鄒亮 ，田慧慧

1中國(guó)科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190

2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

光遺傳是一種結(jié)合光控技術(shù)和基因技術(shù)的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，能夠以毫秒級(jí)的時(shí)間精度對(duì)特定類型神經(jīng)元的電活動(dòng)實(shí)現(xiàn)選擇性地激活或抑制1-4。利用基因技術(shù)使光敏蛋白基因在特定類型神經(jīng)元的細(xì)胞膜上表達(dá)光敏蛋白離子通道或離子泵，通過相應(yīng)波長(zhǎng)激發(fā)光照射，能夠控制細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的光敏蛋白的激活與抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)性的調(diào)控，揭示各種神經(jīng)元在神經(jīng)環(huán)路中的功能和相互聯(lián)系方式。近年來，隨著光控技術(shù)和基因技術(shù)的進(jìn)步，光遺傳在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展。盡管如此，目前報(bào)導(dǎo)的光敏蛋白普遍采用可見光作為激發(fā)光2,5-7，這給神經(jīng)調(diào)控帶來了許多難題。由于組織對(duì)可見光的吸收和散射非常嚴(yán)重8,9，這會(huì)導(dǎo)致激發(fā)光能量的損失和組織發(fā)熱，因此為了調(diào)控深腦組織神經(jīng)元的活動(dòng)，就必須將光纖或者光電器件(如uLED)植入到目標(biāo)腦區(qū)10-15。然而這種侵入式的調(diào)控會(huì)造成較嚴(yán)重的組織損傷，并且植入光纖的后端通常需要連接外部設(shè)備，會(huì)在一定程度上限制動(dòng)物的活動(dòng)，進(jìn)而影響動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的可靠性。

針對(duì)上述難題，研究人員研發(fā)出了許多新型光敏蛋白。例如Bedbrook等16研發(fā)了一種新型光敏蛋白-ChRger2，雖然這種光敏蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)仍然位于可見光的藍(lán)光波段，但是由于它的光敏性遠(yuǎn)大于常用的藍(lán)光激活光敏蛋白ChR2(H134R)：一種常用于體內(nèi)光遺傳的增強(qiáng)型光電流單突變體，因此所需的激發(fā)光強(qiáng)度很小。利用這種新型光敏蛋白，Bedbrook等成功地通過顱外藍(lán)光照射激活了小鼠右側(cè)次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層的神經(jīng)元，對(duì)小鼠的轉(zhuǎn)向行為進(jìn)行了調(diào)控。值得注意的是，一方面該研究選取的腦區(qū)位于大腦表層，并且對(duì)顱骨做了鉆薄處理，這種新型光敏蛋白對(duì)位于大腦深處神經(jīng)元的調(diào)控能否起作用有待驗(yàn)證，另一方面由于組織對(duì)藍(lán)光有很強(qiáng)的散射作用，這種施加激發(fā)光的方式難以實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦深處小體積核團(tuán)的精準(zhǔn)照射。由于組織對(duì)長(zhǎng)波段光的吸收和散射作用較小，在過去的研究中，除了研發(fā)新型高光敏性的光敏蛋白之外，在開發(fā)能夠?qū)⒓ぐl(fā)波長(zhǎng)紅移的新型光敏蛋白方向也取得了一系列的進(jìn)展。比如，2008年Zhang等17研發(fā)了VChR1光敏蛋白，這種光敏蛋白在黃光(589 nm)照射下就能激發(fā)出動(dòng)作電位。相比于常用的藍(lán)光(473 nm)激發(fā)光敏蛋白ChR2和VChR1，實(shí)現(xiàn)了激發(fā)光紅移；黃光在組織中的穿透性強(qiáng)于藍(lán)光，因此激活組織中VChR1所需激光能量更低，降低了組織發(fā)熱現(xiàn)象。然而這種紅移光敏蛋白產(chǎn)生光電流的動(dòng)力學(xué)性能差，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的高頻調(diào)控，并且它在細(xì)胞膜上的表達(dá)能力較差。2013年，Lin等18報(bào)導(dǎo)了ReaChR光敏蛋白，他們利用這種光敏蛋白實(shí)現(xiàn)了顱外紅光(655 nm)照射，調(diào)控小鼠觸須的運(yùn)動(dòng)行為。相比于VChR1，該蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)進(jìn)一步紅移，且在細(xì)胞膜上的表達(dá)能力得到了提高。還有許多團(tuán)隊(duì)在光敏蛋白激發(fā)光紅移方向做了努力，比如2011年Yizhar等19報(bào)導(dǎo)的光敏蛋白C1V1 (E122T)在紅光(630 nm)照射下能可靠地觸發(fā)動(dòng)作電位，2014年Klapoetke等20報(bào)導(dǎo)的光敏蛋白Chrimson能穩(wěn)定地被紅光(660 nm)激活。但到目前為止，以近紅外光(NIR，650-1350 nm)為激發(fā)光的光敏蛋白尚未有報(bào)導(dǎo)。

