許可 ，王晉芬

1中國(guó)科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190

2中國(guó)科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190

3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

神經(jīng)界面是神經(jīng)系統(tǒng)與神經(jīng)電子器件進(jìn)行信息交互的接口，構(gòu)筑穩(wěn)定可靠的神經(jīng)-電極界面，不僅對(duì)神經(jīng)環(huán)路的研究大有裨益，而且對(duì)腦機(jī)接口技術(shù)的發(fā)展1、神經(jīng)假體的臨床應(yīng)用2具有重要意義。理想的神經(jīng)界面要求神經(jīng)電極的生物相容性好，能與神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)縫集成3,4，尺寸盡量小以減少腦損傷5,6，記錄位點(diǎn)盡量多以檢測(cè)到更多的神經(jīng)元活動(dòng)5,7，具有足夠的電荷注入能力以實(shí)現(xiàn)電刺激8，信號(hào)記錄的時(shí)空分辨率、信噪比高9,10，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地工作11。

傳統(tǒng)的神經(jīng)電極以剛性材料為主，如金屬微絲電極12、密歇根電極13和尤他電極14等，其力學(xué)性能與柔軟的腦組織不匹配，植入后易發(fā)生微移動(dòng)，導(dǎo)致神經(jīng)界面附近的神經(jīng)元衰退、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，引發(fā)炎癥反應(yīng)，形成膠質(zhì)瘢痕，影響電極的長(zhǎng)期記錄性能15,16。金屬材質(zhì)的記錄位點(diǎn)在體液環(huán)境中易發(fā)生腐蝕，而且微米及毫米尺寸的神經(jīng)電極空間分辨率低，難以完成亞細(xì)胞水平的神經(jīng)活動(dòng)檢測(cè)17,18。此外，隨著電極尺寸的減小，探針的界面阻抗增大，熱噪聲隨之增大，神經(jīng)電極的信噪比降低，嚴(yán)重影響神經(jīng)電極的信號(hào)質(zhì)量6。上述問(wèn)題嚴(yán)重制約著神經(jīng)電極的發(fā)展和應(yīng)用，因此亟需構(gòu)筑新型的神經(jīng)界面，解決現(xiàn)有神經(jīng)電極存在的問(wèn)題。

采用納米材料為基本組件構(gòu)筑神經(jīng)電極，為現(xiàn)有神經(jīng)檢測(cè)技術(shù)的不足，提供了有力的解決方案。不同于塊體材料，納米材料比表面積大，具有小尺寸效應(yīng)以及優(yōu)異的電學(xué)、機(jī)械和光學(xué)性能等。已有研究表明納米材料生物相容性好，可與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生相互作用，促進(jìn)神經(jīng)元粘附、引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)19-22。利用納米材料構(gòu)筑神經(jīng)電極可以減小電極的尺寸23、降低機(jī)體的免疫反應(yīng)24、提高電極界面的離子電子轉(zhuǎn)換效率24，實(shí)現(xiàn)大范圍、高時(shí)空分辨和長(zhǎng)期的神經(jīng)電活動(dòng)調(diào)控和記錄25。另外，納米材料與生物體內(nèi)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的尺寸相匹配，且能夠通過(guò)多種合成或加工方法調(diào)控自身的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，因此成為構(gòu)筑神經(jīng)界面的理想材料。

本文主要以一維納米材料中的碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)和硅納米線(Si nanowires，SiNWs)、二維納米材料中的石墨烯(graphene，GR)為例，概述了基于這三種材料構(gòu)筑神經(jīng)電極的研究進(jìn)展，以及它們?cè)谏窠?jīng)界面發(fā)揮的作用，最后總結(jié)目前神經(jīng)界面研究取得的突破與存在的挑戰(zhàn)，并展望其未來(lái)的發(fā)展方向。

2 碳納米管構(gòu)筑神經(jīng)界面

碳納米管是由石墨片卷曲而成的空心圓管狀一維納米材料，按照石墨片的層數(shù)可分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)與多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)。單壁碳納米管的直徑為0.4-2.5 nm，最長(zhǎng)長(zhǎng)度可至毫米級(jí)；多壁碳納米管的直徑為2-100 nm，常見長(zhǎng)度為微米級(jí)26。碳納米管的合成方法主要有化學(xué)氣相沉積法、電弧放電法及激光燒蝕法等。碳納米管的化學(xué)性能穩(wěn)定，抗拉強(qiáng)度高，可通過(guò)改變手性、管徑、層數(shù)等因素調(diào)控導(dǎo)電性能，可通過(guò)表面修飾多肽、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等生物活性分子提高生物相容性，這些特性為碳納米管構(gòu)筑神經(jīng)界面提供了可能。

