沈?qū)氂?，楊根?mèng)，李媛媛，劉 柳，黃 儉，曾曉鋒，李利華

（昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500）

可卡因又稱古柯堿，是古柯樹(shù)的天然植物產(chǎn)物，由奧地利化學(xué)家紐曼于1859 年提純并命名?？煽ㄒ蜃鳛楣爬系臑E用毒品之一，具有強(qiáng)效的神經(jīng)興奮作用，長(zhǎng)期濫用常引起神經(jīng)毒性和藥物依賴。此外，可卡因的長(zhǎng)期濫用常伴隨HIV 感染[1-2]，給社會(huì)公共衛(wèi)生帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。自噬是一種高度保守的生理機(jī)制，可作為細(xì)胞短期存活的手段，主要對(duì)細(xì)胞分解代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，在維持細(xì)胞能量平衡和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)上起著重要作用。自噬作為細(xì)胞死亡或存活的決定因素和在不良生理?xiàng)l件下的關(guān)鍵防御機(jī)制，在最近幾年引起了廣泛關(guān)注[3]。研究表明，可卡因可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，其誘導(dǎo)自噬的過(guò)程由多種機(jī)制調(diào)控，并在可卡因神經(jīng)毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本文旨在綜述現(xiàn)有證據(jù)，探討可卡因誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制和可卡因聯(lián)合HIV 引發(fā)的神經(jīng)毒性。

1 自噬過(guò)程

在正常生理?xiàng)l件下，自噬處于較低水平，當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧、代謝應(yīng)激[4-5]等狀態(tài)時(shí)，自噬活性顯著上調(diào)。自噬過(guò)程由一組進(jìn)化上保守存在的自噬相關(guān)（autophagy-related，Atg）基因所介導(dǎo)，其特征為自噬體（Autophagosome）的形成，自噬體由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待降解的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器或病原微生物等自噬底物而組成，并與溶酶體融合以降解和再循環(huán)自噬底物，進(jìn)而作為細(xì)胞存活的能源[6]。根據(jù)自噬底物向溶酶體轉(zhuǎn)移的不同機(jī)制，可將自噬過(guò)程分為3 種不同類型：巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬[7-8]，通常所稱的自噬指巨自噬，下文將巨自噬簡(jiǎn)稱為自噬。

自噬體膜的磷脂主要來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）、胞質(zhì)內(nèi)顆粒（Endosomes）或線粒體（Mitochondria），并招募含3類磷脂酰肌醇3激酶（Class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的多蛋白復(fù)合體[9-11]，其中包含：beclin 1（BECN1）、PIK3C3（PI3K 催化亞基3 型，也稱VPS34）、PI3KR4（PI3K 調(diào)控亞基4，也稱VPS15）、膜曲率感受器Atg14（也稱BARKOR）和核受體結(jié)合因子2（nuclear receptor binding factor 2，NRBF2）。此外，自噬體的形成是由包含Atg13、Atg101 和unc-51樣自噬激活激酶 1（unc-51-like autophagy activating kinase 1，ULK1）的多蛋白復(fù)合體所啟動(dòng)的，該復(fù)合體在含Atg9 的自噬體膜上裝配和活化，并激活A(yù)tg9 的磷酸化[12]。隨后，VPS34 產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），PI3P 與Atg 蛋白家族結(jié)合，并與WD 重復(fù)磷酸肌醇相互作用蛋白（WD-repeat protein interacting with phosphoinositides，WIPI）家族進(jìn)一步促進(jìn)自噬體膜的擴(kuò)張直至閉合[13]。自噬體在包裹自噬底物后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（Autolysosomes），而調(diào)控該融合過(guò)程的分子機(jī)制涉及數(shù)十種蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)涉及內(nèi)吞相關(guān)通路[14]。自噬溶酶體形成后，Atg 偶聯(lián)系統(tǒng)（Atg conjugation systems）誘導(dǎo)自噬體膜在自噬溶酶體的內(nèi)部降解[15]，而ATP 依賴性質(zhì)子泵活性的改變導(dǎo)致了自噬溶酶體內(nèi)部酸化，最終引起自噬底物的降解[16]。此外，自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合及自噬底物降解的過(guò)程與兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的活性有關(guān)[17-18]。酵母Atg8 在哺乳動(dòng)物中的同源物被稱為微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain-3，LC3），而Atg3、Atg7 及Atg12-Atg5-Atg16L1 復(fù)合物促進(jìn)了LC3B（LC3β）與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結(jié)合[19]，LC3 與PE 結(jié)合并在自噬體膜發(fā)生脂化。脂化的LC3 稱為L(zhǎng)C3-Ⅱ，在自噬體識(shí)別和攝取自噬底物的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[20]。

