李亞莉，侯麗媛，董艷輝，王育川，王亦學

（1.晉中學院生物科學與技術系，山西晉中030619；2.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太原030031）

在雜交小麥的育種研究中，將小麥族內的野生親緣種中豐富的細胞質通過核置換回交的方法轉移到栽培小麥，創(chuàng)制出的核質雜種小麥集純系育種和雄性不育雜種優(yōu)勢2種方法的優(yōu)點，可以加快育種效率、拓寬小麥品種改良和雜種優(yōu)勢的遺傳基礎，同時也是開展核質互作遺傳關系和細胞質遺傳機制研究的理想材料[1]。目前小麥族內已有100多個種的細胞質通過這個方法向普通小麥轉移。K型不育系是將普通小麥的細胞核導入粘果山羊草的細胞質中創(chuàng)制而成，在育種實踐中，后代產生頻率不等的單倍體，嚴重制約K型不育系在小麥育種中的應用，雖然后代的農藝特征無明顯的負作用[2]，但是對于利用K型不育系配制雜交種來說，后代產生頻率不等的單倍體是一個不利因素。進一步的研究發(fā)現，由于正常的1BS染色體臂被黑麥的1RS染色體臂代換，1RS染色體臂上的基因與特定的異源細胞質互作產生不育[3]，推測可能在組培過程中，1BL/1RS易位染色體上的基因能加速胚胎和愈傷組織的生長，從而提高由小孢子生成單倍體的頻率[1，4]。因此，研究核質互作遺傳效應高比例的誘導小麥單倍體的機制，有利于拓展異源細胞質誘導小麥單倍體技術在小麥育種實踐中的應用價值。

在細胞有絲分裂和減數分裂過程中，著絲粒區(qū)特異的組蛋白H3（CenH3）與動粒蛋白結合，在紡錘絲的牽引下正確移動至細胞兩極[5]。著絲粒組蛋白H3發(fā)生某些修飾或者突變從而導致染色體錯分裂，產生非整倍體或者單倍體子代[6]。著絲粒DNA序列一般由夾雜排列的衛(wèi)星DNA串聯重復陣列（tandem repeat，TR）和著絲粒專一的反轉錄轉座子（centromere retrotransposons，CRs）構成。著絲粒組蛋白存在于整個細胞周期中，通過鑒別與著絲粒組蛋白相互作用的DNA序列可確定功能著絲粒的邊界和大小[7]。著絲粒反轉錄轉座子也能反過來定位包含著絲粒組蛋白的核小體的分布方式[8]，甚至在著絲粒組蛋白失活或者缺失時，由于密集分布的反轉錄轉座子替代著絲粒組蛋白的功能協(xié)助染色體正確分離[9-10]，二者間相互作用確保了染色體正確分離，由此可見，著絲粒DNA序列在指導染色體正確分離的過程中有著重要作用，著絲粒DNA序列雖然功能上高度保守，但在序列組成水平上卻高度不保守，這也成為著絲粒研究中的一個未解之謎[11]。

本研究應用熒光原位雜交（FISH）和基因組原位雜交（GISH）檢測K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系的染色體組成，分析不同材料中染色體組成的差異；其次將K型不育系及其保持系配制雜交組合，應用FISH、GISH技術檢測后代的染色體組成，探討不同細胞質中1BL/1RS易位染色體和后代產生單倍體的相關性；最后將K-Salmon分別和中國春、H4104配制雜交組合，進一步分析K-Salmon的雜交后代中高頻率產生單倍體的機制，為進一步探討著絲粒反轉錄轉座子在染色體正確分離和穩(wěn)定遺傳中的作用機制提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為小麥K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系和中國春、H4104易位系，均由中國科學院遺傳研究所韓方普教授提供。

1.2 試驗方法

試驗于2017—2019年先后在中國科學院遺傳研究所和山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心進行。

