張俊超， 張獻(xiàn)忠，沈金金，朱玉燕，張 靜

（德清秋水果汁有限公司，浙江湖州 313200）

果蔬汁是以水果、蔬菜為原料經(jīng)過(guò)物理方法（如壓榨、離心、萃取等） 得到的汁液產(chǎn)品，一般是指純果蔬汁、100%果蔬汁和復(fù)合果蔬汁等[1]。果蔬汁含有豐富的對(duì)人體有益的功能組分，如膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、花色苷、類(lèi)胡蘿卜素、多酚、黃酮類(lèi)等[2-5]。果蔬汁因其原料多樣、口感豐富、香氣獨(dú)特及健康屬性，已成為飲料市場(chǎng)傳統(tǒng)的 “三大品類(lèi)” 之一。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及消費(fèi)者健康意識(shí)的覺(jué)醒，綠色、原生態(tài)的食材越來(lái)越受到推崇，世界飲料市場(chǎng)已經(jīng)向天然、健康、便捷的方向發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)果蔬汁飲料提出了更高的要求，更長(zhǎng)的貨架期、更安全的產(chǎn)品、更新鮮的風(fēng)味和更營(yíng)養(yǎng)的特性成為果蔬汁飲料未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

傳統(tǒng)的果蔬汁飲料加工滅菌方式多應(yīng)用高溫巴氏殺菌和超高溫瞬時(shí)滅菌等技術(shù)[6]，研究證實(shí)果蔬汁貨架期跟原材料的生物酶滅活和微生物消殺密切相關(guān)[7]，目前的高溫滅菌方式使得果蔬汁中的熱敏性營(yíng)養(yǎng)組分、功能性成分和與貢獻(xiàn)新鮮口感的揮發(fā)性組分產(chǎn)生熱裂解、氧化還原等多種化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致果蔬汁飲料綜合品質(zhì)下降，口感香氣新鮮度等均無(wú)法滿足消費(fèi)者需求[8-9]。這就使得果蔬汁飲料加工業(yè)在積極研究和探索傳統(tǒng)滅菌技術(shù)的替代方案，非熱滅菌技術(shù)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[10-13]。 非熱滅菌（Non-thermal sterilization） 是一類(lèi)技術(shù)的統(tǒng)稱(chēng)，共同特點(diǎn)是采用非熱的方式對(duì)食品進(jìn)行滅菌處理，且過(guò)程中溫度無(wú)劇烈變化，達(dá)到殺菌、除菌或抑菌的目的，從而保留產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期[14]。

1 影響果蔬汁貨架期的主要因素

果蔬汁工業(yè)滅菌的主要目的是保證食品安全和延長(zhǎng)貨架期，而影響果蔬汁貨架期的主要因素就是微生物和酶。

在果蔬汁加工過(guò)程中，殺滅微生物至關(guān)重要，因?yàn)楣咧w系中含有豐富的碳水化合物等富營(yíng)養(yǎng)源支持微生物的生長(zhǎng)[15]。引起果蔬汁變質(zhì)的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌和霉菌等3 類(lèi)。微生物污染不僅使果蔬汁產(chǎn)品失去或降低原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、組織狀態(tài)等，更為嚴(yán)重的是，某些微生物能夠分泌毒素，危害人體健康[16]。美國(guó)聯(lián)邦果汁危害性分析關(guān)鍵控制點(diǎn)規(guī)定，果汁加工企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中必須進(jìn)行處理，將所含微生物減少99.999%或5 log CFU/mL[17]。

而果蔬原料中所含的生物酶活性也是影響果蔬汁貨架期及品質(zhì)的另一個(gè)重要因素。果蔬原料中含有多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）、果膠甲基酯酶（Pectin methyl esterase，PME） 等，其中PPO在氧氣存在的條件下，可以把酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致果蔬汁發(fā)生褐變進(jìn)而影響品質(zhì)[18]。而PME 則可以通過(guò)降解果膠而破壞果蔬汁的混濁體系，最終影響產(chǎn)品感官品質(zhì)[19]。因此，加工中鈍化PPO和PME 等酶是保持果蔬汁穩(wěn)定性、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期的必要條件之一。

2 新型非熱滅菌技術(shù)

2.1 超高壓滅菌技術(shù)

