余凱翔，楊征敏，周 兵，徐凌鋒，李書琰，陳滬飛，王 偉

(1.浙江大學(xué) 原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058；2.上海啟甄同位素標(biāo)記合成研究中心，上海 201403)

毒死蜱(Chlorpyrifos)是美國(guó)陶氏化學(xué)于1965年成功開發(fā)并商品化的乙酰膽堿酯酶抑制劑，屬硫代磷酸酯類非內(nèi)吸性廣譜殺蟲殺螨劑。它具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，能有效防治多種作物的地上和地下害蟲，是一種具有中等毒性、低殘留的農(nóng)藥品種。盡管毒死蜱的專利早已過期，但因其具有其廣譜、高效等優(yōu)點(diǎn)，因而毒死蜱仍然是世界殺蟲劑市場(chǎng)的主流品種之一。2007年，我國(guó)全面禁止使用5種高毒有機(jī)磷殺蟲劑，毒死蜱迅速搶占這些禁用品種留下的市場(chǎng)空間。迄今，毒死蜱依然是我國(guó)應(yīng)用最廣泛的有機(jī)磷類殺蟲殺螨劑之一[1]。

伴隨著毒死蜱長(zhǎng)期持續(xù)、大量使用而產(chǎn)生的慢性毒性、生態(tài)環(huán)境等與人體健康密切相關(guān)的系列問題引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者和多國(guó)政府部門的關(guān)注，人們對(duì)于該殺蟲劑可能引起的潛在危害而擔(dān)憂[2-5]。放射性同位素示蹤法是深入開展上述問題研究進(jìn)而評(píng)判毒死蜱安全性的常用方法之一[6-13]，而放射性同位素碳-14標(biāo)記毒死蜱是示蹤研究中理想的示蹤劑。從毒死蜱的化學(xué)穩(wěn)定性、代謝穩(wěn)定性、毒理學(xué)重要性和示蹤試驗(yàn)的要求等角度考慮，具有芳香性的吡啶環(huán)是毒死蜱分子中理想的標(biāo)記位置。文獻(xiàn)報(bào)道了一種吡啶環(huán)碳-14標(biāo)記毒死蜱(O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C2]吡啶基)硫代磷酸酯)，但該標(biāo)記物的制備條件苛刻，須使用劇毒的[14C]氰化鉀和氯氣，且氯氣必須在高溫高壓(高壓釜)下反應(yīng)，因而實(shí)驗(yàn)操作具有較大的潛在危險(xiǎn)性[14]。為克服該法不足，筆者設(shè)計(jì)并制備了一種替代該標(biāo)記物的吡啶環(huán)碳-14標(biāo)記毒死蜱(1,O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C]吡啶基)硫代磷酸酯[15])，標(biāo)記物(1)合成的條件溫和，操作安全、可行性高。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

本研究中放射合成工作在上海啟甄同位素標(biāo)記合成研究中心完成；Varian 400 MHz核磁共振儀(以TMS為內(nèi)標(biāo))：美國(guó)瓦里安公司；Mini-Scan TLC薄層放射性掃描儀：美國(guó)BioScan公司；FSA：美國(guó)Aim Research公司；Waters Alliance e2695 HPLC-Acquity Qda MS/2489 UV高效液相色譜-紫外光譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)和Waters 2545 HPLC-2998 PDA制備型液相色譜系統(tǒng)(配備Waters fraction collector Ⅲ)：美國(guó)Waters公司；Agilent 7890B GC-5977B MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：美國(guó)Agilent公司；Tri-Carb 4910TR液體閃爍測(cè)量?jī)x：美國(guó)PE公司；Typhoon FLA9500 IP多功能激光成像儀：美國(guó)GE公司；Milli-Q Reference S. Kit(18.2 MΩ/cm,25 ℃)超純水制備系統(tǒng)：默克化工技術(shù)(上海)有限公司；Sartorius BSA22 4S-CW(1 mg)和BT25S(0.01 mg)電子天平：德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 主要試劑

[14C]碳酸鋇(比活度55.3 mCi/mmol，放化純度99.9%，化學(xué)純度98%)：美國(guó)ARC公司；2,5-二苯基噁唑(PPO)：高效液相色譜(HPLC)純度大于99.0%，日本TCI公司；1,4-雙(5-苯基-2-噁唑)苯(POPOP)：HPLC純度大于99.0%，日本TCI公司；Optiphase HiSafe 3閃爍液：美國(guó)PE公司；HPLC和HPLC-MS用甲醇：分別為色譜級(jí)和質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司；其他試劑均為市售分析純，試劑按照文獻(xiàn)[16]方法純化。