綜上所述，自噬過(guò)程包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合及自噬底物降解等環(huán)節(jié)，各環(huán)節(jié)緊密聯(lián)系并受多種分子機(jī)制調(diào)控。此外，Atg 蛋白、BECN1、LC3、LC3-Ⅱ等蛋白常作為自噬的標(biāo)志物，可通過(guò)檢測(cè)上述蛋白表達(dá)水平來(lái)判斷自噬活性。

2 可卡因誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬

體外實(shí)驗(yàn)表明，可卡因增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中自噬體的形成和自噬標(biāo)志物蛋白如BECN1、Atg5 和LC3-Ⅱ的表達(dá)[21]，并隨可卡因劑量和接觸時(shí)間的增加而上調(diào)[22]。此外，可卡因誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞自噬體的形成和自噬標(biāo)記物如BECN1、Atg5、LC3-Ⅱ的表達(dá)，并與可卡因劑量和接觸時(shí)間呈正相關(guān)[23]。Guha 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，用可卡因處理的皮質(zhì)神經(jīng)元，自噬體數(shù)量和LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著增加。Lu 等[25]用可卡因處理體外小鼠伏隔核原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)自噬體的形成和LC3-Ⅱ的表達(dá)增加。此外，可卡因也誘導(dǎo)了人腦血管周細(xì)胞（human brain vascular pericytes，HBVPs）中自噬標(biāo)記物BECN1 和LC3B-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)[26]。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，可卡因可上調(diào)小鼠伏隔核中LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，并誘導(dǎo)自噬體的形成[25]。此外，可卡因增加了小鼠紋狀體中自噬標(biāo)志物BECN1 和LC3B-Ⅱ的表達(dá)[21-23]。Guha 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，在孕鼠攝入可卡因后生產(chǎn)的小鼠中，其背側(cè)紋狀體、皮質(zhì)、外側(cè)韁核和伏隔核中，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Sil 等[26]的研究表明，可卡因可誘導(dǎo)小鼠腦血管周細(xì)胞中LC3 的表達(dá)。綜上研究結(jié)果表明，可卡因可誘導(dǎo)多種神經(jīng)細(xì)胞自噬。

3 可卡因誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制

體內(nèi)和體外研究表明，可卡因可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，而自噬受多種分子機(jī)制調(diào)控。以往的研究表明，可卡因可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激、一氧化氮/甘油醛-3-磷酸脫氫酶/Siah1（NO/GAPDH/Siah1）、多巴胺D1 受體/鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2 型/ 腺苷酸活化蛋白激酶/FoxO3a（DRD1-CaMKII-AMPK-FoxO3a）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和sigma 1 受體（σ-1R）等信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。

3.1 ER 應(yīng)激對(duì)可卡因誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

研究表明，可卡因可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，自噬抑制劑3-MA 或Wortmannin 可抑制可卡因誘導(dǎo)的自噬。此外，可卡因可上調(diào)ER 應(yīng)激通路標(biāo)志蛋 白（EIF2AK3、P-EIF2AK3、EIF2S1、P-EIF2S1、ATF6、ERN1、HSPA5 和DDIT3）的表達(dá)，而自噬抑制劑不能抑制ER 應(yīng)激通路標(biāo)志蛋白的表達(dá)上調(diào)。另一方面，ER 應(yīng)激通路抑制劑Salubrinal 或4-苯丁酸鈉可抑制可卡因?qū)R 應(yīng)激通路和自噬的誘導(dǎo)作用，此外，用siRNA 沉默EIF2AK3 后，顯示了同樣的結(jié)果。綜上表明，ER應(yīng)激通路是可卡因誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的上游部分[21]。Sil 等[26]的研究表明，ER 應(yīng)激通路作為可卡因誘導(dǎo)人腦血管周細(xì)胞（human brain primary pericytes，HBVP）自噬的上游部分而發(fā)揮作用。此外，σ-1R 抑制劑BD 1047 可抑制可卡因誘導(dǎo)的ER 應(yīng)激通路標(biāo)志物和自噬標(biāo)志物表達(dá)，這表明σ-1R 在ER 應(yīng)激通路的上游介導(dǎo)了周細(xì)胞自噬。Guo 等[23]的研究表明，可卡因可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中ER 應(yīng)激通路蛋白磷酸化，而ER 應(yīng)激通路抑制劑Salubrinal、PPP1R3A 及對(duì)應(yīng)的siRNA 均可抑制該誘導(dǎo)作用，并降低自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II 的表達(dá)。綜上，ER 應(yīng)激通路作為可卡因誘導(dǎo)多種細(xì)胞自噬的上游而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

