祁亞楠，尚茜，齊詠,★

（1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州；2.河南省人民呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題，直接影響著3億多人，是世界上第三大死亡原因[1]。同時(shí)，由于缺乏有效的治療策略，導(dǎo)致醫(yī)療成本巨大，成為主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[2]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，隨著全基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和甲基化芯片技術(shù)的出現(xiàn)，大量研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與COPD相關(guān)[3]。在不影響DNA序列的情況下，遺傳和環(huán)境因素均可通過(guò)調(diào)控基因的DNA甲基化來(lái)影響DNA片段的活性，從而調(diào)控基因表達(dá)，參與COPD的病理生理過(guò)程。

1 DNA 甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將一個(gè)甲基基團(tuán)加到胞嘧啶殘基的5’端，可逆地修飾DNA結(jié)構(gòu)而不改變DNA序列，通過(guò)影響DNA片段的活性調(diào)控基因表達(dá)的過(guò)程。DNA序列中富含GC的CpG二核苷酸簇被稱(chēng)為CpG島，通?；騿?dòng)子區(qū)域中CpG島的DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致基因沉默，而甲基化不足會(huì)觸發(fā)轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控基因表達(dá)。與基因啟動(dòng)子區(qū)域相反，基因體中的DNA甲基化常與DNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)[4]。

2 COPD 與 DNA 甲基化

COPD是一種進(jìn)行性肺部疾病，與年齡和吸煙有關(guān)，由于慢性支氣管炎和肺氣腫導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的氣流受限。其特征在于不可逆的氣流受限，通常是漸進(jìn)性的，并伴隨著呼吸道和肺部對(duì)有害顆?；驓怏w（特別是香煙煙霧）的慢性炎癥反應(yīng)[5]。COPD的發(fā)病機(jī)制包括彈性蛋白酶-抗彈性蛋白酶假說(shuō)、慢性炎癥、氧化劑-抗氧化劑的失衡、細(xì)胞凋亡和無(wú)效修復(fù)等，吸煙是其主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。DNA甲基化是連接環(huán)境與遺傳基礎(chǔ)的橋梁，穿插在COPD的各個(gè)發(fā)病機(jī)制之中介導(dǎo)基因表達(dá)[6]。已有較多證據(jù)表明COPD的存在和嚴(yán)重程度與DNA甲基化的異常表達(dá)有關(guān)[7-11]，DNA甲基化可能是COPD特異性基因表達(dá)改變的基礎(chǔ)，對(duì) DNA 甲基化的深入研究為COPD開(kāi)發(fā)新的表觀遺傳治療干預(yù)措施提供機(jī)會(huì)。

2.1 肺功能與異常的DNA 甲基化

COPD 是一種氣道疾病，肺功能降低是其診斷的必備條件，肺功能檢查有助于 COPD 的診斷和病情評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)芳基烴受體阻遏基因(AHRR)cg05575921位點(diǎn)低甲基化與吸煙、肺功能低下、肺功能急劇下降和呼吸系統(tǒng)癥狀相關(guān)[12]。Kodal等人[13]對(duì)1991-1994年哥本哈根城市心臟隊(duì)列研究的9113個(gè)個(gè)體行外周血AHRR甲基化測(cè)定及肺功能檢查，于2001-2003年對(duì)其中4532個(gè)個(gè)體再次行外周血AHRR甲基化測(cè)定及肺功能檢查，橫斷面研究結(jié)果表明AHRR低甲基化與FVC、FEV1/FVC有關(guān)，前瞻性分析發(fā)現(xiàn)AHRR甲基化程度與FEV1/身高和FVC/身高有關(guān)，與FEV1/FVC(p=0.08)無(wú)關(guān)。IL6、IFNγ 具有促炎和抗炎的雙重作用，可能通過(guò)激活負(fù)反饋發(fā)揮作用，其基因的低甲基化與FEV1升高相關(guān)[14]。

在兩個(gè)關(guān)于COPD的研究隊(duì)列中，Qiu等人[15]通過(guò)Illumina27K陣列觀察到349個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化與COPD的存在和嚴(yán)重程度（是否存在 COPD、FEV1/FVC、FEV1）相關(guān)。349個(gè)CpG位點(diǎn)的基因（330個(gè)基因）分析表明，許多基因參與了免疫和炎癥反應(yīng)、對(duì)壓力的反應(yīng)、以及傷口愈合和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。其中與FEV1/FVC關(guān)聯(lián)最高的五位是SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、TRPM2和LRP3基因的CpG位點(diǎn)，與FEV1關(guān)聯(lián)最高的五位是 SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、FUT7和 STAT5A基因的CpG位點(diǎn)，其中SERPINA1基因的2個(gè)CpG位點(diǎn)cg02181506和cg24621042與 COPD、FEV1/FVC、FEV1均顯著相關(guān)。