2 實(shí)驗(yàn)方法

毒死蜱(Chlorpyrifos)化學(xué)結(jié)構(gòu)圖示于圖1，放射性同位素碳-14標(biāo)記毒死蜱(1)的合成路線示于圖2。

圖1 毒死蜱和兩種碳-14標(biāo)記毒死蜱(1和2；*標(biāo)示碳-14標(biāo)記位點(diǎn))Fig.1 Chlorpyrifos and its carbon-14 labelled counterparts (1&2, *indicates carbon-14 labelled sites)

圖2 放射性同位素碳-14標(biāo)記毒死蜱(1)的合成路線(*標(biāo)示碳-14標(biāo)記位點(diǎn))Fig.2 Synthetic route of radioisotope carbon-14 labelled chlorpyrifos (1, *indicates carbon-14 labelled sites)

2.1 放射性同位素標(biāo)記化合物的制備

2.1.15-芐氧基[羰基-14C]戊酸(5) 利用自制的第五代微型集成式放射性二氧化碳反應(yīng)裝置制備標(biāo)記物(5)[7,17]。投料量和反應(yīng)條件：(A)制備格氏試劑(4)：依次向二氧化碳反應(yīng)器中加入表面光亮的鎂屑(41 mg)、4-溴丁基芐基醚(3)的無水四氫呋喃(THF)溶液(5.1 mL，0.65 mol/L)和碘的無水THF溶液(0.5 mL，0.2 mol/L)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)引發(fā)后控制加料過程中反應(yīng)溫度為40～50 ℃；加畢室溫?cái)嚢? h。(B)格氏反應(yīng)：在二氧化碳發(fā)生器中分別加入[14C]碳酸鋇(291.2 mg,55.3 mCi/mmol)和脫氣濃硫酸(4 mL)；在-10 ℃進(jìn)行格氏反應(yīng)。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序啟動(dòng)微型集成式反應(yīng)裝置進(jìn)行反應(yīng)[7,17]。GC-MS和氣體放射性檢測(cè)表明，反應(yīng)裝置運(yùn)行2 h后[14C]CO2徹底消耗。向二氧化碳反應(yīng)器中反應(yīng)液里加入飽和氯化銨溶液(30 mL)，減壓脫除該混合液中THF，殘余液以稀鹽酸(1 mol/L，下同)酸化(pH 2～3)，二氯甲烷(DCM)萃取(35 mL×5)；萃取液以氫氧化鈉溶液(1 mol/L)反萃取(30 mL×3)，酸化反萃取液(pH 2～3)，DCM萃取(35 mL×5)，萃取液經(jīng)飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得油狀物[18]。同法重復(fù)該反應(yīng)3次；共得油狀物(5,1 140.6 mg,299.8 mCi,92%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)：δ12.03(br,1H),7.63-6.98(m,5H),4.44(s,2H),3.49-3.39(m,2H),2.30-2.15(m,2H),1.66-1.42(m,4H)。ESI-MSm/z:211[M+H]+。

2.1.25-芐氧基[羰基-14C]戊酰胺(6) 在氬氣保護(hù)和0 ℃下，將5-芐氧基[羰基-14C]戊酸(5,227.4 mg)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF,50 μL)溶于無水DCM(3 mL)中，攪拌；緩慢滴入草酰氯(418 mg)。滴畢攪拌10 min；升至室溫，攪拌1 h。減壓蒸除反應(yīng)液中過量草酰氯，殘余物以無水DCM(3 mL)稀釋。在5～10 ℃下，將稀釋的酰氯溶液緩慢滴入氨飽和的干燥二氧六環(huán)(diox)溶液(2 mL)中，滴畢攪拌30 min；升至室溫，攪拌3.5 h。在線放射性高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-FSA/PDA/MS,簡(jiǎn)稱HFPM)監(jiān)測(cè)表明，原料(5)完全轉(zhuǎn)化。向反應(yīng)液中加水(30 mL)，減壓脫除有機(jī)溶劑，向殘余液中加入飽和碳酸氫鈉溶液(15 mL)，以乙酸乙酯萃取(30 mL×5)，萃取液經(jīng)飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥、過濾、濃縮得淡黃色固體。同法重復(fù)該反應(yīng)4次；共得淡黃色固體(6,943.6 mg,249.4 mCi,84%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ7.37-7.12(m,6H),6.65(s,1H),4.42(s,2H),3.48-3.33(m,2H),2.10-1.92(m,2H),1.64-1.29(m,4H)。ESI-MSm/z:210[M+H]+。