超高壓滅菌又稱(chēng)為高壓加工（High Pressure Processing， HPP） 或高靜 水 壓（High Hydrostatic Pressure，HHP），屬于食品行業(yè)后殺菌的非熱加工技術(shù)，自1990 年以來(lái)逐漸應(yīng)用于食品工業(yè)，應(yīng)用壓力范圍一般為100～800 MPa[20-21]。獨(dú)立包裝或未包裝的果蔬汁置于超高壓設(shè)備加壓室中，通過(guò)泵將靜水壓均勻加壓于產(chǎn)品，以達(dá)到殺菌目的[22]。超高壓設(shè)備可通過(guò)調(diào)節(jié)壓力、加壓時(shí)間（1 ms～20 min） 和初始處理溫度等參數(shù)以適應(yīng)不同的產(chǎn)品[23]。

2.1.1 超高壓技術(shù)滅菌機(jī)制

HPP 對(duì)微生物滅活的主要機(jī)理為超高壓能夠破壞蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸等生物大分子的非共價(jià)鍵，使微生物細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，抑制酶的活性和DNA 等遺傳物質(zhì)的復(fù)制等，從而達(dá)到消滅微生物的作用[24]。其中，HPP 破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性和降低細(xì)胞內(nèi)pH 值的作用僅對(duì)草蘭氏陽(yáng)性菌而言，目前HPP 對(duì)孢子影響機(jī)制并沒(méi)有研究清楚。有研究顯示，即使是同一種細(xì)菌的孢子，對(duì)于高壓的敏感度也是不一樣的[25]。已有研究顯示，在高壓處理之后再輔以一定溫度的處理，可以對(duì)芽孢桿菌的孢子有效消殺，細(xì)菌孢子可以在一定的壓力條件下生長(zhǎng)，且孢子種類(lèi)不同則適合生長(zhǎng)的壓力條件也不盡相同，但是這些孢子可以通過(guò)高溫處理消殺[26]。

2.1.2 超高壓滅菌在果蔬汁中的應(yīng)用

由于超高壓在有效滅菌的同時(shí)能夠保留果蔬汁產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，使其在果蔬汁滅菌的研究中廣泛應(yīng)用。目前，許多研究已經(jīng)在證實(shí)HPP 在蘋(píng)果汁、橙汁、石榴汁、草莓汁、芒果汁、胡蘿卜汁等果蔬汁的加工中起到良好的滅菌作用[27]。

目前，世界主要的高壓滅菌設(shè)備制造商有美國(guó)的Avure、西班牙的Hiperbaric 和德國(guó)的Multivac 等，其中Hiperbaric 的市場(chǎng)份額已經(jīng)超過(guò)了50%。隨著技術(shù)的發(fā)展，超高壓滅菌設(shè)備技術(shù)逐漸成熟，國(guó)內(nèi)的制造商已經(jīng)具備研發(fā)生產(chǎn)食品工業(yè)用高壓設(shè)備的能力，主要的制造商有包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司等，已經(jīng)形成了超高壓裝備的研究開(kāi)發(fā)、設(shè)計(jì)、生產(chǎn)及推廣的成熟鏈條。且一些品牌的NFC 果蔬汁產(chǎn)品已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用HPP 進(jìn)行滅菌，并作為產(chǎn)品主要的亮點(diǎn)進(jìn)行宣傳，如Hey Juice 品牌果汁、Fruity 品牌果汁和KellyOne 品牌果蔬汁產(chǎn)品等。

當(dāng)然，超高壓滅菌技術(shù)目前還存在一些缺點(diǎn)，如超高壓在酶滅活方面沒(méi)有高溫殺菌效果好，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些亞致死微生物，對(duì)產(chǎn)品貯藏條件要求較高[28]。因此，可以考慮將超高壓滅菌與其他滅菌方式相結(jié)合，以提升滅菌效果，提高產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)，超高壓的應(yīng)用成本高、不能像飲料生產(chǎn)線一樣連續(xù)生產(chǎn)等問(wèn)題也限制了其在果蔬汁工業(yè)中的大規(guī)模推廣，以上問(wèn)題均是超高壓裝備制造行業(yè)未來(lái)需要重點(diǎn)解決的。

2.2 超聲波滅菌技術(shù)

超聲波處理是近年來(lái)在食品工業(yè)興起的一種新技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于加工、保存和提取工藝當(dāng)中。超聲波不僅能夠避免產(chǎn)品損耗，還能降低果蔬汁中微生物數(shù)量、提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)等，具有加工時(shí)間短、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[29]。

2.2.1 超聲波技術(shù)滅菌機(jī)制

（2）微量物質(zhì)示蹤劑具有安全環(huán)保、成分穩(wěn)定、成本低、檢測(cè)精度高等優(yōu)點(diǎn)，將成為油田示蹤劑未來(lái)的主要研發(fā)和應(yīng)用方向。