作為一種替代手段，上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)可以將低頻的NIR轉(zhuǎn)換成高頻的可見光用于激活光敏蛋白，間接實(shí)現(xiàn)NIR光遺傳體系21,22。由于生物組織對(duì)NIR的吸收和散射作用較弱23-26，因此UCNPs介導(dǎo)的NIR光遺傳體系相比于其他光遺傳體系具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。理論上，將UCNPs引入表達(dá)了光敏蛋白的神經(jīng)元附近，通過照射NIR，即可控制神經(jīng)元表面離子通道的激活或關(guān)閉。然而在活體光遺傳實(shí)驗(yàn)中，還需要考慮諸多因素。首先，UCNPs的各項(xiàng)參數(shù)應(yīng)當(dāng)與光遺傳實(shí)驗(yàn)相匹配：1)激活UCNPs所需的激發(fā)光在組織中的穿透能力和吸收性；2)UCNPs的發(fā)射光譜與所用光敏蛋白的激發(fā)光譜的匹配性，二者重合度越高，越容易實(shí)現(xiàn)對(duì)UCNPs的激活；3)UCNPs的發(fā)光壽命與選用的光敏蛋白對(duì)激發(fā)光的響應(yīng)時(shí)間的匹配性。其次，在激發(fā)光波長(zhǎng)等條件一定的情況下，若UCNPs上轉(zhuǎn)換效率較低，則需要使用較大功率的NIR才能得到足夠高的上轉(zhuǎn)換熒光能量來激活光敏蛋白，而大功率NIR會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)熱，這嚴(yán)重制約了UCNPs在光遺傳實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。因此，如何在保持良好生物相容性的同時(shí)提高UCNPs的熒光強(qiáng)度對(duì)其在光遺傳體系的廣泛應(yīng)用具有深刻意義。本文將著重介紹UCNPs的各項(xiàng)參數(shù)如激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、發(fā)光壽命與光遺傳實(shí)驗(yàn)的匹配性問題以及增強(qiáng)UCNPs的轉(zhuǎn)換效率的方法，主要包括優(yōu)化UCNPs結(jié)構(gòu)和修飾有機(jī)染料兩種方法，總結(jié)和討論了UCNPs介導(dǎo)的光遺傳工作，并對(duì)構(gòu)建同步進(jìn)行調(diào)控和檢測(cè)活體大腦電活動(dòng)的低損傷、雙向神經(jīng)界面進(jìn)行了展望。

2 UCNPs參數(shù)與光遺傳實(shí)驗(yàn)的匹配

利用UCNPs作為激活光源進(jìn)行光遺傳實(shí)驗(yàn)，需要考慮所選用的UCNPs的激發(fā)光在組織中的穿透能力與吸收性、UCNPs的發(fā)射光與光敏蛋白吸收峰的重合度以及UCNPs的發(fā)光壽命與光敏蛋白的響應(yīng)時(shí)間之間的匹配性問題。

2.1 UCNPs的激發(fā)光

不同波長(zhǎng)的激發(fā)光在組織中穿透能力以及組織中的水對(duì)其吸收能力均不相同。在近紅外光波段范圍內(nèi)，通常波長(zhǎng)越長(zhǎng)，其在組織中的穿透能力越強(qiáng)，但同時(shí)組織中的水對(duì)其吸收能力也越強(qiáng)，兩種情況在極端情況下都容易導(dǎo)致組織過熱，因此在選擇激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)需要折中考慮。通過在UCNPs的結(jié)構(gòu)中引入不同稀土元素作為敏化劑可以調(diào)節(jié)其激發(fā)波長(zhǎng)。例如Yb3+離子的吸收中心為980 nm，以該離子為敏化劑的UCNPs可被980 nm激發(fā)光激活，進(jìn)行上轉(zhuǎn)換過程27。然而，組織中的水對(duì)該波長(zhǎng)的吸收性相對(duì)較強(qiáng)。以Nd3+離子作為敏化劑的UCNPs可在800 nm激發(fā)光的照射下進(jìn)行上轉(zhuǎn)換過程28,29。雖然800 nm激發(fā)光在組織中的穿透能力比980 nm弱，但是它在組織中的水吸收系數(shù)比980 nm要小幾十倍23,28,30。因此，在活體光遺傳實(shí)驗(yàn)中選擇敏化劑離子的時(shí)候，需要綜合考慮其激發(fā)波長(zhǎng)在組織中的穿透能力和吸收性。并且UCNPs通過選擇不同敏化劑離子調(diào)節(jié)激發(fā)光波長(zhǎng)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程，不會(huì)限制其發(fā)射光的設(shè)計(jì)，該特性為光遺傳實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)帶來了便利。