HPLC分析條件：SunFire C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流速1.00 mL/min；波長(zhǎng) 254 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 5 μL；梯度洗脫(min/%A)控制：0/10,1/10,15/100,20/100,25/10,30/10，A為甲醇，B為0.05%甲酸水溶液。下文如無說明，HPLC分析均使用此條件。

2.1.35-羥基[羰基-14C]戊酰胺(7) 在氬氣保護(hù)下，將5-芐氧基[羰基-14C]戊酰胺(6,184.6 mg)、10%Pd/C(17 mg)和甲醇(4 mL)混合，反復(fù)抽真空-氫氣置換五次，向系統(tǒng)鼓入氫氣，在室溫常壓下攪拌。HFPM監(jiān)測(cè)顯示，攪拌2 h后原料(6)反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物過濾，以甲醇淋洗濾餅5次，減壓濃縮濾液得白色固體[19]。同法重復(fù)該反應(yīng)4次；共得白色固體(7,499.3 mg,230.7 mCi,94%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ7.24(br,1H),6.70(br,1H),3.43-3.32(m,1H),2.10-1.86(m,1H),1.64-1.28(m,1H)。ESI-MSm/z:120[M+H]+。

2.1.4[羰基-14C]戊二酰亞胺(8) 將硅膠(100～200目，720 mg)、氯鉻酸吡啶鎓鹽(PCC,680 mg)、5-羥基[羰基-14C]戊酰胺(7,125.7 mg)和無水THF(5 mL)的混合物超聲震蕩(內(nèi)溫<40 ℃)[20]。HFPM監(jiān)測(cè)表明，反應(yīng)體系超聲2.5 h后(7)轉(zhuǎn)化完全。將反應(yīng)混合物過濾，濾餅以THF淋洗3次，濃縮，濃縮物經(jīng)快速硅膠層析(VMeOH∶VDCM=1∶100)得無色固體。同法重復(fù)該反應(yīng)3次；共得白色固體(8,221.9 mg,106.3 mCi,47%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ10.64(s,1H),2.54-2.38(m,4H),1.89-1.77(m,2H)。ESI-MSm/z:116[M+H]+。

2.1.52,6-二氯[2-14C]吡啶(9) 在氬氣保護(hù)下，將[羰基-14C]戊二酰亞胺(8,107.6 mg)、五氯化磷(583 mg)和三氯化磷(2.5 mL)的混合液于室溫下攪拌。HFPM監(jiān)測(cè)顯示，攪拌13 h后原料(8)完全轉(zhuǎn)化[21-22]。將反應(yīng)液倒入劇烈攪拌的冰-水(50 mL)中，DCM萃取(40 mL×5),將萃取液依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾后濃縮得白色固體。同法重復(fù)該反應(yīng)1次；共得白色固體(9,248.3 mg,90.6 mCi,88%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ8.00-7.91(m,1H),7.64-7.54(m,2H)。ESI-MSm/z:150[M+H]+,152[M+2+H]+。

2.1.66-氯[2,6-14C]吡啶-2-醇(10) 在氬氣保護(hù)下，將2,6-二氯[2-14C]吡啶(9,99.2 mg)、氫氧化鉀(105 mg)和叔丁醇(2.5 mL)的混合液于90 ℃下攪拌。HFPM監(jiān)測(cè)顯示，攪拌2.5 h后反應(yīng)結(jié)束[23]。減壓脫除反應(yīng)液中溶劑，加入水和石油醚(各50 mL)，攪拌分層，以稀鹽酸酸化水層(pH 2～3)，經(jīng)乙酸乙酯萃取(40 mL×5)、飽和食鹽水洗滌和無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得白色固體。同法重復(fù)該反應(yīng)1次；共得白色固體(10,169.8 mg,71.5 mCi,83%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ11.44(br,1H),7.70-7.56(m,1H),6.95-6.81(m,1H),6.63-6.50(m,1H)。ESI-MSm/z:132[M+H]+,134[M+H]+。

