劉志紅，王 迅，左蘆根

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233004)

《2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)》顯示，僅2015年一年中國(guó)新增癌癥病例429.2萬(wàn)例，因癌癥死亡281.4萬(wàn)例，相當(dāng)于平均每天新增1.2萬(wàn)人，死亡0.78萬(wàn)人。中國(guó)國(guó)家中央癌癥登記處(NCCR)估計(jì)的GC相關(guān)發(fā)病率和死亡率在癌癥中排名第二，2015年導(dǎo)致大約67.9萬(wàn)人死亡[1]。目前對(duì)于胃癌的治療仍以手術(shù)為主，放療和化療作為姑息治療的方式。由于絕大多數(shù)GC缺乏特異的臨床表現(xiàn)，患者在診斷時(shí)多已發(fā)展為晚期，加之腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，以致GC的5年生存率不到25%[2]。嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法作為一種新興的免疫治療方法，以非MHC依賴的方式識(shí)別抗原，已經(jīng)在B細(xì)胞惡性腫瘤中取得突破性的進(jìn)展，而在實(shí)體瘤的研究仍在進(jìn)行之中，且有望突破胃癌傳統(tǒng)治療模式的局限性，為晚期胃癌的治療提供更好的治療方案。

1 CAR-T細(xì)胞療法概述

1.1 CAR-T設(shè)計(jì)的原理T細(xì)胞的活化依賴于雙重信號(hào)途徑，抗原刺激信號(hào)由TCR識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)或靶細(xì)胞表面呈遞的抗原肽-MHC分子復(fù)合物(pMHC)而產(chǎn)生，經(jīng)CD3向胞內(nèi)傳導(dǎo)，初步活化T細(xì)胞[3-4]。共刺激信號(hào)則由APC或靶細(xì)胞表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)共刺激分子相互作用而產(chǎn)生，完全活化T細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子并表達(dá)細(xì)胞因子受體，完成T細(xì)胞的分化增殖。而CAR-T細(xì)胞以非MHC和APC依賴的方式，通過(guò)分離患者外周血T細(xì)胞，利用基因工程將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(tumorsociated antigen，TAA)的胞外抗原結(jié)合單鏈可變區(qū)段(sing chain Fv domain，scFv)、跨膜共刺激結(jié)構(gòu)域與T細(xì)胞的活化相結(jié)合，制備出CAR-T細(xì)胞，并在體外大量擴(kuò)增，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞[5-6]。

1.2 CAR構(gòu)成CAR主要由胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、中間跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)四部分組成。胞外抗原結(jié)合區(qū)由單鏈可變區(qū)段scFv組成，賦予了其特異性識(shí)別TAA的能力。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)包含了T細(xì)胞活化區(qū)和相關(guān)共刺激區(qū)，在激活T細(xì)胞及介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[7]。CAR-T結(jié)構(gòu)至今經(jīng)歷了四代的變革[8-10]。第一代CAR結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，主要通過(guò)CD3向胞內(nèi)傳導(dǎo)，但由于缺乏共刺激分子，無(wú)法使T細(xì)胞進(jìn)一步。第二代CAR相對(duì)于第一代CAR來(lái)說(shuō)，增加了一個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)域(CD28或者CD137),通過(guò)雙重信號(hào)途徑完全活化T細(xì)胞，T細(xì)胞持續(xù)增殖并釋放細(xì)胞因子，增強(qiáng)CAR-T殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。第三代CAR整合了兩個(gè)共刺激信號(hào)域，進(jìn)一步加強(qiáng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，但由于降低了激活T細(xì)胞的閾值，導(dǎo)致信號(hào)泄露，過(guò)度活化的T細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，從而引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的毒副作用。因此，大多數(shù)研究者更偏向于第二代CAR。第四代則在第三代的基礎(chǔ)之上，新增編碼CAR及其啟動(dòng)子的載體，調(diào)控T細(xì)胞的活化。