超聲波滅菌應(yīng)用的頻率范圍一般為20～100 kHz，其對(duì)微生物的滅活主要是超聲波引起的空穴效應(yīng)，果蔬汁經(jīng)超聲波處理可以破壞微生物細(xì)胞壁和產(chǎn)生自由基，進(jìn)而達(dá)到滅菌的效果。超聲波可以使處理的液體介質(zhì)持續(xù)不斷地產(chǎn)生微小氣泡，氣泡在介質(zhì)中移動(dòng)到距聲波源一定距離時(shí)，會(huì)因?yàn)槟芰肯Ф焖倨屏?，而氣泡破裂產(chǎn)生的沖擊波會(huì)在短時(shí)間內(nèi)（100 ns） 產(chǎn)生瞬時(shí)高溫高壓區(qū)域，可以破壞微生物細(xì)胞，進(jìn)而在這一區(qū)域內(nèi)將微生物消滅，但這一效果僅限定于氣泡破裂時(shí)的瞬時(shí)沖擊波區(qū)域，且這一區(qū)域瞬時(shí)的高溫高壓在一定時(shí)間內(nèi)并不會(huì)影響介質(zhì)本身的宏觀溫度。超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)還會(huì)改變胞內(nèi)微觀動(dòng)力，擾亂胞內(nèi)組分，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞中的酶抑制或滅活[30]。

2.2.2 超聲波滅菌在果蔬汁中的應(yīng)用

超聲波技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生劇烈的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，已經(jīng)在果蔬產(chǎn)業(yè)得到廣泛應(yīng)用，但工業(yè)化應(yīng)用的主要是清洗原料，超聲波殺菌的應(yīng)用在果蔬汁行業(yè)還處于研究階段，已有研究表明超聲波可以將果蔬汁中的致病菌降低至5 log 以下，如在500 kHz、240 W 情況下處理柑橘汁15 min；在25 kHz、600 W情況下處理90 min；在20 kHz、750 W 條件下處理胡蘿卜汁2 min 均可有效對(duì)果蔬汁中的微生物進(jìn)行殺滅[31]。超聲波滅菌技術(shù)應(yīng)用研究已經(jīng)開(kāi)展多年，但在果蔬汁行業(yè)尚未有真正的工業(yè)化應(yīng)用，而現(xiàn)有研究對(duì)超聲波對(duì)果蔬汁中微生物的影響及其潛在的安全性問(wèn)題尚不夠深入，因此對(duì)于超聲波殺菌的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用還有很遠(yuǎn)的距離。同時(shí)，超聲波單獨(dú)滅菌不夠徹底，影響因素較多，但與其他滅菌方法聯(lián)合應(yīng)用具有很大的潛力，目前已有對(duì)超聲波聯(lián)合臭氧、納米二氧化鈦、微波、激光、紫外線、超高壓等協(xié)同技術(shù)的研究，但均處于實(shí)驗(yàn)室階段[32]。

2.3 脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)

脈沖電場(chǎng)（Pulsed Electric Field，PEF） 滅菌技術(shù)是一種新型的非熱食品滅菌技術(shù)，PEF 主要是以較高的電場(chǎng)強(qiáng)度（10～50 kV/cm）、較短的脈沖寬度（0～100 μs） 和較高的脈沖頻率（0～2 000 Hz） 對(duì)液體、半固體食品進(jìn)行處理，并且可以組成連續(xù)殺菌和無(wú)菌灌裝的生產(chǎn)線。PEF 可以作為傳統(tǒng)熱滅菌技術(shù)的替代者得到廣泛認(rèn)可，其滅菌效果跟技術(shù)參數(shù)（電場(chǎng)強(qiáng)度、功率、處理時(shí)間） 及微生物本身（類(lèi)型、生長(zhǎng)曲線、形狀） 有很大關(guān)系[33]。

2.3.1 脈沖電場(chǎng)技術(shù)滅菌機(jī)制

目前，關(guān)于PEF 對(duì)微生物的殺滅機(jī)制尚不完全清楚，普遍認(rèn)為PEF 的滅菌作用主要靠電流對(duì)微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞器的電穿孔作用。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度超過(guò)細(xì)胞膜所能承受的閾值時(shí)，電流即可穿過(guò)微生物細(xì)胞形成不可逆損傷，進(jìn)而導(dǎo)致微生物細(xì)胞液滲漏和胞溶作用，達(dá)到滅菌的效果。微生物細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行著活躍的物質(zhì)交換，細(xì)胞膜的完整性對(duì)保證細(xì)胞生命活動(dòng)的正常進(jìn)行極其重要。PEF 的滅菌效果跟微生物的種類(lèi)密切相關(guān)，研究證實(shí)相比革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌對(duì)PEF 的處理更敏感，而酵母菌最不敏感，即PEF 對(duì)酵母菌的殺滅效果不佳[34-35]。