2.2 UCNPs的發(fā)射光

由于光敏蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)不盡相同，調(diào)控UCNPs的發(fā)射光譜，使之與光敏蛋白的激發(fā)光譜相匹配，對(duì)高效地進(jìn)行光遺傳實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。UCNPs的發(fā)射光譜主要依賴于激活劑所用稀土元素的特征發(fā)射峰31。例如Tm3+離子具有475 nm的發(fā)射峰，可用于激活吸收峰為藍(lán)光的光敏蛋白。而Er3+離子的最強(qiáng)發(fā)射峰為543 nm27,32，Ho3+離子的發(fā)射峰為541 nm33，可以激活對(duì)綠光甚至黃光敏感的光敏蛋白。除此之外，Er3+離子還有651 nm的發(fā)射峰27,32，可用于激活對(duì)紅光敏感的光敏蛋白。因此，Tm3+、Er3+和Ho3+的發(fā)射峰波段范圍可以匹配許多光敏蛋白的激發(fā)光譜。盡管Er3+和Ho3+的發(fā)射峰接近黃光，但是用它們激活以黃光為激發(fā)光的光敏蛋白效率較低，而近期報(bào)道以Eu3+離子作為激活劑的UCNPs具有590和616 nm發(fā)射峰34,35，能高效地激活以黃光為激發(fā)光的光敏蛋白。如果UCNPs的發(fā)射光譜與光敏蛋白的吸收光譜匹配度較低，激活光敏蛋白所需的激光能量就要更高，甚至無法激活光敏蛋白。因此在活體光遺傳實(shí)驗(yàn)中選擇激活劑離子的時(shí)候，需要考慮該激活劑離子的發(fā)射光譜與所選光敏蛋白的激發(fā)光譜之間的匹配度，以實(shí)現(xiàn)高效地調(diào)控神經(jīng)電活動(dòng)。

2.3 UCNPs的發(fā)光壽命

最后，不同光敏蛋白對(duì)激發(fā)光的響應(yīng)時(shí)間不同，在時(shí)間精度上能達(dá)到毫秒級(jí)1-4。而稀土離子的發(fā)光響應(yīng)也具有一定壽命，即從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)所用平均時(shí)間31，其本征衰減曲線從微秒級(jí)到毫秒級(jí)不等。如果稀土離子的發(fā)光壽命超出光敏蛋白的響應(yīng)時(shí)間過多，則會(huì)導(dǎo)致激發(fā)調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)能跟隨的激發(fā)光脈沖頻率降低。反之，如果UCNPs的發(fā)光壽命遠(yuǎn)小于光敏蛋白的響應(yīng)時(shí)間，則會(huì)導(dǎo)致光敏蛋白難以激活。因此在UCNPs介導(dǎo)光遺傳實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過程中，稀土離子的發(fā)光壽命和光敏蛋白的響應(yīng)時(shí)間相匹配也是一個(gè)需要考慮的因素。在材料合成過程中，通?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)摻雜劑濃度36-38、UCNPs尺寸39,40和結(jié)構(gòu)中能量傳遞過程41,42來調(diào)節(jié)UCNPs的發(fā)光壽命，使之與相應(yīng)的光敏蛋白匹配。

3 增強(qiáng)UCNPs轉(zhuǎn)換效率的方法

如前所述，在光遺傳實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)UCNPs的轉(zhuǎn)換效率能有效降低激發(fā)光能量，從而降低組織熱損傷。其中增強(qiáng)UCNPs轉(zhuǎn)換效率主要可以通過設(shè)計(jì)殼結(jié)構(gòu)保護(hù)納米顆粒表面和修飾有機(jī)染料提升納米顆粒光吸收能力兩種方式實(shí)現(xiàn)。如果能夠結(jié)合兩種方式的優(yōu)點(diǎn)，則能達(dá)到更好的增強(qiáng)效果。