2.1.73,5,6-三氯[2,6-14C]吡啶-2-醇(11) 在氬氣保護(hù)下，將次氯酸鈉溶液(1.35 mL,活性氯≥7.5%)加入攪拌的6-氯[2,6-14C]吡啶-2-醇(10,83.0 mg)和氫氧化鉀(40 mg)的水(1.50 mL)溶液中；在室溫下攪拌1.5 h反應(yīng)結(jié)束[24]。將反應(yīng)混合物降溫至0 ℃，以稀鹽酸酸化(pH 2～3)，攪拌10 min，過濾，濾餅用純水洗滌3次，在40 ℃真空干燥后得淡黃色固體。同法重復(fù)該反應(yīng)1次；共得淡黃色固體(11,149.0 mg,40.8 mCi,58%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ12.96(br s,1H),8.26(s,1H)。ESI-MSm/z:200[M+H]+,202[M+2+H]+,204[M+4+H]+。

2.1.8目標(biāo)物14C-毒死蜱(1，O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C]吡啶基)硫代磷酸酯) 在氬氣保護(hù)下，將二乙基硫代磷酰氯(165 mg)加入3,5,6-三氯[2,6-14C]吡啶-2-醇(11,146.3 mg)和碳酸鈉(93 mg)的干燥DMF(3 mL)中，室溫?cái)嚢?。HFPM監(jiān)測(cè)顯示，攪拌2 h原料(11)消耗完全[14,25]。以稀鹽酸酸化反應(yīng)液(pH 2～3)，加水(30 mL)，以乙酸乙酯-石油醚混合液(1∶1,V/V)萃取(35 mL×5)，萃取液經(jīng)飽和食鹽水洗滌(40 mL)，無水硫酸鈉干燥，過濾后濃縮得粗品。粗品經(jīng)制備型RP-HPLC純化得白色固體(1,193.1 mg,30.2 mCi,75%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ8.62(s,1H),4.42-4.14(m,4H),1.32-1.25(m,6H)。ESI-MSm/z:352[M+H]+,354[M+2+H]+,356[M+4+H]+。制備色譜條件：xBridge Prep C18柱(10 μm,150 mm×19 mm)，流速7.00 mL/min，波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量500 μL；柱溫30 ℃；梯度洗脫(min/%A)控制：0/30,1/30,18/40,21/0,24/0,27/30,30/30;A為水，B為甲醇。收集保留時(shí)間為15.450～16.423 min的組分。

2.2 同位素標(biāo)記化合物的質(zhì)量指標(biāo)分析

2.2.1放化純度的測(cè)定 白色固體(1)的放化純度分別采用放射性薄層成像分析(TLC-IIA)、離線放射性高效液相色譜(HPLC-LSC)和在線放射性高效液相色譜(HPLC-FSA)法測(cè)定[26-27]。

(1) TLC-IIA分析：將白色固體(1)和毒死蜱標(biāo)樣在同一硅膠薄板(20 cm×5 cm)上連續(xù)展開4次；TLC條件：二氯甲烷/石油醚(VMeOH∶VDCM=1∶100)。在UV燈下，在該層析板上兩個(gè)樣品均顯示一個(gè)規(guī)則的斑點(diǎn)(Rf=0.64)；將該層析板進(jìn)行成像，該硅膠板上僅顯示一個(gè)規(guī)則的放射性斑點(diǎn)(Rf=0.64)。

(2) HPLC-FSA分析：準(zhǔn)確稱取9.63 mg白色固體(1)，以甲醇溶解并定容至100.00 mL，得母液。將母液稀釋至10 μg/mL，取10 μL進(jìn)行HPLC-FSA分析。流動(dòng)液閃采用Optiphase HiSafe 3閃爍液，流速為8 mL/min。白色固體(1)在HPLC-FSA色譜圖中均顯示1個(gè)色譜峰，保留時(shí)間為7.318 min。HPLC色譜條件：SunFire C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm,美國(guó)沃特世公司)；梯度洗脫(min/%A)控制：0/45,1/45,15/100；其余條件同2.1.2節(jié)。

(3) HPLC-LSC分析：取10 μL白色固體(1)稀釋液(10 μg/mL)進(jìn)行HPLC分析，用自動(dòng)接收器收集洗脫液，每隔20 s收集1份，用LSC分別測(cè)定各收集液活度。HPLC色譜條件同HPLC-FSA分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制(1)的離線放射性高效液相色譜圖，結(jié)果如圖3所示。在圖3中，保留時(shí)間為420～460 s之間呈現(xiàn)1個(gè)放射性色譜峰(對(duì)應(yīng)收集液為第21～23份)。根據(jù)該色譜峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)的總活度與10 μL白色固體(1)稀釋液(10 μg/mL)活度的比值即放化純度；平行分析3次，取其平均值作為白色固體(1)的放化純度。