1.2.1 中期染色體的制備 根尖細胞中期染色體的制備、探針標記方法以及原位雜交程序均按照HAN等[12]描述的方法進行。首先，每份材料中分別選取約20粒種子，將挑選好的籽粒飽滿的種子在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待根長長到2～3 cm時，剪取生長旺盛的根尖，用果膠酶和纖維素酶的混合溶液37℃消化50 min，然后用70%的酒精洗2次，搗碎，離心，100%的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位雜交技術 植物總DNA的提取采用CTAB法[13]，利用微量紫外分光光度計檢測樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋至終濃度為100 ng/μL。

原位雜交程序按照HAN等[12]描述的方法進行，在GISH分析中，提取中間偃麥草的基因組DNA，用fluorescein-12-dUTP標記為綠色，小麥的著絲粒逆轉錄轉座子用Texas red-5-dCTP標記為紅色，用中國春基因組DNA作為封阻；在FISH分析中，pAs1探針的信號標記為紅色，pAWRC.1探針的信號標記為綠色。細胞學鏡檢采用OLYMPUSBX60熒光顯微鏡觀察，用Photo-metrics SenSys CCD成像。

2 結果與分析

2.1 細胞學篩查K型不育系材料的染色體組成分析

在育種實踐中，將普通小麥的細胞核導入粘果山羊草（Aegilops caudata）的細胞質中，獲得K型細胞質雄性不育系，在利用K型不育系配制雜交種時，檢測到后代有頻率不等的單倍體產生，因而，嚴重制約K型雄性不育系在生產中廣泛應用。為此，本試驗檢測K型不育系的染色體組成發(fā)現，雖然K型細胞質能使普通小麥Salmon出現高達80%的單倍體，但后代的農藝特征無明顯的負作用[2]，這是迄今為止任何單倍體育種技術都難以比擬的。而且這樣誘導的單倍體種子，一般均能正常發(fā)芽，生長發(fā)育良好，加倍方便[14]。為此，本試驗深入研究不同K型不育系的染色體組成及著絲粒的特點。首先，采用GISH和順序FISH的方法檢測不同K型不育系的染色體組成。以重復序列pAs1和黑麥基因組DNA為探針進行GISH、FISH分析（圖1）。

在12份材料中檢測到只有YM3和YM3B不含1BL/1RS易位染色體，其余所有材料均含有1BL/1RS易位染色體，同時應用重復序列pAs1和黑麥重復序列為探針進行FISH分析，結果表明，1BL/1RS易位染色體的著絲粒區(qū)域出現2個信號，小麥和黑麥著絲粒DNA序列的信號均被檢測到，檢測結果和前期關于1BL/1RS易位染色體著絲粒的組成和結構特點一致[15-16]，1BL/1RS易位染色體進入粘果山羊草的細胞質后，染色體組成未發(fā)生改變。對比幾個K型不育系材料的染色體組成可以發(fā)現，按是否含有1BL/1RS易位染色體將K型不育系分為含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系和不含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系；在育種實踐中研究發(fā)現，含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系雜交后代會出現一定比例的單倍體，而不含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系的雜交后代幾乎不產生單倍體。因此，1BL/1RS易位染色體可能在K型不育系誘導單倍體產生的過程中起了重要的作用。

2.2 細胞學篩查K型不育系雜交后代的染色體組成分析

在小麥單倍體育種研究中，通過對單倍體的誘導和加倍，植株快速純合，有效縮短育種周期，提高育種效率，是小麥育種中快速有效的方法之一。然而，在育種實踐中，無論體內誘導還是離體培養(yǎng)，獲得單倍體的誘導率和加倍率均不足10%，嚴重制約小麥單倍體育種在實踐中的應用價值。在創(chuàng)制雜種小麥的育種實踐中，將小麥的細胞核導入粘果山羊草的細胞質后，意外發(fā)現后代產生頻率不等的單倍體，有的K型不育系單倍體頻率甚至達到80%[4]。為了進一步研究K型不育系和保持系雜交后代的染色體組成，本研究配制了6種雜交組合，每個雜交組合的后代檢測35粒左右，采用GISH和順序FISH的方法檢測這6種雜交組合后代的染色體組成。后代染色體組成情況如表1所示。

