李天鶴，武香梅，劉瑞霞，陰赪宏*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院，北京 100026；2.北京老年醫(yī)院，北京 100095)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率大約為5%～10%。PCOS患者常常伴隨生育力、內(nèi)分泌和代謝功能的改變[1]。PCOS患者主要的臨床特征，包括排卵功能障礙、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變等。此外，PCOS患者主要的代謝功能異常，包括肥胖、代謝綜合征、胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝異常[2]。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者發(fā)生非酒精性脂肪肝疾病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)、酒精性脂肪肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH)和心血管疾病的發(fā)生率高于普通人群[3-4]。

深入研究PCOS的病因?qū)W對(duì)其診斷和治療具有重要的臨床意義，但是由于人類倫理等因素限制了PCOS病因?qū)W的研究進(jìn)程，而動(dòng)物模型恰好能彌補(bǔ)這一不足，豐富PCOS病因?qū)W的基礎(chǔ)研究，是PCOS發(fā)病機(jī)制研究過(guò)程中不可或缺的重要手段。自1960年起，陸續(xù)出現(xiàn)了獼猴、山羊和嚙齒類動(dòng)物的PCOS模型，其中在產(chǎn)前暴露于雄激素的山羊和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物可以很好地模擬人類的PCOS表型[5-7]。山羊和獼猴產(chǎn)前暴露于雄激素均可以出現(xiàn)寡排卵或無(wú)排卵、卵巢多囊樣改變、LH超分泌以及胰島素抵抗等癥狀[8]。由于嚙齒類動(dòng)物的飼養(yǎng)成本低、繁殖較快，易于基因編輯，因此，目前多采用嚙齒類動(dòng)物作為模型研究PCOS的發(fā)病機(jī)制。目前文獻(xiàn)中的嚙齒類PCOS動(dòng)物模型通常利用雄激素、雌激素、芳香酶抑制劑、抗孕激素以及改變光照等手段進(jìn)行PCOS模型的構(gòu)建。不同造模藥物對(duì)大鼠內(nèi)分泌和糖脂代謝的影響不同。

目前缺少PCOS動(dòng)物模型相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，以及對(duì)多種PCOS模型大鼠內(nèi)分泌、糖脂代謝的綜合比較。此外，關(guān)于多種PCOS動(dòng)物模型中主要組織器官結(jié)構(gòu)變化也鮮有報(bào)道。因此，本研究利用脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)、雙氫睪酮(Potent Non-aromatizable Androgen，DHT)和來(lái)曲唑(Letrozole，LET)這3種藥物分別構(gòu)建PCOS大鼠模型，通過(guò)分析各模型構(gòu)建藥物組大鼠內(nèi)分泌代謝水平、各組織器官結(jié)構(gòu)變化，初步了解不同造模藥物在PCOS大鼠模型構(gòu)建過(guò)程中的作用，為今后PCOS疾病的研究提供一定參考。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3～4周齡SD雌性大鼠(SCXK(京)2016-0002)購(gòu)買并飼養(yǎng)在譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)溫度為24～26℃，濕度為50%～70%，光照黑暗時(shí)間比為12 h/12 h，自由飲水取食。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的使用已獲得中國(guó)科學(xué)院大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程符合NIH規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和道德規(guī)定。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：DHEA(D8950，北京索萊寶科技)；DHT(S4757，Selleck，美國(guó))；LET(L6545，Sigma，美國(guó))；睪酮(T，MC12987)、雌二醇(E2，MC12312)、LH(MC12403)、FSH(MC12313)、胰島素(Insulin，INS，MC12996)和ELISA檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)買于北京美辰聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司；甲醇(北京化工廠)；瑞氏染色液(SL7030，北京酷來(lái)博科技)；4%多聚甲醛(G1101，武漢賽維爾生物科技)；顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：選取3～4周齡SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脫氫表雄酮(DHEA)組、雙氫睪酮(DHT)組、和來(lái)曲唑(LET)組，分別給予皮下注射注射用油劑、6 mg/100 g DHEA[9]、85 μg DHT[10]、1 mg/kg LET[11]，每天1次，連續(xù)注射21 d。造模第22天，將大鼠分為2部分，一部分用于取材(每組6只)，一部分進(jìn)行動(dòng)情周期觀察(每組4只)。

2.取材：大鼠造模第22天，用消毒的注射器從大鼠眼球取血并分離血清待測(cè)。大鼠斷頸處死，將新鮮心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織固定于4%多聚甲醛，24 h后用于HE染色。

3.體重的測(cè)定：每7 d稱量大鼠體重。造模第22天，大鼠斷頸處死分離心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織并稱重。