3.1 通過設(shè)計(jì)核殼結(jié)構(gòu)增強(qiáng)UCNPs轉(zhuǎn)換效率

UCNPs的表面態(tài)對(duì)其轉(zhuǎn)換效率影響很大，由于UCNPs的比表面積較大，其表面有較多的雜質(zhì)、配體和溶劑分子，從而導(dǎo)致多光子弛豫效應(yīng)，使UCNPs表面摻雜離子猝滅而減少發(fā)光中心發(fā)光離子的數(shù)量，從而造成能量損失。除此之外，UCNPs內(nèi)部的摻雜離子會(huì)通過能量轉(zhuǎn)移過程將激發(fā)能量傳遞給表面猝滅位點(diǎn)，產(chǎn)生非輻射弛豫，降低轉(zhuǎn)換效率。因此，抑制表面猝滅能有效地提高UCNPs的轉(zhuǎn)換效率。目前，利用基質(zhì)材料作鈍化殼是一種常用的抑制表面猝滅的手段。如2007年Yi等43報(bào)導(dǎo)了一種核-鈍化殼結(jié)構(gòu)的UCNPs，他們?cè)贜aYF4:Yb核的表面包裹一層NaYF4作為鈍化殼。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與未包裹鈍化殼的UCNPs相比，這種核-鈍化殼結(jié)構(gòu)的UCNPs的轉(zhuǎn)換效率提高了30倍。通過相似的原理，Mai等44在2007年、Ansari等45在2016年對(duì)NaYF4:Yb/Er UCNPs做了鈍化殼處理，都成功地增強(qiáng)了UCNP的轉(zhuǎn)換效率。2008年Sch?fer等46報(bào)導(dǎo)的KYF4:Yb/Er UCNPs經(jīng)過鈍化殼處理后，轉(zhuǎn)換效率顯著提升(圖1a，b)。

除此之外，在鈍化殼中摻入合適濃度的敏化劑或者敏化劑和激活劑得到的活性殼不僅能抑制UCNPs的表面猝滅效應(yīng)，而且還能增強(qiáng)UCNPs對(duì)NIR能量的吸收和傳遞能力，從而進(jìn)一步增大UCNPs的轉(zhuǎn)換效率。2009年，Vetrone等47把NaGdF4:Yb活性殼包裹到NaGdF4:Yb/Er表面，相比于之前提及的用鈍化殼包裹UCNPs抑制表面猝滅提高轉(zhuǎn)換效率的方法，這種方法得到的綠色熒光和紅色熒光分別增強(qiáng)了3倍和10倍(圖1c，d)，這是由于加入的Yb3+離子能夠存儲(chǔ)激活能，隨后又能高效地將能量傳遞給核中的激活劑。還有許多諸如此類應(yīng)用殼結(jié)構(gòu)抑制表面猝滅的研究工作都成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)UCNPs轉(zhuǎn)換效率的顯著提升48-54。

圖1 各種增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換效率方法的熒光強(qiáng)度和發(fā)射譜對(duì)比Fig.1 Enhanced upconversion efficiency of different kinds of core-shell UCNPs.

3.2 通過修飾有機(jī)染料增強(qiáng)UCNPs轉(zhuǎn)換效率

雖然通過殼的保護(hù)以及敏化劑和激活劑的摻入可以在很大程度上提升UCNPs的轉(zhuǎn)換效率，但UCNPs中的鑭系離子光吸收截面小和激發(fā)峰窄的本質(zhì)特性導(dǎo)致許多激發(fā)光沒有被捕獲，這限制了熒光亮度的進(jìn)一步增強(qiáng)。有機(jī)染料的光吸收截面比鑭系離子大3到4個(gè)數(shù)量級(jí)，研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)UCNPs修飾有機(jī)染料之后能有效提高UCNPs捕獲外界激發(fā)光子的能力，從而進(jìn)一步提高UCNPs的轉(zhuǎn)換效率。2012年，Zou等55首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)UCNPs修飾有機(jī)染料，他們的實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)染料修飾后的UCNPs在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)都具有吸收能力，并且相比于未經(jīng)染料修飾的UCNPs，轉(zhuǎn)換效率增強(qiáng)了～3300倍。隨后研究人員對(duì)UCNPs修飾不同的熒光基團(tuán)，提高UCNPs轉(zhuǎn)換效率，如2015年，Wu等56對(duì)UCNPs分別修飾了商業(yè)有機(jī)染料IR-783和IR-820以及他們團(tuán)隊(duì)自己合成的IR-808和IR-845有機(jī)染料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，修飾了IR-808染料的UCNPs在在相應(yīng)激發(fā)光照射下，其熒光亮度比沒有修飾有機(jī)染料的UCNPs提高了200倍，而修飾了IR-845、IR-783、IR-820染料的UCNPs相比于沒有修飾染料的UCNPs，熒光亮度分別提高了100倍、80倍和70倍。按照相同方法，2017年Lee等57也實(shí)現(xiàn)了修飾有機(jī)染料增強(qiáng)UCNPs的上轉(zhuǎn)換效率。