3.2 NO/GAPDH/Siah1 對(duì)可卡因誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用

Guha 等[24]的研究表明，可卡因通過(guò)NO/GAPDH 級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬?？煽ㄒ蛟诖竽X皮層神經(jīng)元中引起GAPDH 亞硝化及其核轉(zhuǎn)運(yùn)。NO/GAPDH/Siah1 信號(hào)軸被抑制劑CGP2466B 所抑制后，GAPDH 亞硝化受阻，可卡因誘導(dǎo)的LC3-II表達(dá)受抑制；相反地，GAPDH 過(guò)表達(dá)后，大腦皮層神經(jīng)元LC3-II 表達(dá)水平升高。而在神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）敲出的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中，可卡因不能增加其LC3-II 水平。綜上，可卡因可通過(guò)NO/GAPDH/Siah1 信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬。

3.3 DRD1/CaMKⅡ/AMPK/FoxO3a 對(duì)可卡因誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用

研究表明，可卡因可在體內(nèi)體外誘導(dǎo)AMPK的磷酸化，而在AMPK 敲除小鼠的伏隔核中，LC3-Ⅱ的表達(dá)被顯著抑制，這表明AMPK 可在小鼠伏隔核中介導(dǎo)可卡因誘導(dǎo)的自噬[25]。此外，AMPK 被報(bào)道可直接調(diào)控FoxO3a，F(xiàn)oxO3a 與Atg的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)自噬活性；而AMPK 在Thr172 位點(diǎn)磷酸化和鈣通量相關(guān)，CaMKⅡ可能是AMPK 的上游激酶[27]。本研究發(fā)現(xiàn)可卡因在體內(nèi)體外誘導(dǎo)伏隔核神經(jīng)元中FoxO3a 表達(dá)和CaMKⅡ磷酸化，而CaMKⅡ抑制劑KN-93 可阻斷可卡因誘導(dǎo)的CaMKⅡ磷酸化、AMPK 磷酸化和LC3-Ⅱ表達(dá)。此外，DRD1 抑制劑SCH23390 可阻斷可卡因誘導(dǎo)的CaMKⅡ磷酸化、AMPK 磷酸化和LC3-Ⅱ表達(dá)。綜上表明，可卡因可通過(guò)DRD1/CaMKⅡ/AMPK/FoxO3a 信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬。

3.4 其他信號(hào)通路對(duì)可卡因誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用

研究表明，可卡因可降低小膠質(zhì)細(xì)胞中mTOR通路標(biāo)志蛋白AKT 和p-RPS6 的表達(dá)，這表明mTOR 通路參與了可卡因誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬[23]。Walker 等[22]的研究表明，可卡因可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，并下調(diào)mTOR 磷酸化，而mTOR 抑制劑可進(jìn)一步誘導(dǎo)LC3-Ⅱ的表達(dá)，這表明mTOR通路在可卡因誘導(dǎo)自噬中起著負(fù)調(diào)控的作用。此外，可卡因可誘導(dǎo)σ-1R 的表達(dá)，而σ-1R 抑制劑和對(duì)應(yīng)siRNA 均可抑制可卡因誘導(dǎo)的自噬。研究表明，σ-1R 在ER 應(yīng)激通路的上游介導(dǎo)了可卡因誘導(dǎo)的自噬[23，26]。故σ-1R 相關(guān)通路在可卡因誘導(dǎo)自噬中起著一定的調(diào)控作用。此外，Bcl-2 作為抗凋亡蛋白，它的磷酸化可使Bcl-2/BECN1 復(fù)合物解離，并釋放BECN1 參與自噬過(guò)程[28]，而可卡因可誘導(dǎo)Bcl-2 磷酸化從而引發(fā)自噬[22]。最后，除了BECN1 和Bcl-2，Atg5 和Atg7 也被報(bào)道調(diào)節(jié)自噬。Walker 等[22]的研究表明，可卡因可誘導(dǎo)BECN1、Atg5 和Atg7 的表達(dá)，而BECN1、Atg5 和Atg7 對(duì)應(yīng)siRNA 可有效地抑制可卡因誘導(dǎo)的自噬，這表明BECN1、Atg5 和Atg7 對(duì)可卡因誘導(dǎo)的自噬起著一定的調(diào)控作用。