與Qiu等人的研究不同，De Vries等人發(fā)現(xiàn)36個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平與FEV1/FVC相關(guān)[16]，但與COPD的存在與否無(wú)關(guān)[17]，這兩項(xiàng)研究的結(jié)果不同，可能是因?yàn)檫@兩項(xiàng)研究均為非隨機(jī)橫斷面研究且納入標(biāo)準(zhǔn)不同，同時(shí)表明DNA甲基化研究是高度可變的。Bermingham等人[18]通過(guò)Illumina 850K陣列進(jìn)一步確認(rèn)了28個(gè)與是否存在COPD和呼吸功能特征（FEV1、FVC和FEV1/FVC）相關(guān)的差異甲基化修飾位點(diǎn)（DMS）,這些DMS位點(diǎn)被定位到參與選擇性剪接、JAK-STAT信號(hào)通路和軸突相關(guān)的基因上，具體作用機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化未來(lái)有可能成為評(píng)估COPD存在、嚴(yán)重程度、肺功能及預(yù)后的生物標(biāo)志物，為COPD的診斷及病情評(píng)估提供新的方法。

2.2 COPD 的發(fā)病機(jī)制與異常的DNA 甲基化

2.2.1 細(xì)胞凋亡

Notch1能通過(guò)抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路來(lái)減輕COPD患者香煙煙霧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[19]，ERK通路通過(guò)調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (mtTFA)啟動(dòng)子的甲基化參與COPD的發(fā)生發(fā)展[20]。Qiu等人[21]通過(guò)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞和鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)由Notch信號(hào)激活介導(dǎo)的Klotho甲基化可以通過(guò)增加炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來(lái)參與COPD的發(fā)病機(jī)制，因此未來(lái)Notch可作為COPD、抗衰老因子和抑癌劑的藥物作用靶點(diǎn)。

COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力下降，并且該缺陷可能與鞘氨醇-1磷酸酯系統(tǒng)有關(guān)，特別是鞘氨醇-1-磷酸受體5（sphingosine-1-phosphate receptor 5，S1PR5）。為進(jìn)一步研究COPD與S1PR5的關(guān)系，Barnawi等人[22]從COPD患者中分離出肺泡巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞S1PR5啟動(dòng)子甲基化水平低于健康非吸煙者，與S1PR5的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。而體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞經(jīng)甲基化抑制劑處理后吞噬能力增強(qiáng)，且增強(qiáng)程度與抑制劑劑量呈正相關(guān)。

2.2.2 氧化應(yīng)激

既往研究表明DNA甲基化與香煙煙霧/氧化劑介導(dǎo)的肺部疾病有關(guān)[23]，氧化應(yīng)激是吸煙誘導(dǎo) C0PD 發(fā)病的重要機(jī)制之一。COPD的發(fā)生與肺中的主要抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)在氣道上皮細(xì)胞中的合成速率直接相關(guān)，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）是GSH合成的限速酶的調(diào)節(jié)亞基，GCLC啟動(dòng)子的高甲基化與COPD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。CHENG等人[24]發(fā)現(xiàn)與肺功能正常的前吸煙者和從不吸煙者組相比，當(dāng)前吸煙者和COPD患者肺組織中GCLC啟動(dòng)子的高甲基化，降低了GCLC mRNA的表達(dá)、血漿GSH水平。煙草提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷（AZA；脫甲基試劑）處理后GCLC的表達(dá)增高。Peng等人[19]在COPD患者肺組織、CSE處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中發(fā)現(xiàn)mtTFA啟動(dòng)子高甲基化、mtTFA mRNA和蛋白表達(dá)下降，而AZA可恢復(fù)CSE引起的HUVECs中mtTFA的表達(dá)。表明吸煙誘導(dǎo)的相關(guān)基因啟動(dòng)子高甲基化可能與COPD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，未來(lái)可能通過(guò)開(kāi)發(fā)去甲基化藥物為COPD的干預(yù)提供新的策略。

Vucic等人[25]對(duì)COPD患者及對(duì)照組的小氣道上皮的DNA和RNA進(jìn)行了全基因組甲基化和基因表達(dá)檢測(cè)，通過(guò)富集分析，發(fā)現(xiàn)COPD患者DNA甲基化和基因表達(dá)水平顯著差異的3條通路：磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）信號(hào)傳導(dǎo)通路、NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路以及IL-17炎癥反應(yīng)通路，其中Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路最顯著，有46個(gè)基因的甲基化差異表達(dá)。COPD患者PTEN通路中的PTEN和CSNK2A2基因高度甲基化、表達(dá)不足；Nrf2通路是抵抗氧化應(yīng)激的主要細(xì)胞防御系統(tǒng)，該通路中的兩個(gè)基因EPHX1和CYP4F11是整體甲基化和表達(dá)改變最負(fù)相關(guān)的基因，COPD 患者 EPHX1 和 CYP4F11的表達(dá)降低；IL-17的過(guò)表達(dá)與許多炎癥性疾病有關(guān)，但其在COPD中的作用尚不明確，COPD患者該途徑中的上游受體IL17RC和下游受體CXCL1高甲基化且表達(dá)不足，促炎性CSF2基因低甲基化、過(guò)表達(dá)。