2.1 碳納米管對(duì)神經(jīng)界面的調(diào)控

為了考察碳納米管與神經(jīng)細(xì)胞的相互作用，研究人員直接在碳納米管基底上體外培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的粘附與增殖情況。Mattson等27首次在鋪有多壁碳納米管的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)蓋玻片上體外培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明神經(jīng)細(xì)胞能夠粘附在碳納米管上并形成突起。此外，通過(guò)物理吸附作用在碳納米管表面引入生物活性分子4-羥基壬烯酸，在修飾后碳納米管基底上培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的突起及分支數(shù)量均增加，突起長(zhǎng)度變?yōu)樵瓉?lái)的2倍。Malarkey等28在不同厚度的化學(xué)修飾碳納米管薄膜上培養(yǎng)新生大鼠的海馬神經(jīng)元，并用鈣黃綠素(calcein)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記以便于形態(tài)觀察(如圖1a所示)。碳管薄膜越厚，其電導(dǎo)率越高。以胞體大小、突起長(zhǎng)度及數(shù)量等為衡量條件，研究人員發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元在10 nm厚碳管薄膜上的生長(zhǎng)情況最好，而具有更高電導(dǎo)率的30及60 nm厚碳管薄膜對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的促進(jìn)作用與PEI差不多，但電導(dǎo)率與神經(jīng)元生長(zhǎng)之間的內(nèi)在聯(lián)系未被完全揭示，僅推測(cè)可能與細(xì)胞膜上離子傳輸過(guò)程有關(guān)。Krukiewicz等29提出了一種自支撐碳納米管薄膜，薄膜平均厚度為10 μm，電荷存儲(chǔ)容量、電荷注入能力等電學(xué)性能比鉑電極更優(yōu)異，經(jīng)過(guò)相同的培養(yǎng)時(shí)間，在碳納米管薄膜上生長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞突起長(zhǎng)度比鉑箔上更長(zhǎng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞所占面積更小。其他研究30,31也為碳納米管能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)與分化提供了佐證。然而，Visalli等32發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SHSY5Y)與碳納米管接觸后胞內(nèi)活性氧含量增加、DNA受損，引發(fā)免疫反應(yīng)。Bussy等33發(fā)現(xiàn)碳納米管對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用不同，他們分別從胎鼠的額葉皮層和紋狀體分離得到神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，碳納米管對(duì)兩處腦區(qū)的神經(jīng)元無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用，但會(huì)使紋狀體的膠質(zhì)細(xì)胞活力降低，而額葉皮層的膠質(zhì)細(xì)胞不受影響。進(jìn)一步分析證實(shí)與額葉皮層相比，紋狀體的膠質(zhì)細(xì)胞中含有更多的小膠質(zhì)細(xì)胞，而小膠質(zhì)細(xì)胞攝取碳納米管的能力比星形膠質(zhì)細(xì)胞更強(qiáng)，因而紋狀體膠質(zhì)細(xì)胞受碳納米管的影響更大。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了碳納米管與神經(jīng)細(xì)胞相互作用的兩面性，需要注意的是，不同研究使用的碳納米管的尺寸及性質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞的種類及培養(yǎng)方法等不完全相同。

圖1 碳納米管調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)Fig.1 Carbon nanotubes modulate neuronal growth.

為了更加真實(shí)地還原神經(jīng)細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，Bosi等34設(shè)計(jì)制備了一種內(nèi)含多壁碳納米管的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)細(xì)胞支架，與二維平面基底相比，三維支架有助于神經(jīng)元胞體遷移、實(shí)現(xiàn)三維任意方向的生長(zhǎng)，從而形成大面積的神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)(如圖1b，c所示)。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)碳納米管的存在增強(qiáng)了突觸活動(dòng)。關(guān)于碳納米管為何能夠促進(jìn)神經(jīng)元電活動(dòng)，Cellot等35認(rèn)為碳納米管與細(xì)胞膜緊密接觸，成為神經(jīng)元在近端與遠(yuǎn)端之間傳輸電信號(hào)的“捷徑”。他們采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單個(gè)神經(jīng)元的興奮性活動(dòng)，在給予特定的電流脈沖后，碳納米管基底上培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元胞體細(xì)胞膜的去極化后電位比對(duì)照組的更大，間接證實(shí)了神經(jīng)元樹突處鈣離子介導(dǎo)的反向傳播動(dòng)作電位的存在，因此推測(cè)碳納米管能夠增強(qiáng)神經(jīng)元胞體與樹突的耦合作用。