4 自噬在可卡因神經(jīng)毒性中的作用

根據(jù)以往的研究，可卡因可通過(guò)多種信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，而自噬在可卡因神經(jīng)毒性中的作用是有爭(zhēng)議的。自噬通常被認(rèn)為是細(xì)胞存活的機(jī)制，而廣泛的自噬可導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡。研究表明，可卡因可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡[22，24]，而自噬抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)自噬性細(xì)胞死亡[22]。此外，自噬介質(zhì)Atg5 或BECN1 的耗竭可顯著降低可卡因的神經(jīng)毒性[24]。另一方面，自噬在可卡因神經(jīng)毒性中起著一定的保護(hù)作用。當(dāng)可卡因和自噬抑制劑聯(lián)合作用于小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，其存活率遠(yuǎn)低于單一藥物作用的小膠質(zhì)細(xì)胞[23]，而可卡因誘導(dǎo)的自噬又引起促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等的表達(dá)[21，23]，從而加重可卡因神經(jīng)毒性。故自噬在可卡因神經(jīng)毒性中的作用可能是一個(gè)雙面且動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，損傷和保護(hù)并存。

5 可卡因聯(lián)合HIV 引發(fā)神經(jīng)毒性

HIV 被分別命名為HIV-1 和HIV-2，HIV 感染主要指HIV-1 感染。CNS 是HIV-1 的一個(gè)重要靶點(diǎn)，HIV-1 在感染后的最初幾天內(nèi)進(jìn)入CNS，并通過(guò)HIV 基因編碼蛋白如Tat 蛋白和gp120 蛋白引發(fā)神經(jīng)毒性。大量的研究表明，可卡因聯(lián)合HIV通過(guò)破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）完整性、影響神經(jīng)元代謝、干擾多巴胺系統(tǒng)和改變神經(jīng)突觸可塑性等機(jī)制引發(fā)神經(jīng)毒性。

5.1 可卡因聯(lián)合HIV 破壞BBB 完整性

Gandhi 等[29]使用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMECs）和星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建BBB 細(xì)胞模型，并測(cè)定跨內(nèi)皮電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）、FITC 標(biāo)記的葡聚糖轉(zhuǎn)移率、單核細(xì)胞遷移率和緊密連接蛋白ZO-1 和JAM-2 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)變化，綜合評(píng)價(jià)了可卡因與HIV 聯(lián)合對(duì)BBB 完整性的破壞作用。研究表明，可卡因聯(lián)合HIV-1 Tat 蛋白可顯著下調(diào)BBB 模型跨內(nèi)皮電阻和緊密連接蛋白ZO-1 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并上調(diào)FITC 標(biāo)記的葡聚糖轉(zhuǎn)移率、單核細(xì)胞遷移率和緊密連接蛋白JAM-2的轉(zhuǎn)錄，從而破壞血腦屏障完整性，最終加速HIV-1 相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙（HIV-1-associated neurocognitive disorder，HAND）的 進(jìn) 程，其 中HIV-1Tat 蛋白C 支起著關(guān)鍵作用[29]。

5.2 可卡因聯(lián)合HIV 影響神經(jīng)元代謝

正常的腦功能需要星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元串聯(lián)的代謝物交換，交換過(guò)程受到嚴(yán)密調(diào)控，一旦受阻或損害將會(huì)引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。Cotto 等[30]的研究表明，可卡因和HIV-1 Tat 蛋白通過(guò)干擾肝Ⅹ受體（liver X receptors，LXRs）信號(hào)，下調(diào)了載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）的表達(dá)，并激活甾醇調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白（sterol regulatory binding protein，SREBP）通路，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞膽固醇失調(diào)，從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元提供所需的膽固醇支持，進(jìn)而影響神經(jīng)突觸完整性和神經(jīng)傳遞，最終引發(fā)神經(jīng)認(rèn)知障礙。

5.3 可卡因聯(lián)合HIV 干擾多巴胺系統(tǒng)

研究表明，可卡因和HIV-1 Tat 蛋白可顯著上調(diào)多巴胺水平，阻礙多巴胺降解，并改變HIV-1Tat 與多巴胺神經(jīng)末梢的相互作用，從而引發(fā)神經(jīng)病理癥狀[31]。此外，可卡因和HIV-1 聯(lián)合作用可干擾多巴胺的再攝取和清除，并改變樹(shù)突棘形態(tài)，從而導(dǎo)致多巴胺系統(tǒng)功能障礙[32]。

6 小結(jié)

以往的研究表明，可卡因能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，而可卡因誘導(dǎo)的自噬過(guò)程由多種機(jī)制所調(diào)控。同時(shí)，可卡因?yàn)E用具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，而自噬在其中起著雙重作用，目前調(diào)控機(jī)制不清楚。特別在可卡因?yàn)E用合并HIV 中樞感染時(shí)，其協(xié)同神經(jīng)毒性機(jī)制尚不清楚。因此，研究可卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬機(jī)制和可卡因聯(lián)合HIV 引發(fā)的神經(jīng)毒性機(jī)制，有助于解決毒品濫用和HIV 中樞感染的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。