3.3 結(jié)合兩種方法增強(qiáng)UCNPs轉(zhuǎn)換效率

如前所述，在UCNPs的設(shè)計(jì)過程中，如果能夠?qū)⒃O(shè)計(jì)殼層結(jié)構(gòu)保護(hù)納米顆粒表面和修飾有機(jī)染料提升納米顆粒光吸收能力兩種方式結(jié)合到一起，有望達(dá)到更好的增強(qiáng)轉(zhuǎn)換效率的效果。修飾了有機(jī)染料的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs結(jié)合了核殼結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)和染料分子優(yōu)良的光捕獲能力，極大程度地提高了UCNPs的轉(zhuǎn)換效率。其主要的增強(qiáng)原理是在經(jīng)過有機(jī)染料修飾過的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs體系中，有機(jī)染料可以高效地吸收紅外光，將這些能量傳遞給殼中的敏化劑，隨后這些敏化劑會(huì)將這些能量輸送到核內(nèi)的敏化劑，最后這些能量被核內(nèi)敏化劑附近的激活劑捕獲進(jìn)行上轉(zhuǎn)換。2015年，Chen等58報(bào)導(dǎo)的染料修飾的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs，通過這種多級(jí)能量傳遞方式，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)換效率～100倍的提升(圖1e，f)。修飾了有機(jī)染料的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs的上轉(zhuǎn)換效率遠(yuǎn)大于普通UCNPs，這給UCNPs在光遺傳領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了契機(jī)。2016年Wu等59發(fā)現(xiàn)經(jīng)IR-806修飾過的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs的轉(zhuǎn)換效率很高，僅需1.5 W·mm-2的NIR (800 nm)就能激活表達(dá)了ReaChR光敏蛋白的海馬神經(jīng)元。但是此實(shí)驗(yàn)只在細(xì)胞層面驗(yàn)證了UCNPs在光遺傳領(lǐng)域的應(yīng)用，在活體中的近紅外光調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步開展。

4 UCNPs在光遺傳領(lǐng)域的應(yīng)用實(shí)例

相比于可見光，組織對(duì)NIR的吸收和散射要弱很多，因此NIR在組織中的穿透性優(yōu)于可見光。UCNPs可以將組織穿透性好的NIR轉(zhuǎn)換成可激活光敏蛋白的可見光，因此將UCNPs應(yīng)用到光遺傳實(shí)驗(yàn)中，可以實(shí)現(xiàn)顱外激光照射調(diào)控深腦神經(jīng)元活動(dòng)。對(duì)此，研究人員開展了一系列工作，拓展了光遺傳在腦科學(xué)中的應(yīng)用。

4.1 UCNPs的體外光遺傳應(yīng)用

2015年，Hososhima等60首次將UCNPs應(yīng)用到光遺傳實(shí)驗(yàn)，他們?cè)诤蠻CNPs的聚合物薄膜上培養(yǎng)表達(dá)了C1V1光敏蛋白的細(xì)胞，當(dāng)用NIR (980 nm)照射培養(yǎng)細(xì)胞的薄膜基底時(shí)，薄膜中的UCNPs發(fā)出綠色熒光并激活培養(yǎng)在薄膜上的細(xì)胞，使其產(chǎn)生動(dòng)作電位。該工作首次實(shí)現(xiàn)了將UCNPs與光遺傳實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過用生物相容性好的聚合物薄膜包裹UCNPs的方法巧妙地避免了納米粒子與細(xì)胞直接接觸導(dǎo)致的細(xì)胞毒害作用。然而相比與前面介紹到的2016年Wu等59的染料敏化核殼結(jié)構(gòu)的UCNPs-僅需1.5 W·mm-2的NIR (800 nm)激活光敏蛋白，該工作中所用的激光功率高達(dá)58 W·mm-2，如此高功率的NIR照射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞溫度升高，不僅會(huì)影響細(xì)胞活性，而且會(huì)激活細(xì)胞膜上自然存在的熱敏蛋白，影響試驗(yàn)結(jié)果。為了提高轉(zhuǎn)換效率，2015年Shah等61合成了核殼結(jié)構(gòu)UCNPs，他們將核殼結(jié)構(gòu)的UCNPs與PLGA混合形成基底，研究轉(zhuǎn)染了ChR2的神經(jīng)細(xì)胞是否能被NIR激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種核殼結(jié)構(gòu)的UCNPs在8 W·mm-2的NIR (980 nm)照射下發(fā)出的藍(lán)色熒光足夠激活ChR2光敏蛋白，并且能在10 Hz脈沖NIR照射條件下穩(wěn)定獲得重復(fù)出現(xiàn)的動(dòng)作電位(圖2)。雖然這些工作證明了UCNPs發(fā)出的熒光能夠激活表達(dá)了光敏蛋白的細(xì)胞，但是由于體外培養(yǎng)環(huán)境與活體環(huán)境的差異巨大，UCNPs介導(dǎo)的活體光遺傳還要解決很多難題，例如：1)將包含UCNPs的聚合物薄膜植入組織時(shí)，植入的體積太大會(huì)給組織帶來很大損傷，植入體積太小熒光強(qiáng)度不足以激活光敏蛋白；2)活體實(shí)驗(yàn)中NIR需要穿透皮膚、顱骨、腦組織等等，這些都會(huì)導(dǎo)致NIR的光強(qiáng)變?nèi)?，因此增大激發(fā)光能量不可避免，而這可能會(huì)導(dǎo)致溫度升高，對(duì)組織造成傷害。