圖3 放射性同位素碳-14標(biāo)記毒死蜱(1)的離線放射性高效液相色譜圖(HPLC-LSC)Fig.3 Offline radio-chromatogram (HPLC-LSC) of the carbon-14 labelled chlorpyrifos (1)

2.2.2化學(xué)純度的測(cè)定 白色固體(1)屬于高比活度標(biāo)記物，采用HPLC-UV色譜圖中色譜峰面積歸一法確定其化學(xué)純度。結(jié)果如圖4所示，(1)的保留時(shí)間為7.351 min。色譜條件同2.2.1節(jié)。

圖4 放射性同位素碳-14標(biāo)記毒死蜱(1)的高效液相色譜圖(254 nm)Fig.4 High performance liquid chromatogram of radioisotope carbon-14 labelled chlorpyrifos (254 nm)

2.2.3比活度的測(cè)定 白色固體(1)的比活度按照文獻(xiàn)方法測(cè)定[26]。

3 結(jié)果與討論

以[14C]碳酸鋇為放射性同位素原料，通過格氏反應(yīng)、親核取代、分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)、脫水芳構(gòu)化、親電氯代等9步放化反應(yīng)獲得碳-14標(biāo)記毒死蜱粗品，經(jīng)反相高效液相色譜純化獲得白色固體(1,30.2 mCi,總放化收率為11%)。白色固體(1)的核磁共振氫譜與毒死蜱標(biāo)樣一致；HPLC-FSA/PDA/MS分析顯示(1)的相對(duì)分子質(zhì)量比毒死蜱大2，且放射性高效液相色譜保留時(shí)間與毒死蜱標(biāo)樣的HPLC保留時(shí)間一致。據(jù)以上分析結(jié)果并結(jié)合標(biāo)記物的合成技術(shù)路線可確定，白色固體(1)為目標(biāo)物碳-14標(biāo)記毒死蜱(O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C]吡啶基)硫代磷酸酯)。TLC-IIA、HPLC-LSC、HFPM和LSC分析表明，標(biāo)記物(1)的放化純度和化學(xué)純度均大于98%，比活度為55.2 mCi/mmol，該質(zhì)量指標(biāo)滿足下游示蹤試驗(yàn)的要求，因而標(biāo)記物(1)可作為放射性示蹤劑，可替代文獻(xiàn)中報(bào)道的標(biāo)記物(O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C2]吡啶基)硫代磷酸酯[14])，用于毒死蜱的藥代動(dòng)力學(xué)、生態(tài)環(huán)境安全與污染消減機(jī)制等問題的研究。

碳-14是利用同位素示蹤法研究農(nóng)醫(yī)藥的代謝與安評(píng)中常用的核素，合成碳-14標(biāo)記農(nóng)醫(yī)藥首先需要考慮的是標(biāo)記位置的選擇[12-13]。需要指出的是，選用不同的標(biāo)記位置的碳-14標(biāo)記物，則下游示蹤試驗(yàn)的結(jié)果往往有所不同；而碳-14標(biāo)記位置選擇不當(dāng)，則會(huì)引起下游試驗(yàn)結(jié)果與客觀情況有所偏差，甚至導(dǎo)致結(jié)論謬誤。例如，文獻(xiàn)報(bào)道的乙基碳-14標(biāo)記毒死蜱(2，O,O-二[1-14C]乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，見圖1)合成步驟少，成本低，但其中[1-14C]乙氧基標(biāo)記片段通過磷酸酯鍵與吡啶環(huán)相連，因其易從分子骨架脫落而無法滿足生物體(植物、哺乳動(dòng)物和家禽)、水體-土壤環(huán)境中大多數(shù)代謝試驗(yàn)對(duì)示蹤劑的要求[28]。