上述研究證實(shí)碳納米管及生物分子修飾的碳納米管，可在體外調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，并能增強(qiáng)神經(jīng)-電極界面的電活性，因此碳納米管可用于神經(jīng)電極的基底導(dǎo)電層和修飾層材料。

圖2 碳納米管作電極導(dǎo)電層或修飾層Fig.2 Carbon nanotubes as conducting layers or coating layers of neural electrodes.

2.2 碳納米管用于神經(jīng)電極的導(dǎo)電層材料

利用碳納米管優(yōu)異的電學(xué)性能和小尺寸效應(yīng)，可構(gòu)筑尺寸小和空間分辨率高的神經(jīng)電極，用于胞內(nèi)和胞外神經(jīng)電信號(hào)的穩(wěn)定記錄。Yoon等36通過(guò)介電電泳制備出一種多壁碳納米管電極，長(zhǎng)約1.5 mm，自纏繞的碳管在鎢絲一端生長(zhǎng)，在1-100 kHz頻率范圍內(nèi)，電極阻抗值比玻璃微電極低一個(gè)數(shù)量級(jí)。毫米級(jí)長(zhǎng)度有利于碳管電極刺入細(xì)胞，可在皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)記錄到電刺激與光刺激響應(yīng)下的信號(hào)；微米級(jí)尖端有助于提高空間分辨率，將碳管電極植入小鼠軀體感覺皮層進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞外信號(hào)記錄，單個(gè)神經(jīng)元放電活動(dòng)可被有效分離(如圖2a，b所示)。Su等37利用化學(xué)氣相沉積法在錐形硅尖端生長(zhǎng)碳納米管，制得三維碳納米管神經(jīng)電極。通過(guò)對(duì)電極表面進(jìn)行氧等離子體處理清除無(wú)定形碳，增強(qiáng)了碳納米管的親水性，單位面積的阻抗顯著降低。與平面電極相比，三維碳納米管神經(jīng)電極的空間分辨率更高，記錄到的動(dòng)作電位峰間幅值可達(dá)80.4 μV。

因具有良好的力學(xué)性能，碳納米管非常適用于柔性神經(jīng)電極的構(gòu)筑。Zhang等38通過(guò)層層自組裝方法合成碳納米管與聚合物的納米復(fù)合材料，并以此為導(dǎo)電層制備柔性神經(jīng)電極。為了將柔性神經(jīng)電極順利地植入大腦，研究人員巧妙地將電極與梭子通過(guò)水冷凝過(guò)程暫時(shí)固定在一起，電極植入大鼠的運(yùn)動(dòng)皮層后，取出梭子。該電極具有較好的信噪比，可記錄到大鼠麻醉狀態(tài)下的低頻信號(hào)，峰值位于5 Hz。微電極陣列因具有多個(gè)記錄通道，能夠采集更加豐富的神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)信息而受到青睞。David-Pur等39在Ni圖案化催化層上用化學(xué)氣相沉積(chemical vapor deposition，CVD)法直接生長(zhǎng)多壁碳納米管，并將其轉(zhuǎn)移到柔性聚合物基底上制得全碳管器件。該電極陣列與體外培養(yǎng)的雞胚胎視網(wǎng)膜接觸，給予脈沖電刺激后可記錄到突觸前細(xì)胞興奮性活動(dòng)，加入受體拮抗劑阻斷突觸傳遞作用后無(wú)信號(hào)發(fā)放。Eleftheriou等40的研究進(jìn)一步顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，電極距視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞更近，碳納米管可結(jié)合到視網(wǎng)膜內(nèi)界膜中，電刺激的閾值降低，記錄信號(hào)的信噪比提高，因此研究人員將碳納米管列為人造視網(wǎng)膜的候選材料之一。