4.2 UCNPs的活體光遺傳應(yīng)用

2016年Bansal等62首次將UCNPs用于活體光遺傳實(shí)驗(yàn)。該工作首先對(duì)轉(zhuǎn)染了ChR2的線蟲做饑餓處理，隨后將饑餓的線蟲暴露到他們合成的UCNPs (Si外殼，發(fā)射藍(lán)色熒光)溶液中使線蟲攝取UCNPs，最后通過施加準(zhǔn)連續(xù)NIR (980 nm)光照射線蟲，成功調(diào)控了線蟲的運(yùn)動(dòng)方向(圖3)，并且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的組織過熱和納米粒子毒性的副作用。除此之外，2017年Ai等63在幼年斑馬魚模型中，也通過用NIR (808 nm)照射UCNPs發(fā)射藍(lán)色熒光，成功激活ChR2光敏蛋白。值得注意的是，線蟲和幼年斑馬魚的身體透明度相對(duì)較高，對(duì)光的透過性好，因此對(duì)于UCNPs在組織穿透性較差的嚙齒類動(dòng)物中的光遺傳應(yīng)用還有待進(jìn)一步探索。

圖2 用包裹UCNPs的聚合物薄膜實(shí)現(xiàn)光遺傳激活神經(jīng)元的示意圖61Fig.2 Schematic diagram depicting the generation and application of polymer-UCNP hybrid scaffolds for optogenetic neuronal activation 61.

圖3 UCNPs介導(dǎo)的NIR光遺傳調(diào)控線蟲運(yùn)動(dòng)行為62Fig.3 Modulation of movement behavior in C.elegans by UCNP-mediated NIR optogenetics 62.

2017年Lin等64首次將UCNPs應(yīng)用到嚙齒動(dòng)物光遺傳實(shí)驗(yàn)(圖4a，b，c)。他們通過摻雜Tm3+離子或Er3+離子，得到了發(fā)射熒光波長(zhǎng)與ChR2和C1V1光敏蛋白相匹配的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs。他們將分散有此UCNPs的溶液加入微玻璃管，待溶劑揮發(fā)后剪斷微玻璃管并密封好，隨后將鎢絲電極與此光學(xué)器件綁到一起，最后將此器件植入大鼠腦組織，通過顱外施加980 nm 的NIR，在功率為7 mW·mm-2和4.4 mW·mm-2時(shí)，分別成功激活了發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm和540 nm的UCNPs，并相應(yīng)激活了V1M腦區(qū)(1 mm深)的ChR2和C1V1光敏蛋白，記錄到了相應(yīng)的動(dòng)作電位，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控和神經(jīng)信號(hào)的檢測(cè)。但是值得注意的是，此實(shí)驗(yàn)是在老鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行的；所選腦區(qū)距離腦表僅1 mm，經(jīng)過選用合適的光敏蛋白，通過顱外照射可見光即能對(duì)該深度的神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控；且微玻璃管包裹雖然能夠使UCNPs與細(xì)胞隔離，降低對(duì)細(xì)胞的毒性，但玻璃管和所用鎢絲電極都是剛性的，會(huì)對(duì)組織造成一定程度的損傷以及炎癥反應(yīng)，因此生物相容性有待進(jìn)一步提高。同年，Wang等65利用相同方法制備了負(fù)載有UCNPs的光學(xué)器件，通過埋植該器件實(shí)現(xiàn)了顱外施加NIR (980 nm，5 mW·mm-2)調(diào)控自由活動(dòng)老鼠VTA腦區(qū)(4.5 mm深)、皮層紋狀體腦區(qū)(3 mm深)和視覺皮層腦區(qū)(1 mm深)的神經(jīng)活動(dòng)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)負(fù)載UCNPs的光學(xué)器件植入組織后沒有引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，并且NIR照射時(shí)皮膚的溫度沒有顯著升高。這說明該方法可以用于自由活動(dòng)老鼠深腦光遺傳實(shí)驗(yàn)。通常來說，相比于激活興奮性光敏蛋白，激活抑制性光敏蛋白需要更高能量的熒光照射，這就要求UCNPs具有更高的轉(zhuǎn)換效率66。2018年，Lin等67通過核殼殼結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增強(qiáng)了UCNPs的轉(zhuǎn)換效率，與之前所用核殼結(jié)構(gòu)UCNPs相比，轉(zhuǎn)換效率提升了～3倍。利用相同方法，他們實(shí)現(xiàn)了將UCNPs用于神經(jīng)活動(dòng)抑制的實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)成功地檢測(cè)到了神經(jīng)元的動(dòng)作電位(圖4d，e，f，g)。他們通過體外NIR (980 nm，6 mW·mm-2)照射自由活動(dòng)老鼠，成功激活了大鼠STN腦區(qū)(7.8 mm深)和小鼠次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(0.5 mm深)中神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的抑制性光敏蛋白-eNpHR3.0，記錄到了大鼠相應(yīng)腦區(qū)中的電生理信號(hào)，并且實(shí)現(xiàn)了調(diào)控自由移動(dòng)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