表1 K型不育系不同雜交組合的后代染色體組成%

由表1可知，YM3和YM3B的雜交組合不產生單倍體和雙生苗，可以在雜交小麥選育中廣泛應用。YN1、YN1B和YJ3、YJ3B雜交組合產生一定比例的單倍體后代，但是未發(fā)現有雙生苗的情況。而K-Salmon和Salmon的雜交組合中，后代不僅有正常的整數倍體和單倍體，還發(fā)現有雙生苗的情況，而且比例較高。于是，本研究進一步配制雜交組合K-Salmon和H4104（含有1BL/1RS易位染色體）、中國春的雜交組合，檢測后代的染色體組成。結果表明，雜交后代中出現相似比例的單倍體和雙生苗，并進一步檢測單倍體和雙生苗中1BL/1RS易位染色體著絲粒的組成特點，如圖2所示，單倍體和雙生苗中的1BL/1RS易位染色體著絲粒組成和小麥細胞質中的1BL/1RS易位染色體的融合著絲粒一致（圖2），小麥著絲粒DNA和黑麥著絲粒DNA均被檢測到。

3 結論與討論

在育種實踐中，將普通小麥的細胞核導入粘果山羊草的細胞質中，獲得的細胞質雄性不育系在雜交小麥的育種中起重要作用。然而，在利用K型不育系配制雜交種時，因后代出現比例不等的單倍體制約K型雄性不育系在生產中的廣泛應用。隨后的研究發(fā)現，雖然K型細胞質能使普通小麥出現較高比例的單倍體，但后代的農藝特征無明顯的負作用[2]，這是迄今為止任何單倍體育種技術都難以比擬的，而且這樣誘導的單倍體種子，一般均能正常發(fā)芽，生長發(fā)育良好，加倍方便[14]。1BL/1RS易位系是小麥育種中應用最多、最成功的易位系，將黑麥1RS染色體片段攜帶的抗白粉病、銹病等多種病害及豐產、廣適性等優(yōu)良性狀的基因轉移到小麥中。在前期的研究中發(fā)現，1BL/1RS易位染色體在六倍體小麥背景中能穩(wěn)定遺傳[15-16]，通過對山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心小麥課題組收集的近110份含1BL/1RS易位染色體的小麥材料，發(fā)現在不同細胞質中易位染色體的融合著絲粒均由小麥著絲粒組蛋白H3負責招募小麥和黑麥的部分著絲粒DNA序列[15]。為了深入分析K型不育系中1BL/1RS易位染色體在雜交后代中的作用機制，本研究篩查了10份K型不育系及其后代的染色體組成情況，發(fā)現不含1BL/1RS易位染色體的K型不育系和保持系雜交后代中沒有單倍體子代，而含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系和保持系雜交后代中出現一定比例的單倍體，特別是一種含有1BL/1RS易位染色體的K-Salmon不育系和保持系雜交后代中出現更高比例的單倍體，同時還有一定比例的雙生苗，并應用FISH和GISH檢測發(fā)現，1BL/1RS易位染色體無論在單倍體還是雙生苗中，染色體和著絲粒的組成沒有發(fā)生改變，由此可見，1BL/1RS易位染色體的著絲粒在K型不育系誘導單倍體的過程中起重要的作用。研究1BL/1RS易位染色體和K型細胞質的互作遺傳效應高比例誘導小麥單倍體的機制，可以進一步拓展異源細胞質誘導小麥單倍體技術在小麥育種實踐中的應用價值。