透明電極能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)光電調(diào)控與檢測(cè)，有助于神經(jīng)環(huán)路機(jī)制的研究，是神經(jīng)電極技術(shù)發(fā)展的一大方向。Zhang等41制備了一種透明可伸縮的柔性碳納米管腦皮層電極(electrocorticography，ECoG)陣列，該陣列含16個(gè)通道，在400 nm-2.5 μm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的透光性大于85%，經(jīng)過(guò)多次伸縮變形后電極的透光性及電學(xué)性能穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)電生理記錄、光遺傳和雙光子鈣成像等的多功能集成。將該電極陣列置于轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦皮層，可實(shí)現(xiàn)光遺傳調(diào)控和ECoG信號(hào)的同步記錄(如圖2c，d所示)，與Au電極相比，碳納米管引入的光刺激偽跡可忽略不計(jì)。

除了用于電生理技術(shù)，碳納米管還為腦深部刺激、神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域注入了新的活力。Pt-Ir、Au、不銹鋼等金屬電極常用于腦深部刺激療法，但在同時(shí)進(jìn)行的磁共振成像中會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的圖像變形以及偽影，影響電極植入位置的準(zhǔn)確判斷。Guo等42研究表明相較于Pt-Ir電極，碳納米管引起的磁共振成像失真更少，且免疫反應(yīng)范圍更小。多巴胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與獎(jiǎng)賞系統(tǒng)、成癮行為息息相關(guān)，常規(guī)采用電化學(xué)電極進(jìn)行檢測(cè)，但多巴胺的氧化產(chǎn)物具有化學(xué)活性，易在電極表面發(fā)生反應(yīng)形成絕緣層，影響電極檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Harreither等43制備了一種碳納米管纖維電極，抗多巴胺氧化產(chǎn)物污染的能力比常用的碳纖維電極提高了三倍。

2.3 碳納米管用于神經(jīng)電極的修飾材料

神經(jīng)電極的檢測(cè)位點(diǎn)多為金屬材料，采用碳納米管作為修飾層，能夠?qū)鹘y(tǒng)方法的普適性與納米材料的突出性能相結(jié)合，進(jìn)一步優(yōu)化神經(jīng)界面。Keefer等44利用電化學(xué)沉積或共價(jià)連接的方式，在商用鎢絲、不銹鋼絲電極外層修飾碳納米管材料，改善金屬電極的性能。修飾后電極在1 kHz時(shí)的阻抗值由940 kΩ降低至38 kΩ，電荷轉(zhuǎn)移能力比修飾前提高40倍，施加電刺激能夠更靈敏地誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生響應(yīng)。在大鼠運(yùn)動(dòng)皮層、猴子視覺皮層記錄神經(jīng)電信號(hào)，結(jié)果表明碳納米管修飾后的電極記錄到的信號(hào)幅值比對(duì)照組更大，噪聲更低。Suzuki等45在氧化銦錫(indium tin oxides，ITO)多電極陣列的記錄位點(diǎn)表面電鍍碳納米管，電鍍后電極陣列的電流密度大大提高，可檢測(cè)納摩爾濃度的多巴胺，將小鼠腦切片或體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元置于電極上，能以較大的信噪比記錄到突觸前膜的多巴胺釋放行為、場(chǎng)突觸后電位及動(dòng)作電位。Fuchsberger等46通過(guò)微接觸印刷技術(shù)對(duì)TiN微電極陣列進(jìn)行碳納米管修飾，修飾后電極檢測(cè)多巴胺的靈敏度提高，檢出限為1 μmol·L-1，而且記錄到的體外培養(yǎng)細(xì)胞的動(dòng)作電位幅值更大(如圖2e，f，g所示)。