圖4 植入負(fù)載UCNPs的微玻璃管實(shí)現(xiàn)NIR光遺傳調(diào)控老鼠神經(jīng)活動(dòng)Fig.4 NIR neuromodulation in mice/rats by micro-optrodes containing UCNPs.

為了減小剛性器件與柔性組織力學(xué)性能不匹配帶來的損傷，構(gòu)建更穩(wěn)定的神經(jīng)調(diào)控界面，2018年Chen等68直接注射含有UCNPs的溶液到腦組織，實(shí)現(xiàn)了顱外照射NIR (980 nm，96W·mm-2)激活光敏蛋白，調(diào)控小鼠VTA腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)(圖5a，b，c)。他們所用UCNPs為SiO2包裹的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs。SiO2的包裹解決了UCNPs對(duì)細(xì)胞的毒害作用，因此在細(xì)胞毒性表征實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒害作用。并且由于沒有引入大尺寸剛性材料，實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，這體現(xiàn)了該方法良好的生物相容性。此研究還發(fā)現(xiàn)，SiO2包裹的UCNPs注射到體內(nèi)一個(gè)月后還能穩(wěn)定停留在注射位點(diǎn)附近，沒有發(fā)現(xiàn)很明顯的擴(kuò)散，這證明該方法可以實(shí)現(xiàn)在一定時(shí)間期限內(nèi)穩(wěn)定調(diào)控動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)(圖5d)。相比于前述用高光敏性光敏蛋白進(jìn)性顱外可見光照射調(diào)控小鼠活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)而言，該工作中UCNPs是定點(diǎn)注射的，其發(fā)射光只會(huì)調(diào)控注射位點(diǎn)附近神經(jīng)元的活動(dòng)性，因此這種給光方式的空間精度更高；相比于用微玻璃管負(fù)載UCNPs植入腦區(qū)的工作，這種注射UCNPs的方法無需將剛性器件植入腦組織，因此對(duì)組織造成的損傷更小，具有更良好的生物相容性。之后，2019年Miyazaki等21將一種已實(shí)現(xiàn)商品化的微米尺寸上轉(zhuǎn)換顆粒注射到腦組織之后，通過顱外施加NIR(976 nm)照射成功激活了小鼠mPFC和dSTR腦區(qū)中表達(dá)了C1V1光敏蛋白的神經(jīng)元，并且調(diào)控了自由移動(dòng)小鼠的運(yùn)動(dòng)行為(圖6)。為了研究此方法的穩(wěn)定性，Miyazaki等將這種上轉(zhuǎn)換顆粒注射到腦組織，兩個(gè)月后通過MRI實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射的上轉(zhuǎn)換顆粒沒有發(fā)生明顯的擴(kuò)散。這可能是因?yàn)檫@種上轉(zhuǎn)換顆粒是微米尺寸的，相比于納米尺寸顆粒，其擴(kuò)散性要小許多。因此，通過合理優(yōu)化上轉(zhuǎn)換材料的結(jié)構(gòu)、組成、尺寸以及使用方法等參數(shù)，基于上轉(zhuǎn)換材料的光遺傳技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定地利用NIR調(diào)控動(dòng)物深部腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)。

圖5 注射含有UCNPs的溶液實(shí)現(xiàn)NIR光遺傳調(diào)控小鼠神經(jīng)活動(dòng)68Fig.5 NIR neuromodulation in mice by injecting solution containing UCNPs 68.