研究發(fā)現，著絲粒和特異性的蛋白結合成動粒，在細胞分裂過程中成為紡錘絲牽引附著的主要位點[5]。著絲粒組蛋白H3與典型組蛋白H3結構不同，它是較早發(fā)現的功能著絲粒的核心蛋白，其N末端在長度和氨基酸組成方面變異程度較高[17-20]。著絲粒組蛋白H3不僅能導致細胞有絲分裂紊亂，還和外源染色體在寄主基因組中的去留有聯系[15]。著絲粒DNA序列是植物甚至真核生物進化最快的序列之一，即便在親源關系非常近的物種中，著絲粒的DNA序列長度或組成可能完全不同。通過對著絲粒序列的分析，初步認為著絲粒序列結構主要由重復序列和反轉錄轉座子組成，反轉錄轉座子的擴增和插入又會產生新的重復序列[21]。相比衛(wèi)星重復序列，反轉錄轉座子更保守一些，如：Ty3-gypsy是著絲粒專一的反轉錄轉座子家族[22]，著絲粒反轉錄轉座子能夠定位包含著絲粒組蛋白H3的核小體的分布方式[23]，甚至在CenH3失活或者缺失時，染色體依然能正常分離[24]，推測著絲粒反轉錄轉座子起主要作用，這種推測在隨后關于Holocentricity的研究中得到證實，在動物和植物中都發(fā)現部分物種中著絲粒缺失著絲粒組蛋白H3，由于密集分布的反轉錄轉座子替代著絲粒組蛋白H3的功能協(xié)助染色體正確分離。在小麥中，基因克隆和定位研究發(fā)現，CenH3基因位于第一同源群[25]，1BL/1RS易位染色體的著絲粒由小麥和黑麥的部分著絲粒DNA序列構成[16，26]，易位染色體在普通小麥中能正確分離、穩(wěn)定遺傳，但是，在K型細胞質中卻高頻誘導產生單倍體。因此，研究著絲粒序列協(xié)同著絲粒組蛋白H3指導1BL/1RS易位染色體在K型細胞質中分離，探究其作用方式為揭示異源細胞質誘導產生單倍體的機制提供理論支持。本研究應用FISH和GISH技術，篩查6個雜交組合的親本及其后代的染色體組成規(guī)律，研究發(fā)現，所有檢測樣品中易位染色體均為融合著絲粒；篩查配制的雜交組合后代單倍體率，發(fā)現只有含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系才產生單倍體，特別是K-Salmon不育系無論和保持系還是其他含有1BL/1RS易位染色體的小麥雜交，都產生比例很高的單倍體，包括和中國春雜交，單倍體率也很高，但是本研究各種雜交組合的單倍體率沒有篩查到80%以上的情況，推測可能是研究中采用的不育系材料為高代材料，在不斷的保種過程中1BL/1RS易位染色體的著絲粒DNA序列和K型細胞質逐漸共存協(xié)同作用指導易位染色體分離。

然而，由于著絲粒結構特殊，指導染色體的分離不僅和著絲粒組蛋白H3有關，還和著絲粒DNA有密切關系，著絲粒區(qū)域的DNA序列組成及其功能的解析至今依然是研究難點之一[24]。1BL/1RS易位染色體在小麥背景中能穩(wěn)定遺傳，但是異質到K型細胞質后產生比例不等的單倍體，由此可見，黑麥的部分染色體片數和K型細胞質的互作是后代產生高比例單倍體和雙生苗的重要原因，但是黑麥染色體片斷以及著絲粒DNA序列的組成等方面是否發(fā)生變化還需要結合CHIP等技術做進一步的遺傳和表觀遺傳學研究。其次，在一些模式植物的研究中發(fā)現，由于父本著絲粒組蛋白H3在合子中失活而逐漸丟失產生單倍體后代，然而關于著絲粒DNA何時參與或者取代著絲粒組蛋白H3指導染色體分離的研究卻很少[27]。因此，今后對易位染色體著絲粒DNA序列做進一步遺傳和表觀遺傳分析，將有助于理解著絲粒DNA序列指導染色體分離的機制。