PEF 作為一種新型的食品非熱殺菌技術(shù)，一直受到美國(guó)、德國(guó)、加拿大、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家企業(yè)和研究單位的重視。PEF 能耗小、效率高、對(duì)食品品質(zhì)幾乎沒(méi)有影響，能夠滿足果蔬汁熱敏性加工的需求。PEF 在果汁中應(yīng)用能夠增強(qiáng)大腸桿菌等細(xì)菌的殺滅效果，并且對(duì)果汁本身品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分幾乎沒(méi)有影響。但是，PEF 相較于傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)，其設(shè)備投資成本高，進(jìn)而限制了其在果蔬汁行業(yè)的工業(yè)化應(yīng)用[36]。

目前，在PEF 設(shè)備的研究和制造領(lǐng)域美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)處于國(guó)際領(lǐng)先地位，其已建成一條處理能力2 000 L/h 的準(zhǔn)工業(yè)化生產(chǎn)線，進(jìn)行了橙汁、蘋(píng)果汁等果汁的殺菌研究，并取得了良好效果。而美國(guó)Genesis Juice 公司利用PEF 技術(shù)生產(chǎn)的蘋(píng)果汁、草莓汁等產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)食品藥品管理局的認(rèn)證并在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，其產(chǎn)品所用設(shè)備的處理能力為200 L/h，貨架期為4 周[37]。而國(guó)內(nèi)關(guān)于PET 滅菌技術(shù)在果蔬汁中的應(yīng)用仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，相關(guān)裝備研發(fā)制造及工業(yè)化應(yīng)用尚需時(shí)日。

2.4 紫外照射滅菌技術(shù)

紫外照射（Ultraviolet Irradiation，UI） 滅菌技術(shù)是近年來(lái)應(yīng)用廣泛的一種非熱滅菌技術(shù)，主要是利用紫外燈對(duì)相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行照射殺滅微生物，以達(dá)到滅菌目的。紫外照射設(shè)備簡(jiǎn)單且容易操作，對(duì)于特定微生物來(lái)說(shuō)紫外照射對(duì)其是致命的，且紫外照射處理溫度及濕度均較低。一般應(yīng)用于食品滅菌的紫外線波長(zhǎng)為UV-A （320～400 nm）、 UV-B （280～320 nm） 和UV-C （200～280 nm），其中UV-C 應(yīng)用于果蔬汁加工滅菌效果良好[38]。

2.4.1 紫外照射技術(shù)滅菌機(jī)制

UV-C 波段的紫外照射可以殺滅果汁中的致病菌微生物，作為一種物理處理過(guò)程，UI 不會(huì)給果汁產(chǎn)品帶來(lái)化學(xué)殘留。UI 處理的滅菌機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究和認(rèn)可，其最主要的作用是破壞微生物細(xì)胞的DNA。DNA 暴露于紫外線照射下，堿基對(duì)之間會(huì)形成共價(jià)鍵，同時(shí)生成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。這些具聚體的生成會(huì)導(dǎo)致DNA 螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲，進(jìn)而影響DNA 合成，最終抑制微生物的生長(zhǎng)。紫外線還可以使微生物細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基并與其DNA 和蛋白質(zhì)反應(yīng)，進(jìn)而破壞生長(zhǎng)[39]。影響紫外照射滅菌效率的參數(shù)有紫外光的透過(guò)率、功率、波長(zhǎng)及紫外源和照射路徑的物理排列長(zhǎng)度等，菌株、生長(zhǎng)階段、微生物密度、生長(zhǎng)介質(zhì)及果蔬汁的種類(lèi)和成分等特征也同樣影響著紫外照射殺菌的效果[40]。

2.4.2 紫外照射滅菌在果蔬汁中的應(yīng)用

紫外照射技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，包括延長(zhǎng)貨架期、滅菌、滅殺寄生蟲(chóng)和昆蟲(chóng)繁殖、延遲果實(shí)成熟、滅殺真菌和病毒或?qū)⑵浣抵涟踩降?。而在果蔬汁行業(yè)，已有研究表明通過(guò)UV-C 波段的紫外照射可以有效消滅或抑制蘋(píng)果汁、楊桃汁和柑橘汁中的微生物；同時(shí)，果蔬汁通過(guò)UV-C 處理殺菌時(shí)，還可以最大程度地保持其生物活性組分多酚和黃酮等的活性[41-43]。