2 CAR-T細(xì)胞現(xiàn)階段在臨床的應(yīng)用

2.1 血液系統(tǒng)疾病CAR-T細(xì)胞免疫療法已在血液系統(tǒng)疾病中取得了突破性的進(jìn)展，尤其是B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[11]。研究表明[12]以CD19為靶向的CAR-T細(xì)胞能有效殺滅B細(xì)胞性惡性腫瘤(CD19分子陽(yáng)性)，包括CLL、復(fù)發(fā)難治性B細(xì)胞急性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤。這一免疫療法，有望突破傳統(tǒng)治療模式，給血癌患者帶來(lái)福音Pandolfi等人[13]研究表明，用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞治療8例B-ALL，其中6人獲得完全緩解，完全緩解率達(dá)75%。

2.2 實(shí)體瘤近年來(lái)CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤的研究也逐漸開展起來(lái)，取得了可喜的成果，但由于脫靶效應(yīng)、腫瘤局部免疫抑制微環(huán)等限制的CAR-T在實(shí)體瘤中的應(yīng)用。研究人員正努力尋找腫瘤特異性靶點(diǎn)，常見的研究靶點(diǎn)有：人表皮生長(zhǎng)因子受體2用于治療HER-2陽(yáng)性的腫瘤，CEA用于大腸癌、胃癌等，間皮素用于肺癌、乳腺癌的治療等[14-15]。

3 CAR-T治療胃癌的主要靶點(diǎn)

3.1 人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER-2)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)，也稱為CD340，是EGFR家族的一員，由ErbB2原癌基因編碼。 ERBB2在正常人體中僅微弱表達(dá)，而在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌和胃癌等患者中過(guò)表達(dá)[16]，為HER-2作為靶向胃癌的研究提供了理論基礎(chǔ)。有研究人員[17]設(shè)計(jì)了一種含有抗HER2 scFv和CD137的CAR，通過(guò)臨床級(jí)慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將T細(xì)胞與原發(fā)胃癌腫瘤細(xì)胞1(PGCC1)一起孵育來(lái)驗(yàn)證CART-HER2細(xì)胞對(duì)患者來(lái)源的GC細(xì)胞的比活性。此外，當(dāng)T細(xì)胞與原發(fā)胃癌腫瘤細(xì)胞2(PGCC2)相互作用時(shí)，檢測(cè)到最低水平的細(xì)胞因子的表達(dá)。這些結(jié)果表明CART-HER2細(xì)胞可以特異性識(shí)別具有HER2高表達(dá)和低表達(dá)的GC細(xì)胞，使不同程度表達(dá)HER2的GC細(xì)胞激活。在體內(nèi)用babl/c裸鼠構(gòu)建HER2high + 7901細(xì)胞皮下異種移植腫瘤模型并分為兩組，以小鼠的平均腫瘤體積(TV)和平均腫瘤重量(TW)為觀察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組用CART-HER2細(xì)胞處理顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)速率，而對(duì)照組中的腫瘤在注射NT T細(xì)胞后繼續(xù)快速生長(zhǎng)。該研究表明CART-HER2細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中對(duì)HER2陽(yáng)性原代GC細(xì)胞和GCSCs(gastric cancer stem cells)具有特異，具有長(zhǎng)期有效的殺傷腫瘤細(xì)胞活性。

3.2 間皮素(MSLN)間皮素(Mesotheline，MSLN)是一種膜蛋白，在正常間皮組織表達(dá)，在胃癌、間皮瘤和卵巢癌等表達(dá)[18]。Jiang Lv,Ruocong Zhao等人[19]用含有MSLN scFv、CD3ζ、CD28和DAP10細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(M28z10)構(gòu)建CAR，用以靶向MSLN陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)定了KATO III-GL，AGS-GL，BGC-823-GL和MKN-28-GL細(xì)胞系，并對(duì)四個(gè)GC細(xì)胞系上的M28z10T和GFP T細(xì)胞以及用作間皮素陰性對(duì)照的K562-GL細(xì)胞進(jìn)行了18小時(shí)的殺傷測(cè)定，并測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，所有與四種GC細(xì)胞系共培養(yǎng)后，M28z10 T細(xì)胞比GFP T細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而對(duì)于間皮素陰性K562-GL細(xì)胞，細(xì)胞毒性保持幾乎相同。該研究表明M28z10 T細(xì)胞在體外對(duì)GC細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞分泌能力，在不同的異種移植小鼠模型中誘導(dǎo)GC回歸，并且與在腹膜內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移GC模型中的GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞相比，延長(zhǎng)了這些小鼠的存活。