2.2.3 肺氣腫

DNA甲基化參與肺氣腫的病理生理過(guò)程。Yoo等人[26]確定了126個(gè)COPD的調(diào)節(jié)因子，其中EPAS1是唯一的關(guān)鍵調(diào)控因子,EPAS1是一種低氧反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，也稱(chēng)為低氧誘導(dǎo)因子2α，其下游基因與COPD疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的多個(gè)基因組明顯重疊，包括缺氧應(yīng)答基因和與肺氣腫嚴(yán)重程度相關(guān)的基因。與對(duì)照組相比，COPD患者肺組織中的EPAS1甲基化水平與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，且 EPAS1蛋白表達(dá)降低。

干細(xì)胞抗原1（Sca-1）是一種小鼠糖基磷脂酰肌醇固定蛋白，是造血干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記，也可以由非造血器官中的組織駐留干細(xì)胞和祖細(xì)胞表達(dá)，內(nèi)皮祖細(xì)胞是造血干細(xì)胞的一種亞型，通過(guò)歸巢在損傷部位促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)。He等人[27]研究的結(jié)果表明，祖細(xì)胞池的消耗和Sca-1基因的甲基化可能與小鼠肺氣腫的發(fā)生發(fā)展有關(guān),通過(guò)DNA甲基化抑制劑地西他濱可以抑制Sca-1基因的甲基化，增強(qiáng)肺組織和骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞中Sca-1的表達(dá),部分保護(hù)小鼠免受CSE誘導(dǎo)的肺氣腫。另一項(xiàng)關(guān)于抗凋亡Bcl-2的實(shí)驗(yàn)[28]支持DNA甲基化參與肺氣腫的發(fā)生，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹膜內(nèi)注射CSE建立小鼠的肺氣腫模型，發(fā)現(xiàn)CSE注射組肺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組（（25.88±7.55）%VS（6.28±2.96）%）。與對(duì)照組小鼠相比，在CSE注射小鼠中觀察到Bcl-2啟動(dòng)子高甲基化、Bcl-2表達(dá)降低，而通過(guò)AZA可使Bcl-2啟動(dòng)子去甲基化、Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，減輕了CSE引起的肺細(xì)胞凋亡和功能衰竭。這表明抗凋亡的Bcl-2啟動(dòng)子甲基化可能是CSE誘導(dǎo)的肺氣腫細(xì)胞凋亡增加的原因。

2.2.4 粘液高分泌

黏液分泌過(guò)多會(huì)增加COPD患者的發(fā)病率和死亡率，與杯狀細(xì)胞化生有關(guān)。杯狀細(xì)胞化生是由一個(gè)龐大的基因網(wǎng)絡(luò)決定的，是COPD的共同特征，轉(zhuǎn)錄因子SPDEF和FOXA2是杯狀細(xì)胞化生的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。Song等人[29]將COPD患者和對(duì)照組的氣道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化為杯狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞在IL-13誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞SPDEF啟動(dòng)子CpG 8位點(diǎn)高甲基化、SPDEF表達(dá)增加，F(xiàn)OXA2低甲基化（CpG 14、15）、FOXA2表達(dá)降低；與對(duì)照組相比，在不存在IL-13的情況下COPD患者上皮細(xì)胞SPDEF啟動(dòng)子CpG 6位點(diǎn)低甲基化、SPDEF表達(dá)增加，F(xiàn)OXA2低甲基化（CpG 10、11）而表達(dá)水平?jīng)]有變化。因此SPDEF和FOXA2的異常DNA甲基化可能是COPD粘液高分泌的潛在因素之一，為表觀遺傳學(xué)抑制粘液高分泌開(kāi)辟了新的途徑。