以聚吡咯(polypyrrole，Ppy)、聚苯胺(polyaniline，PANI)、聚噻吩(polythiophene，PT)、聚乙撐二氧噻吩(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)，PEDOT)為代表的導(dǎo)電聚合物生物相容性好、合成方法簡(jiǎn)單，有助于在神經(jīng)界面實(shí)現(xiàn)離子-電子信號(hào)轉(zhuǎn)化，因此也是神經(jīng)電極表面修飾的重要材料。導(dǎo)電聚合物與碳納米管的復(fù)合材料將集成兩者的優(yōu)勢(shì)，在改善神經(jīng)-電極界面中發(fā)揮重要作用。碳納米管修飾電極的安全電荷注入量為1.0-1.6 mC·cm-2，經(jīng)過(guò)Ppy與單壁碳納米管電化學(xué)共沉積修飾后，電極的安全電荷注入量從1.0-1.6 mC·cm-2提升至7.5 mC·cm-247，且細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PC12細(xì)胞能夠在Ppy/SWCNTs薄膜上生長(zhǎng)并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在修飾后電極植入界面附近100 μm內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度更低。Chen等48將多壁碳納米管與PEDOT共沉積，復(fù)合材料修飾的神經(jīng)電極在1 kHz的阻抗為12 kΩ，安全電荷注入量提高至7.74 mC·cm-2，信噪比比未修飾前提高了約兩倍。此外，導(dǎo)電聚合物/碳納米管修飾層與電極基底的附著比單獨(dú)的導(dǎo)電聚合物更牢固。為了避免納米材料與腦組織直接接觸，預(yù)防碳納米管在植入后從器件脫落，Castagnola等49在PEDOT-PSSCNTs(PSS，聚苯乙烯磺酸鈉，poly(sodium-pstyrenesulfonate))涂層外包覆聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly(2-hydroxyethyl methacrylatey)，pHEMA)水凝膠作保護(hù)層。pHEMA水凝膠不會(huì)對(duì)電極的電化學(xué)性能以及信號(hào)檢測(cè)能力造成明顯影響。4周后電極仍能記錄到高質(zhì)量信號(hào)，且涂層保持完整沒(méi)有損壞。

碳納米管與導(dǎo)電聚合物的聯(lián)合使用，不僅能夠顯著改善界面的電學(xué)與機(jī)械性能，還可應(yīng)用于藥物的控制釋放，降低神經(jīng)電極與組織界面的免疫反應(yīng)。Luo等50采用電聚合生成的Ppy將載藥的碳納米管封閉起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了電刺激響應(yīng)下的控制釋放，且釋放出來(lái)的地塞米松具有生物活性，能夠降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度，效果與直接添加地塞米松相當(dāng)。Castagnola等51則在玻碳電極上電沉積了兩層修飾層，其中PEDOT-PSS-CNTs作為中間層，能使外側(cè)PEDOT-地塞米松層與玻碳基底緊密結(jié)合。

3 硅納米線構(gòu)筑神經(jīng)界面

硅納米線作為一種一維納米材料，與體材料相比，比表面積大、表面活性高、吸附能力強(qiáng)；與其他低維納米材料相比，具有半導(dǎo)體性質(zhì)，與現(xiàn)代半導(dǎo)體工藝兼容，展現(xiàn)了獨(dú)特的場(chǎng)發(fā)射、電子傳輸、光學(xué)性能。常用的硅納米線制備方法有化學(xué)氣相沉積法、金屬輔助化學(xué)刻蝕法、激光燒蝕法、熱蒸發(fā)法、水熱法等。硅納米線將硅的材料特性與納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起，可用于構(gòu)建多種類型的神經(jīng)電極，包括基于硅納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管的神經(jīng)電極和基于硅納米線陣列的神經(jīng)電極，特別適合細(xì)胞內(nèi)及閾值下信號(hào)的檢測(cè)。

3.1 硅納米線對(duì)神經(jīng)界面的調(diào)控

細(xì)胞粘附是細(xì)胞與生長(zhǎng)基底相互作用的第一步，在組織的發(fā)育和維持中具有重要意義。Park等52利用CVD法在硅襯底上合成出不同直徑的垂直對(duì)齊硅納米線，并在其上培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞(HEK 293T)，探究細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)與硅納米線機(jī)械性能之間的關(guān)系。結(jié)果表明直徑小、長(zhǎng)度長(zhǎng)的硅納米線更容易偏轉(zhuǎn)，為連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘著斑提供了更多的位點(diǎn)，有助于細(xì)胞的粘附并誘導(dǎo)其進(jìn)行取向生長(zhǎng)。利用電鏡觀察生長(zhǎng)情況，并對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定后，Qi等53提出了硅納米線對(duì)細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)的影響機(jī)制。細(xì)胞與針狀的硅納米線陣列接觸后，將絲狀偽足伸向細(xì)胞下面及周圍的硅納米線，形成數(shù)量較多的粘著斑以增強(qiáng)粘附，同時(shí)硅納米線簇之間的間距阻礙了細(xì)胞的進(jìn)一步伸展。