4.大鼠動(dòng)情周期觀察：從大鼠給藥第22天開(kāi)始，每天上午10：00用無(wú)菌棉簽浸泡在0.9%的生理鹽水中，沿陰道璧的前1/3處涂抹并沿同一方向涂抹到玻片上，用無(wú)水甲醇固定陰道脫落細(xì)胞5～8 min，滴加2～3滴瑞氏染色液染色3 min，滴加等量磷酸鹽緩沖液，輕晃玻片至均勻，靜置5 min，水洗至少3 min，待自然干燥或吸干，鏡檢[12]，連續(xù)10 d，并繪制動(dòng)情周期曲線。動(dòng)情前期涂片特征：以小、圓、有核上皮細(xì)胞(鱗狀上皮細(xì)胞)存在為特征；動(dòng)情期：以不規(guī)則(角質(zhì)化)的鱗狀上皮細(xì)胞為特征；動(dòng)情后期：以白細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞為特征；動(dòng)情間期：白細(xì)胞和圓上皮細(xì)胞出現(xiàn)為特征。大鼠失去規(guī)律的動(dòng)情周期，或持續(xù)處于動(dòng)情間期，則提示無(wú)排卵。

5.大鼠血清激素水平檢測(cè)：取各組血清按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)T、E2、LH和FSH含量，用酶標(biāo)儀(Spark 10M，Tecan，Switzerland)于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)其OD值。

6.大鼠血清生化檢測(cè)：使用全自動(dòng)生化分析儀Olympus AU400(Olympus，日本)檢測(cè)各組大鼠血清中總膽固醇(Total Cholesterol，TCHO)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、葡萄糖(Glucose，GLU)和INS含量。穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-IR)是用于評(píng)價(jià)個(gè)體的INS抵抗水平的指標(biāo)，HOMA-IR=空腹血糖水平×空腹胰島素水平/22.5。

7. HE染色：將取到的心、肝、脾、肺、腎和卵巢等組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后在顯微鏡下觀察，記錄染色結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)中每組選取3～4只大鼠，每次實(shí)驗(yàn)任意選取3～4張切片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、大鼠血清中激素水平測(cè)定

與對(duì)照組相比，DHEA組血清T、E2水平顯著升高(P<0.05)，而血清LH、FSH水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，DHT組血清E2、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清T、FSH水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，LET組血清T、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清E2水平顯著降低(P<0.05)，而FSH水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清激素水平比較(-±s)

二、動(dòng)情周期的檢測(cè)

經(jīng)過(guò)連續(xù)10 d的涂片及鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組動(dòng)情周期變化如圖1所示。與對(duì)照組相比，3種建模藥物組均無(wú)明顯的大鼠動(dòng)情周期變化，持續(xù)處于動(dòng)情間期，提示無(wú)排卵，其中DHEA組處于動(dòng)情間期時(shí)間最長(zhǎng)。

A：對(duì)照組；B：DHEA組；C：DHT組；D：LET組；P：動(dòng)情前期；E：動(dòng)情期；M/D：動(dòng)情后期/間期圖1 各組大鼠動(dòng)情周期曲線

三、卵巢病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，3種建模藥物均能引起卵巢組織發(fā)生囊樣改變(箭頭所示)，其中DHEA組大鼠卵巢多囊樣改變最為顯著(圖2)。

四、各組大鼠糖脂水平比較

與對(duì)照組相比，DHEA組TCHO、INS水平及HOMA-IR顯著增高(P<0.05)，TG、GLU水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，DHT組TCHO、INS、TG、GLU水平及HOMA-IR均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，LET組TCHO、TG、GLU水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，INS水平及HOMA-IR顯著增高(P<0.05)(表2)。

五、大鼠體重及各組織重量的變化情況比較

與對(duì)照組相比，DHEA組、DHT組大鼠體重變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而LET組大鼠體重顯著升高(P<0.05)(圖3A)。造模第21天，與對(duì)照組相比，DHEA組大鼠心臟/體重比、肝臟/體重比顯著增加(P<0.05)，而卵巢/體重比顯著下降(P<0.05)，脾、肺和腎/體重比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，DHT組和LET組大鼠的心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織重量/體重比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖3B)。

A：對(duì)照組；B：DHEA組；C：DHT組；D：LET組；箭頭示囊樣改變圖2 各組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)(HE染色 ×40)

表2 各組大鼠血清中糖脂含量比較(-±s)

A：體重的變化；B：各組織器官重量的變化；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 各組大鼠體重及各組織重量的變化情況

六、各組大鼠主要組織器官結(jié)構(gòu)的變化情況

對(duì)照組和DHEA組中大鼠心臟組織中的心肌細(xì)胞呈不規(guī)則形，核卵圓形，細(xì)胞核1～2個(gè)，位于細(xì)胞中央；DHT組和LET組大鼠心臟組織中的局灶細(xì)胞間可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