2.3 COPD 表型與異常的DNA 甲基化

明確COPD表型的異質(zhì)性對(duì)個(gè)體化醫(yī)療的發(fā)展具有重要意義，而相關(guān)基因的DNA甲基化表達(dá)對(duì)COPD的分型具有積極作用。Lee等人[30]采用全基因組分析比較了24例急性加重期COPD患者與12例非COPD對(duì)照者外周血單核細(xì)胞甲基化水平，發(fā)現(xiàn)PRKAG2基因相關(guān)CpG位點(diǎn)在COPD患者和正常受試者中具有不同的甲基化水平，ALOX5AP基因相關(guān)CpG位點(diǎn)甲基化水平與對(duì)類(lèi)固醇激素治療反應(yīng)良好相關(guān)。PRKAG2是腺苷酸激活蛋白激酶的一個(gè)非催化亞基，腺苷酸激活蛋白激酶與COPD患者肌肉自噬增強(qiáng)有關(guān)[31]，ALOX5AP涉及白三烯的生物合成，是阻斷白三烯生成的藥物靶點(diǎn)，且ALOX5AP抑制劑已被應(yīng)用于包括COPD在內(nèi)的炎性疾病的治療[32]。

Rosas-Alonso等人[33]通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)COPD患者頰上皮miR-7甲基水平，發(fā)現(xiàn)肺氣腫表型COPD患者miR-7甲基化水平較高。未來(lái)有可能根據(jù)DNA甲基化標(biāo)記，對(duì)COPD患者進(jìn)行分型來(lái)指導(dǎo)COPD患者的治療，如對(duì)類(lèi)固醇激素治療反應(yīng)良好的COPD患者可認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)特的亞型。

2.4 其他

吸煙是COPD與肺癌共同的主要危險(xiǎn)因素，兩種疾病之間存在密切的聯(lián)系[34]。Tessema等人[35]通過(guò)Illumina 450K陣列對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者肺組織進(jìn)行了表觀基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)與COPD相關(guān)的CCDC37和MAP1B表達(dá)降低可能導(dǎo)致這些基因高甲基化進(jìn)而導(dǎo)致肺癌。腫瘤組織CCDC37和MAP1B的甲基化水平高于無(wú)癌肺組織，其中患有COPD的癌組織甲基化水平最高，且甲基化水平與CCDC37和MAP1B的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。與健康吸煙者相比，COPD患者的痰中CCDC37甲基化更為普遍，表明CCDC37和MAP1B的甲基化水平未來(lái)有可能成為預(yù)測(cè)COPD、肺癌發(fā)生的可能性的生物標(biāo)志物。

Wielscher等人[36]通過(guò)臨床病例研究發(fā)現(xiàn)了COPD 患者cg05979020（HOXD10）、cg05964935（N/A）、cg05769349（TBX5）和cg10384245（ADCYAP1）高甲基化。Busch等人[37]發(fā)現(xiàn)與COPD相關(guān)性最高的五個(gè)位點(diǎn)甲基化百分比的平均差異為5.3%至9.6%，其中甲基化最高的差異位點(diǎn)是cg16361890，其定位于MAML1基因，其余4個(gè)位點(diǎn)的基因注釋為RBFOX2、CD72、GRASP和SH3TC1，與肺和氣道生理相關(guān)[37]。

不同細(xì)胞或不同部位的DNA甲基化水平不同。Amstrong等人[38]通過(guò)Illumina 850K陣列對(duì)上葉、下葉不同部位的肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行了全基因組DNA甲基化檢測(cè)，在95個(gè)CpG位點(diǎn)上觀察到顯著的甲基化差異，這些基因包括CLIP4、HSH2D、NR4A1、SNX10和TYK2，是炎癥、免疫相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的參與者。CLIFFORD等人[39]分離出具有和不具有COPD的個(gè)體的氣道和實(shí)質(zhì)成纖維細(xì)胞，進(jìn)行DNA 甲基化檢測(cè)，僅在實(shí)質(zhì)成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)差異DNA甲基化與差異基因表達(dá)相關(guān)。此外研究發(fā)現(xiàn)與非西班牙裔白人相比，非西班牙裔黑人的DNA甲基化水平明顯較低[40]，表明DNA甲基化因性別和種族/民族的不同而不同，DNA甲基化作為表觀遺傳標(biāo)記時(shí)需要考慮地域、種族等這些變量。

3 存在的問(wèn)題及展望

大量研究表明，DNA甲基化與COPD有關(guān)，但發(fā)表的數(shù)據(jù)缺乏一致性，可能與研究的異質(zhì)性有關(guān)如種族、研究設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室方法和統(tǒng)計(jì)分析等。此外，由于缺乏前瞻性研究數(shù)據(jù)，DNA甲基化是導(dǎo)致疾病的原因或疾病導(dǎo)致的結(jié)果有待商榷，需要進(jìn)一步的前瞻性研究以固定時(shí)間間隔的進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)，以評(píng)估疾病發(fā)生和甲基化的時(shí)間序列。

DNA甲基化是一種重要的基因組表觀修飾形式，在COPD發(fā)生發(fā)展的中起著關(guān)鍵作用。表觀遺傳藥物治療COPD的探索是一個(gè)巨大的研究領(lǐng)域，本領(lǐng)域的深入研究將進(jìn)一步揭示COPD的病理生理，為COPD的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。