除了增強(qiáng)細(xì)胞的粘附，硅納米線還能在不受外力作用的條件下刺入細(xì)胞，與胞液直接接觸。Kim等54在硅納米線陣列上培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，借助共聚焦顯微鏡清楚地觀察到硅納米線刺入細(xì)胞，且細(xì)胞的壽命與刺入的硅納米線直徑有關(guān)，直徑越大細(xì)胞壽命越短。納米尺度的直徑和較大的高寬比使硅納米線容易進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)部，有助于在分子水平研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)。因此硅納米線在構(gòu)筑復(fù)雜神經(jīng)界面的候選材料中占據(jù)著重要的一席之地。

3.2 硅納米線神經(jīng)電極用于神經(jīng)電信號(hào)記錄

硅納米線與金屬氧化物半導(dǎo)體場(chǎng)效應(yīng)晶體管(metal oxide semiconductor field effect transistors，MOSFET)具有較好的匹配性，經(jīng)n型或p型摻雜后作為MOSFET的溝道，溝道跨導(dǎo)可通過(guò)表面電荷或電壓進(jìn)行調(diào)控。硅納米線FET檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)時(shí)，硅納米線與細(xì)胞接觸，當(dāng)神經(jīng)元活躍時(shí)，硅納米線附近環(huán)境電勢(shì)發(fā)生變化，晶體管器件獲取電流信號(hào)。采用自下而上的制備方法，硅納米線可以構(gòu)筑寬尺寸范圍的神經(jīng)電極，從亞細(xì)胞到細(xì)胞尺寸水平，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)和胞外神經(jīng)電信號(hào)記錄。

近十幾年來(lái)，Lieber課題組55-59報(bào)道了一系列基于硅納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管的納米電子器件，主要分為平面型、扭結(jié)狀、U型硅納米線FET以及基于納米線-納米管異質(zhì)結(jié)的枝狀FET。Patolsky等55在平面基底上制備高密度硅納米線FET陣列，研究了大鼠神經(jīng)元的信號(hào)傳播。圖案化多聚賴氨酸直接誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突和樹突沿納米線陣列生長(zhǎng)，形成多個(gè)硅納米線-神經(jīng)突起異質(zhì)結(jié)，接觸面積僅占0.01-0.02 μm2。在軸突和單個(gè)樹突起始處通過(guò)硅納米線FET施加電刺激，根據(jù)同一方向上其他硅納米線FET記錄到興奮性活動(dòng)的時(shí)間，測(cè)得信號(hào)沿軸突和樹突傳播速率分別為(0.46 ± 0.06)、(0.15 ±0.04)m·s-1。

膜片鉗是傳統(tǒng)的胞內(nèi)信號(hào)記錄技術(shù)，其尺寸大小與界面阻抗存在矛盾，為了解決這一問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)在減小細(xì)胞受到物理?yè)p傷的情況下進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)記錄，Tian等56和Qing等57采用扭結(jié)硅納米線構(gòu)建了三維、柔性的納米FET生物探針，探針尖端呈60°，外層包覆磷脂雙分子層以利于探針記錄胞內(nèi)信號(hào)。當(dāng)硅納米線FET納米探針未與小鼠心肌細(xì)胞(HL-1)接觸時(shí)，電位顯示為0 mV，當(dāng)探針尖端進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，電位由0 mV變?yōu)?46 mV，與玻璃微管電極記錄到的-50 mV胞內(nèi)電位相差不大。類似的，Zhao等58提出一種三維U型硅納米線FET的設(shè)想，并規(guī)模化制造了數(shù)千個(gè)可記錄細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的納米線晶體管探針，探究了納米線的形狀與尺寸對(duì)信號(hào)質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)曲率半徑與尺寸越小的FET能夠記錄到幅值更大的動(dòng)作電位。此外，在單個(gè)探針臂上還可放置多個(gè)納米線FET實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的多位點(diǎn)檢測(cè)(如圖3a，b所示)。溝道長(zhǎng)度約為50 nm、曲率半徑為0.75 μm的U型硅納米線FET在不經(jīng)過(guò)脂質(zhì)重新修飾的情況下，連續(xù)記錄了6個(gè)獨(dú)立的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的胞內(nèi)動(dòng)作電位，信號(hào)的波形、幅值、發(fā)放模式及信噪比等特征都與膜片鉗記錄結(jié)果相似。上述研究證明了納米線FET具有尺寸小、可集成、侵入性小、不與細(xì)胞發(fā)生溶液交換等優(yōu)點(diǎn)，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的膜片鉗電極進(jìn)行高時(shí)空分辨率的胞內(nèi)信號(hào)記錄。