對(duì)照組和DHT組大鼠肺臟組織中肺泡結(jié)構(gòu)尚在，部分肺泡腔輕度塌陷，肺泡間隔增寬，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；DHEA組大鼠大部分肺泡腔輕度塌陷，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；LET組大鼠大部分肺泡間隔增寬，支氣管周圍淋巴組織增生。

各組大鼠的脾臟組織中，紅髓和白髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小結(jié)生發(fā)中心明顯，邊緣帶清晰可見(jiàn)，脾索及脾竇結(jié)構(gòu)清晰，與對(duì)照組比較，DHEA組大鼠脾小結(jié)生發(fā)中心不明顯，局部伴纖維組織增生(圖4)。

圖4 各組大鼠主要器官組織結(jié)構(gòu)(HE染色 ×100)

討 論

本研究建立并比較了3種PCOS造模藥物對(duì)大鼠內(nèi)分泌和各組織器官結(jié)構(gòu)的影響。我們的研究結(jié)果顯示，DHEA、DHT和LET 3種建模藥物對(duì)大鼠血清激素水平、體重以及各組織器官結(jié)構(gòu)等方面的作用各不相同，為今后構(gòu)建PCOS動(dòng)物模型提供一定參考。

高雄激素血癥是PCOS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。大鼠孕期DHT短期處理可以顯著上調(diào)雄激素水平[13]，而本研究中，DHT處理育齡期大鼠 21 d后，大鼠PCOS表型不明顯，T未出現(xiàn)升高趨勢(shì)，E2和LH水平顯著增加，卵巢組織出現(xiàn)多囊改變，這可能與藥物處理時(shí)間的長(zhǎng)短和處理方式有關(guān)系。DHEA處理可以上調(diào)大鼠血清中E2和T水平。而LET處理上調(diào)了LH水平，下調(diào)E2水平。因此，可以看出3種不同PCOS造模藥物，對(duì)大鼠性激素的調(diào)控作用不同。此外，3種PCOS模型藥物均可以誘導(dǎo)大鼠動(dòng)情周期失調(diào)，可能與雄激素暴露有關(guān)。產(chǎn)后暴露于丙酸睪酮(Testosterone Propionate，TP)、產(chǎn)前暴露于DHT、長(zhǎng)期暴露于DHT均可以導(dǎo)致大鼠排卵功能障礙，而DHEA處理大鼠可以導(dǎo)致生殖障礙[14-16]。

除性激素水平的改變外，肥胖和胰島素抵抗也是PCOS的重要臨床表現(xiàn)之一[17]。在模型構(gòu)建期間，與對(duì)照組比較，DHEA組和DHT組大鼠體重?zé)o顯著變化，但是DHEA組大鼠血清中TCHO含量顯著增加(P<0.05)，并表現(xiàn)出胰島素抵抗癥狀。在造模第21天，LET組大鼠體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并表現(xiàn)出胰島素抵抗，這可能與性激素水平有關(guān)[18-19]。因此，DHEA和LET誘導(dǎo)的PCOS動(dòng)物模型可能更加適用于進(jìn)行糖脂代謝相關(guān)方面的研究。

PCOS可以導(dǎo)致慢性無(wú)排卵、高雄激素血癥、不孕和肥胖等疾病，增加NAFLD、NASH和心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20-21]。其中雄激素發(fā)揮了重要作用，長(zhǎng)期T處理可以導(dǎo)致大鼠體重增加，導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)一步引起肝損傷[22]。利用DHEA處理大鼠21 d，誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生，從而促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積[23]。此外，雄激素對(duì)炎癥的調(diào)控具有細(xì)胞特異性。DHT重建減少了過(guò)敏性肺炎癥小鼠的肺部炎癥，但它增強(qiáng)了肺泡巨噬細(xì)胞的M2極化。在體外也能增強(qiáng)IL-4刺激的M2巨噬細(xì)胞極化[24]。DHT組和LET組大鼠心臟組織中的局灶細(xì)胞間可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；DHEA處理可導(dǎo)致大鼠肺泡腔輕度塌陷，以及少許淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；此外，DHEA處理大鼠，可導(dǎo)致脾臟組織中脾小結(jié)生發(fā)中心不明顯，局部伴纖維組織增生；LET處理可導(dǎo)致大鼠肺泡間隔增寬，支氣管周圍淋巴組織增生?？梢?jiàn)，除誘導(dǎo)PCOS表型外，DHEA、DHT和LET還可對(duì)大鼠的部分組織和器官的結(jié)構(gòu)造成影響。