3.3 葉酸受體1(FOLR1)葉酸受體1(FOLR1)是糖基磷脂酰肌醇連接的蛋白質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[20]FOLR1在超過(guò)三分之一的胃癌患者有FOLR1表達(dá)，使其可能成為胃癌靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。Minsung Kim 等人[21]設(shè)計(jì)了由抗FOLR1 scFv，CD28和CD3z組成的FOLR1-CAR。評(píng)估了CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)FOLR1陽(yáng)性和陰性胃癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。他們將胃癌細(xì)胞分為FOLR1陽(yáng)性和FOLR1陰性細(xì)胞，當(dāng)FOLR1-CAR Jurkat細(xì)胞與FOLR1陽(yáng)性細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，IL-2的水平顯著升高。而當(dāng)FOLR1-CAR Jurkat細(xì)胞與FOLR1陰性GC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與單獨(dú)培養(yǎng)的FOLR1-CAR Jurkat細(xì)胞相比，IL-2水平?jīng)]有明顯差異。FOLR1-CAR KHYG-1(一種天然殺傷細(xì)胞系)和FOLR1-CAR T細(xì)胞均以MHC非依賴性方式識(shí)別FOLR1陽(yáng)性胃癌細(xì)胞，并誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的分泌并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。該研究表明靶向FOLR1的CAR KHYG-1/T細(xì)胞對(duì)FOLR1陽(yáng)性胃癌細(xì)胞有明確的殺傷效果。

3.4 單克隆抗體(3H11)抗胃癌單克隆抗體(mAb3H11)由GC細(xì)胞系免疫產(chǎn)生，具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)正常組織反應(yīng)弱，具有副反應(yīng)小的特性。Han H等研究人員[22]收集用GC細(xì)胞免疫的小鼠，并使用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)將其與鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合。通過(guò)GC細(xì)胞中的選擇性培養(yǎng)和ELISA篩選獲得產(chǎn)生mAb的候選雜交瘤細(xì)胞。在所有候選抗體中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mAb-3H11與GC細(xì)胞的結(jié)合具有高度特異性，并且在人GC組織中具有93.5%的反應(yīng)率[22]。實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建以mAb-3H11的單鏈可變片段(scFv)為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞以殺死GC，與對(duì)照CAR T細(xì)胞相比，3H11-CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞細(xì)胞毒性并引發(fā)高水平的IL-2和IFN-γ產(chǎn)生，結(jié)果表明mAb 3H11具有GC診斷或靶向治療的潛力。

此外，目前正在進(jìn)行的CAR-T細(xì)胞治療胃癌的臨床試驗(yàn)存在不同的靶點(diǎn)[23]，臨床試驗(yàn)NCT02349724、NCT01212887以CEA為靶點(diǎn)，NCT02713984以HER-2為靶點(diǎn)，NCT02617134以MUC1為靶點(diǎn)，NCT02725125、NTC03013712以EpCAM為靶點(diǎn)，隨著研究的進(jìn)展，特異性靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將為CAR-T療法在為胃癌中的研究帶來(lái)突破性的進(jìn)展。

4 CAR-T治療胃癌面臨的問(wèn)題

雖然CAR-T細(xì)胞免疫療法在惡性腫瘤的應(yīng)用得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可，但仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。