扭結(jié)硅納米線需要原位逐個(gè)地組裝到生物探針上，難以大批量制備，限制了扭結(jié)硅納米線生物探針的進(jìn)一步發(fā)展。Duan等59提出了另一種硅納米線FET，將二氧化硅納米管和硅納米線連接在一起形成T形結(jié)構(gòu)，中空的納米管能穿透細(xì)胞膜使納米線與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)相接觸，這種器件被稱為枝狀納米管-場(chǎng)效應(yīng)晶體管。增加了二氧化硅納米管后，F(xiàn)ET的靈敏度由-170 nS·V-1提升至-4530 nS·V-1。由于FET檢測(cè)神經(jīng)電活動(dòng)不受界面阻抗的影響，該器件中的二氧化硅納米管尺寸可減小至3 nm，與神經(jīng)細(xì)胞形成了穩(wěn)定、緊密的封裝界面，信號(hào)記錄的空間分辨率大大提高。

圖3 硅納米線電子器件構(gòu)筑神經(jīng)界面Fig.3 Silicon nanowire-based nanoelectronic devices for neural interfaces.

為了能夠更好地同時(shí)進(jìn)行體外組織培養(yǎng)和神經(jīng)活動(dòng)檢測(cè)，Tian等60發(fā)展了基于硅納米線場(chǎng)效應(yīng)晶體管的多孔柔性納米電子支架，實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活動(dòng)以及它們對(duì)藥物、pH變化的反應(yīng)。Dai等61進(jìn)一步將含有64個(gè)納米線晶體管的平面網(wǎng)狀支架通過(guò)內(nèi)應(yīng)力組裝成三維支架，在支架中體外培養(yǎng)大鼠心臟組織，同時(shí)記錄胞外動(dòng)作電位，研究傳播方式。在8天的記錄期間，動(dòng)作電位數(shù)量及幅值隨著組織發(fā)育而提升。

由于自下而上法制備納米線不受生長(zhǎng)襯底的限制，硅納米線FET可集成到多種材料體系中。Qing等62在透明基底上制備硅納米線FET陣列，記錄急性腦切片中的單個(gè)細(xì)胞動(dòng)作電位，繪制神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能性連接，并進(jìn)行多角度光學(xué)成像，更加完整地觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。利用3-500 μm間距不等的多個(gè)硅納米線晶體管記錄電刺激響應(yīng)信號(hào)，通過(guò)比較相鄰晶體管的電導(dǎo)極性與振幅差異可獲取信號(hào)的空間分辨率，最高為5 μm。該器件記錄到的信號(hào)幅值在0.3-3 mV，通過(guò)使用突觸或離子通道阻斷劑，可將這些信號(hào)歸于突觸前或突觸后發(fā)放。硅納米線FET還可集成至多孔柔性網(wǎng)格神經(jīng)探針63,64，采用玻璃管注射或冷凍方式植入小鼠腦中，與腦組織形成生物相容的神經(jīng)界面，但是如何在活體實(shí)驗(yàn)中對(duì)胞內(nèi)和胞外的神經(jīng)電信號(hào)進(jìn)行穩(wěn)定記錄，還有待進(jìn)一步的探索。

硅納米線除了可以用于構(gòu)建FET納米電子器件外，還可以用于構(gòu)建神經(jīng)電極陣列，以垂直硅納米線電極陣列為典型例子。Robinson等65制備了一種垂直硅納米線電極陣列，在每個(gè)位點(diǎn)上有9個(gè)垂直的硅納米線，直徑約為150 nm，長(zhǎng)度為3 μm，納米線以Si為核、以SiO2為殼，尖端濺射金屬層Ti/Au。細(xì)胞與金屬尖端接觸，通過(guò)SiO2形成緊密封裝，防止電流泄漏。在電極陣列上體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)元電活動(dòng)的刺激與記錄。研究人員還聯(lián)合使用該電極陣列與膜片鉗技術(shù)，繪制了單個(gè)突觸后神經(jīng)元的多個(gè)突觸連接。Liu等66利用硅納米線電極陣列記錄體外培養(yǎng)的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)來(lái)源的神經(jīng)元活動(dòng)，時(shí)長(zhǎng)可持續(xù)6周，信號(hào)幅值可達(dá)99 mV。動(dòng)作電位的極性反映了硅納米線所處的位置，刺入細(xì)胞內(nèi)的硅納米線記錄到正電位，而細(xì)胞外的硅納米線則記錄到負(fù)電位(如圖3c所示)。

