ORF20+AMF 處理較高的有機(jī)質(zhì)含量能同時(shí)滿足反硝化細(xì)菌以及叢枝菌根自身生長。并且在ORF20+AMF處理中氮循環(huán)功能基因豐度高于OF 處理。所以，就甜玉米生產(chǎn)而言，ORF20+AMF 施肥處理比OF 處理能更好地驅(qū)動(dòng)土壤氮素循環(huán)向植物氮高效利用的途徑轉(zhuǎn)化。

增施變形球囊霉和未施菌處理均解釋了86.0%的氮循環(huán)功能基因與環(huán)境因子的關(guān)系，說明所選的環(huán)境因子能較好解釋氮循環(huán)功能基因與環(huán)境因子間的相關(guān)程度。增施變形球囊霉處理組的氮循環(huán)功能基因主要受NiR 活性、侵染強(qiáng)度（IM）、GS 活性、全氮含量（TN）、堿解氮（AN）的影響；而未施菌處理組主要受土壤呼吸強(qiáng)度（Soil R）、GS 活性、NiR 活性、pH 的影響。儲(chǔ)成等[37]學(xué)者提出pH 和有機(jī)碳是影響氮循環(huán)功能基因的最主要因子。羅蓉[45]研究也表明有機(jī)碳能顯著影響氮循環(huán)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。本研究表明增施變形球囊霉能夠提高甜玉米的侵染強(qiáng)度，并且能顯著影響氮循環(huán)功能基因。

4 結(jié)論

（1）變形球囊霉能有效提高甜玉米根際侵染率，增施變形球囊霉處理組的侵染率強(qiáng)度以及孢子量均顯著大于未加菌處理組。

（2）變形球囊霉配施有機(jī)肥可顯著調(diào)增同化氮還原基因（NiR、narB、nasA、nirA、nirB）、異化氮還原基因（napA、nrfA）、氮固定基因（nifH）、氨化作用基因（ureC）相對強(qiáng)度，驅(qū)動(dòng)土壤氮素循環(huán)向植物氮高效利用的途徑轉(zhuǎn)化，提高氮肥農(nóng)學(xué)效率（NAE）、氮肥偏生產(chǎn)力（PFP）、氮肥吸收利用率（NRE），變形球囊霉配施有機(jī)肥可作為一種化學(xué)氮肥減施增效的模式進(jìn)行推廣應(yīng)用。