目前，在果蔬汁飲料行業(yè)紫外照射滅菌主要應(yīng)用在供水、糖漿、清潔水、廢水、過(guò)濾系統(tǒng)及包裝表面的消毒等[44]，真正應(yīng)用于產(chǎn)品本身的消毒尚未工業(yè)化應(yīng)用，且隨著果蔬汁飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)日益嚴(yán)格，生產(chǎn)過(guò)程中有效的滅菌處理顯得更為重要，紫外照射滅菌相較于其他技術(shù)，具有滅菌環(huán)境溫和、不產(chǎn)生毒素或殘余物、不改變被滅菌目標(biāo)的化學(xué)組分、風(fēng)味和pH 值等優(yōu)點(diǎn)，且系統(tǒng)安裝更換簡(jiǎn)單、維護(hù)成本低，對(duì)工廠現(xiàn)有設(shè)施稍微改造即可實(shí)現(xiàn)。因此，在果蔬汁飲料加工制造中有著良好的應(yīng)用前景。

2.5 其他新型非熱滅菌技術(shù)

高壓二氧化碳（High Pressure Carbon Dioxide，HPCD） 滅菌技術(shù)是果蔬汁飲料加工中的一種新型滅局技術(shù)，CO2是一種無(wú)毒氣體，且具有一定的殺菌效果。已有研究表明，HPCD 應(yīng)用于果蔬汁殺菌可以有效滅活致病微生物和酶，同時(shí)能夠保留果蔬汁中生物組分的活性、色澤和風(fēng)味品質(zhì)等。雖然稱(chēng)之為高壓，但較之超高壓滅菌HPCD 技術(shù)中CO2的壓力小于40 MPa，且處理溫度在20～60 ℃，可以防止熱敏組分分解。將果蔬汁暴露于CO2中增加了微生物停滯期和萌發(fā)時(shí)間，若采用CO2和巴氏殺菌協(xié)同處理，在一定時(shí)間內(nèi)氣體可以滲透至微生物細(xì)胞中，隨后發(fā)生爆破性減壓，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氣體迅速膨脹，進(jìn)而導(dǎo)致微生物細(xì)胞破裂，最終達(dá)到滅菌目的[45]。

冷等離子體（Cold Plasma，CP） 滅菌技術(shù)一般由高壓電場(chǎng)下的氣體介質(zhì)放電所誘發(fā)，利用誘發(fā)的電子、離子、原子、UV 光量子和帶電粒子等混合體滅殺微生物?，F(xiàn)有研究表明，CP 技術(shù)能有效殺滅橙汁、柑橘汁等果蔬汁中的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌[46-47]；CP 技術(shù)處理時(shí)間短、對(duì)樣品的影響不明顯（如橙汁中的維生素C），且能耗遠(yuǎn)低于熱過(guò)程和其他非熱過(guò)程的能耗率，說(shuō)明CP 技術(shù)在果蔬汁滅菌中有非常大的潛力，但該技術(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，工業(yè)化應(yīng)用還需深入研究。

3 結(jié)語(yǔ)

與傳統(tǒng)的熱加工滅菌相比，新型非熱滅菌技術(shù)已經(jīng)在果蔬汁飲料中顯現(xiàn)出一些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其中，冷等離子體滅菌技術(shù)已證實(shí)能對(duì)密封包裝食物中微生物進(jìn)行有效殺滅，通過(guò)后續(xù)深入研究與應(yīng)用，可能成為熱滅菌的真正替代技術(shù)。而超高壓、超聲波、脈沖電場(chǎng)、紫外線照射等新型滅菌技術(shù)雖然單獨(dú)應(yīng)用效果不太理想，但是其與熱處理滅菌相結(jié)合進(jìn)行應(yīng)用已顯示出巨大的滅菌潛力，將是今后技術(shù)與裝備發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)。新型滅菌技術(shù)與熱滅菌聯(lián)合應(yīng)用于果蔬汁飲料加工中，能夠減少處理時(shí)間和降低處理溫度，提高現(xiàn)有技術(shù)滅菌效果，同時(shí)將熱滅菌技術(shù)引起的產(chǎn)品品質(zhì)損失降至最低，還有降低能耗等效果。這些新型非熱滅菌技術(shù)在最小化投資和工藝優(yōu)化的前提下，將會(huì)擁有較大的市場(chǎng)價(jià)值。但是，為了確保新型非熱滅菌技術(shù)能夠真正達(dá)到微生物滅活效果和延長(zhǎng)果蔬汁貨架期，并確保細(xì)菌和芽孢在產(chǎn)品儲(chǔ)存過(guò)程中不會(huì)萌發(fā)，仍需要深入研究。