圖6 注射含有上轉(zhuǎn)換微粒的溶液實(shí)現(xiàn)NIR光遺傳調(diào)控小鼠神經(jīng)活動(dòng)21Fig.6 NIR neuromodulation in mice by injecting solution containing lanthanide micro-particles (LMPs)21.

5 總結(jié)與展望

UCNPs可以將組織穿透性好的NIR轉(zhuǎn)換成與光敏蛋白匹配的可見光，將UCNPs與光遺傳技術(shù)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)顱外照射NIR激活深腦中表達(dá)了光敏蛋白的神經(jīng)元，對(duì)自由移動(dòng)動(dòng)物的行為進(jìn)行調(diào)控。相比于傳統(tǒng)光遺傳技術(shù)，基于UCNPs的光遺傳技術(shù)不需要在動(dòng)物組織中植入光纖或微型LED等光學(xué)設(shè)備，因此，UCNPs介導(dǎo)的光遺傳實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物組織的損傷更小。同時(shí)由于不需要用連接連接線埋植在動(dòng)物腦中的光學(xué)設(shè)備和外部光源設(shè)備，因此在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的活動(dòng)更能反映動(dòng)物的真實(shí)狀態(tài)，提高動(dòng)物行為學(xué)的可靠性，這些對(duì)研究人員了解神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)與功能非常有益。因此用UCNPs介導(dǎo)的NIR光遺傳技術(shù)備受研究人員青睞，近年來發(fā)展迅速。盡管如此，轉(zhuǎn)換效率低、組織發(fā)熱、納米粒子對(duì)細(xì)胞的毒害作用、納米粒子在組織內(nèi)的穩(wěn)定性差等問題限制了該體系的廣泛應(yīng)用。通過設(shè)計(jì)殼結(jié)構(gòu)避免表面猝滅效應(yīng)，修飾有機(jī)染料提高光吸收能力等手段可以提高UCNPs轉(zhuǎn)換效率。轉(zhuǎn)換效率的提高能降低所需激發(fā)光的能量，因此同時(shí)也能減輕組織發(fā)熱的問題。通過對(duì)UCNPs表面修飾生物兼容材料或者將UCNPs包裹到柔性生物兼容聚合物中，能夠避免UCNPs與細(xì)胞直接接觸，從而解決UCNPs對(duì)細(xì)胞的毒害問題。與此同時(shí)，UCNPs被聚合物包裹后植入組織，其空間位置將被嚴(yán)格限制，不再擴(kuò)散，因此可以長(zhǎng)期穩(wěn)定發(fā)揮作用。

高時(shí)空精度地調(diào)控和檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)對(duì)了解神經(jīng)元之間如何交流以及行為功能如何發(fā)生是非常重要的69-73。但是目前將UCNPs介導(dǎo)的小損傷光遺傳技術(shù)與神經(jīng)電極技術(shù)，尤其是柔性神經(jīng)電極技術(shù)結(jié)合的研究工作較少；2015年Liu等74研發(fā)了一種可注射網(wǎng)狀柔性神經(jīng)電極，相比于金屬絲電極或者硅電極，這種柔性電極與大腦力學(xué)性能更匹配，能構(gòu)建更穩(wěn)定的神經(jīng)界面，有利于長(zhǎng)期檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)。2019年Guan等75研發(fā)了一種操作簡(jiǎn)便的自組裝柔性神經(jīng)流蘇電極，這種電極在聚乙二醇(PEG)聚合物的熔融液中自組裝后固化得到直徑為幾十微米的針狀電極，即能順利植入腦組織，隨后PEG降解，神經(jīng)電極恢復(fù)柔性。這種柔性神經(jīng)電極可以與大腦構(gòu)建優(yōu)良的神經(jīng)界面，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚L(zhǎng)期穩(wěn)定地檢測(cè)。將這種柔性電極與UCNPs介導(dǎo)的光遺傳結(jié)合，有望構(gòu)建穩(wěn)定的雙向神經(jīng)界面，實(shí)現(xiàn)小損傷長(zhǎng)期檢測(cè)與調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)，這對(duì)腦科學(xué)基礎(chǔ)研究和神經(jīng)疾病治療等具有重要的應(yīng)用價(jià)值。