4.1 脫靶效應(yīng)由于腫瘤細(xì)胞缺乏特異性的靶點(diǎn)，CAT-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，正常器官組織細(xì)胞也遭受不同程度的損害。解決脫靶效應(yīng)的關(guān)鍵在于尋找特異性靶點(diǎn)，并降低胞外單鏈抗體的結(jié)合力減輕免疫反應(yīng)[24]，同時(shí)應(yīng)用抑制性 CAR，調(diào)控CAR—T細(xì)胞的活性。近期Leonardo Morsut等研究人員[25]設(shè)計(jì)了一種基于Notchd的組裝式受體(即SynNotch受體)，并利用一個(gè)特別的系統(tǒng)，使腫瘤上的一個(gè)抗原能夠激活T細(xì)胞中的SynNotch受體，從而激活識(shí)別腫瘤表面第二種抗原CAR的轉(zhuǎn)錄，最終激活T細(xì)胞。依靠多種抗原來(lái)區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞，使得CAR-T細(xì)胞精準(zhǔn)靶向腫瘤細(xì)胞，從而更具適應(yīng)性，有望突破特異性靶點(diǎn)的限制。

4.2 腫瘤免疫抑制微環(huán)境腫瘤免疫抑制微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)包括大量免疫細(xì)胞和各種免疫抑制分子以及細(xì)胞外基質(zhì)等，它們和腫瘤細(xì)胞一起組成復(fù)雜的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)，因此CAR-T細(xì)胞必須穿過(guò)免疫抑制微環(huán)境，到達(dá)腫瘤細(xì)胞周圍才能有效發(fā)揮其殺傷能力。有研究表明[26]聯(lián)合使用CTLA-4或單克隆抗體阻斷免疫檢查點(diǎn)分子PD-1的抑制作用，能進(jìn)一步強(qiáng)化CAR-T的抗腫瘤作用。Darrell J.lrvine等[27]以CAR-T為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一種“抗腫瘤疫苗”，在淋巴結(jié)區(qū)域提前激活T細(xì)胞以對(duì)抗腫瘤周圍免疫環(huán)境的抑制，目前在小鼠實(shí)驗(yàn)中取得了理想的治療效果。

4.3 細(xì)胞因子風(fēng)暴細(xì)胞因子風(fēng)暴(Cytokine release syndrome，CRS)是CAR-T細(xì)胞輸入患者體內(nèi)后產(chǎn)生的最嚴(yán)重的副作用，嵌合抗原受體與腫瘤表面相關(guān)特異性抗原結(jié)合，引發(fā)瀑布式的細(xì)胞因子釋放，激活多種免疫反應(yīng)。Ying Z等[28]構(gòu)建了攜帶CD19-BBz(86)CAR-T細(xì)胞，并在25名ALL患者中進(jìn)行了一項(xiàng)小型的早期臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明：在低劑量和中等劑量治療的患者中，一半出現(xiàn)了臨床緩解顯著降低了CRS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

4.4 CAR-T細(xì)胞的歸巢CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，需要穿過(guò)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)并且克服免疫微環(huán)境對(duì)其的抑制，真正到達(dá)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量并不容樂觀，無(wú)法實(shí)現(xiàn)預(yù)期治療效果。Smith[29]等合成一種生物“骨架”，將CAR-T細(xì)胞及一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包裹其中，有效延長(zhǎng)了CAR-T細(xì)胞的生存時(shí)間，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，有望降低細(xì)胞歸巢對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響。

4.5 腫瘤干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)腫瘤干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能、自我更新、能起始腫瘤增殖的細(xì)胞。CSC參與腫瘤侵犯、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療的耐受[30]，這可能是腫瘤難以治愈、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因。因此，以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞或許能從根源上消滅腫瘤細(xì)胞。

5 總結(jié)與展望

CAR-T細(xì)胞療法自首次提出以來(lái)經(jīng)歷了不斷的更新與發(fā)展，已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了突破性的進(jìn)展，而其在胃癌中的治療仍處于初步階段，尋找腫瘤細(xì)胞特異性的靶點(diǎn)及提高CAR本身抗原選擇范圍至關(guān)重要，突破腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境也成為其CAR-T療法的重要突破口。對(duì)于胃癌，CAR-T療法將傳統(tǒng)治療、靶向治療及免疫治療聯(lián)合殺傷腫瘤細(xì)胞，最終將為胃癌患者贏得更長(zhǎng)久的生存時(shí)間及更高的生活質(zhì)量。