在用于代謝試驗(yàn)的碳-14標(biāo)記農(nóng)醫(yī)藥合成中，通常根據(jù)農(nóng)醫(yī)藥母體分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)將其劃分為若干標(biāo)記單元(即分子中標(biāo)記相對(duì)牢固的位置)，然后依據(jù)標(biāo)記合成的必要性、可行性、標(biāo)記難度及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笤诟鱾€(gè)標(biāo)記單元內(nèi)選擇恰當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于含一個(gè)標(biāo)記單元的農(nóng)藥，僅需對(duì)標(biāo)記單元中任意一個(gè)位點(diǎn)的碳原子進(jìn)行標(biāo)記；對(duì)于含兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記單元的農(nóng)藥，則需要對(duì)各個(gè)標(biāo)記單元分別進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記位點(diǎn)可選擇標(biāo)記單元中任意一個(gè)碳原子[6]?？紤]到研究成本和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，筆者均從每種農(nóng)藥中均選取兩個(gè)標(biāo)記單元分別進(jìn)行標(biāo)記，且以芳環(huán)標(biāo)記為主[6-10,17,26-27]；而僅有少數(shù)碳-14標(biāo)記物，如毒死蜱、精草銨膦、利谷隆、氟啶蟲酰胺、丁噻隆和特丁津，均含一個(gè)標(biāo)記單元，僅需選取標(biāo)記單元內(nèi)任意一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。碳-14是自旋量子數(shù)為0的非磁性核，無核磁共振現(xiàn)象，因而無法利用核磁共振碳譜直接確定碳-14標(biāo)記物中碳-14的位點(diǎn)。盡管綜合利用核磁共振定量碳譜、質(zhì)譜和液體閃爍測(cè)量等技術(shù)可間接地推測(cè)碳-14的位點(diǎn)，但因分析過程所需樣品較大而放射性標(biāo)記物通常均為微量，因而確定未知來源的放射性物質(zhì)中碳-14位點(diǎn)往往難以實(shí)現(xiàn)[29]。當(dāng)前，國(guó)際上確定碳-14標(biāo)記物中碳-14位點(diǎn)的最可靠方法是將標(biāo)記合成技術(shù)路線與其他分析手段相結(jié)合，綜合分析確定。

香草硫縮病醚(12)、毒死蜱(13)和氟啶蟲酰胺(14)分子中的標(biāo)記單元示于圖5。本研究選取具有芳香性的吡啶環(huán)為標(biāo)記位置，以吡啶環(huán)中2,6-位碳為標(biāo)記位點(diǎn)，這種標(biāo)記較為牢固，碳-14不易從吡啶環(huán)脫落，可滿足大多數(shù)示蹤試驗(yàn)的要求。相比較而言，采用標(biāo)記生物大分子常用的核素碘-131標(biāo)記毒死蜱，合成簡(jiǎn)單，成本低，但碳-14標(biāo)記毒死蜱(1)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)更貼近毒死蜱，標(biāo)記物的物理半衰期更長(zhǎng)，穩(wěn)定性更高，因而更適合于下游示蹤試驗(yàn)[30]。

圖5 香草硫縮病醚(12)、毒死蜱(13)和氟啶蟲酰胺(14)分子中的標(biāo)記單元Fig.5 Radiolabelling units of XCLSBM (12), chlorpyrifos (13) and flonicamid (14)

文獻(xiàn)報(bào)道碳-14標(biāo)記毒死蜱(O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C2]吡啶基)硫代磷酸酯)制備方法中起始同位素原料[14C]氰化鉀為劇毒品，且[14C]氰化鉀與1,3-二溴丙烷制備[1,4-14C2]戊二腈的親核取代反應(yīng)非常緩慢，長(zhǎng)達(dá)65 h；[1,4-14C2]戊二腈在210 ℃高溫下反應(yīng)18 h方可制得[1,4-14C2]戊二酰亞胺，因而反應(yīng)條件非常苛刻[14]。在本研究中，以[14C]二氧化碳在低溫下進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過3步接近常溫常壓條件制備了[1-14C]戊二酰亞胺，反應(yīng)速度較快，且反應(yīng)易于控制。文獻(xiàn)報(bào)道中間體[2,6-14C2]氯吡啶必須用劇毒的氯氣在高壓釜內(nèi)高溫進(jìn)行氯化，操作具有潛在的危險(xiǎn)性，而本研究在室溫常壓條件下采用次氯酸體系對(duì)[2,6-14C]三氯吡啶醇(10)進(jìn)行氯化，進(jìn)而通過在堿性條件下與二乙基硫代磷酰氯反應(yīng)而獲得目標(biāo)物(1)。

4 結(jié)論

以[14C]碳酸鋇為放射性同位素原料，通過9步放化反應(yīng)獲得碳-14標(biāo)記毒死蜱(1,O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14C]吡啶基)硫代磷酸酯，30.2 mCi)，反應(yīng)總收率為11%。該標(biāo)記物的技術(shù)指標(biāo)滿足下游同位素示蹤試驗(yàn)的要求，因而它可作為放射性示蹤劑，用于毒死蜱的藥代動(dòng)力學(xué)、生態(tài)環(huán)境安全與污染消減機(jī)制等問題的研究。