3.3 硅納米線用于神經(jīng)活動(dòng)調(diào)控

通過(guò)電或光刺激調(diào)控神經(jīng)元活動(dòng)，對(duì)腦科學(xué)基礎(chǔ)研究與腦疾病臨床治療都有著深遠(yuǎn)意義。目前神經(jīng)元活動(dòng)的光學(xué)調(diào)控主要采用光遺傳方法67-69，它結(jié)合了光學(xué)、遺傳學(xué)和電生理等技術(shù)，使目標(biāo)神經(jīng)元在特定波長(zhǎng)的光刺激下產(chǎn)生興奮性或抑制性活動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用。由于需要提前在目標(biāo)神經(jīng)元中表達(dá)光敏蛋白，光遺傳方法的應(yīng)用范圍受到限制。近年來(lái)，研究人員將目光投向電學(xué)、光學(xué)特性高度可調(diào)的硅納米材料，借助它們實(shí)現(xiàn)了無(wú)需基因操縱的遠(yuǎn)程光學(xué)調(diào)控作用。

Jiang等70采用異質(zhì)硅介孔結(jié)構(gòu)顆粒構(gòu)建了脂質(zhì)雙分子層支撐的生物電界面，該顆粒以有序的硅納米線為骨架，隨機(jī)分布亞微米級(jí)孔洞，平均楊氏模量比單晶硅小2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，具有生物相容性，可降解，通過(guò)快速瞬時(shí)的光熱效應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)元去極化，打開鈉離子通道，產(chǎn)生動(dòng)作電位。通過(guò)透射電鏡觀察橫截面可知該介觀結(jié)構(gòu)材料中的硅納米線取向不受與之接觸的細(xì)胞表面影響，表明生物界面的穩(wěn)定性與硅顆粒的形貌關(guān)系不大。波長(zhǎng)與功率一定，使用不同時(shí)長(zhǎng)的532 nm脈沖激光在生物界面誘發(fā)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，平均閾值能量為5.32 μJ。接著以不同頻率條件施加該能量的脈沖激光，發(fā)現(xiàn)頻率增加，刺激效果減弱，而閾值下去極化行為更加明顯。Parameswaran等71研究了獨(dú)立的p型/本征/n型同軸硅納米線(PIN-SiNW)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)制，在單個(gè)納米線上記錄到了持續(xù)的陰極光電流，該電流可通過(guò)表面Au原子增強(qiáng)的光電化學(xué)過(guò)程激發(fā)原代培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位(如圖3d，e，f所示)。

Jiang等72以生物學(xué)原理為指導(dǎo)，提出一系列基于硅材料的自支撐生物電子設(shè)備的設(shè)計(jì)構(gòu)想，構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間及細(xì)胞外多尺度的生物界面，并在這些界面上對(duì)多種生理活動(dòng)進(jìn)行光學(xué)調(diào)控。Jiang等73總結(jié)了硅納米材料用于非遺傳式光調(diào)控的規(guī)范化流程，包括材料合成步驟、器件加工方法、材料光響應(yīng)評(píng)估方法及儀器的詳細(xì)使用方法等，并介紹了利用硅納米材料對(duì)細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)元興奮性、腦片神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及活體腦活動(dòng)進(jìn)行光調(diào)控的研究實(shí)例。如何用非遺傳式的方法實(shí)現(xiàn)特定腦區(qū)的神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)控，是未來(lái)需要解決的難題之一。

4 石墨烯構(gòu)筑神經(jīng)界面

二維層狀材料的表面活性位點(diǎn)極多，展現(xiàn)出了與體材料不同的優(yōu)異性能，石墨烯就是其中的一類。石墨烯由sp2雜化的碳原子以六邊形蜂窩狀排列方式組成，電子遷移率、導(dǎo)熱系數(shù)、拉伸強(qiáng)度等都大大優(yōu)于其他材料，具有獨(dú)特的光學(xué)特性、機(jī)械穩(wěn)定性與生物相容性。石墨烯可經(jīng)功能化反應(yīng)得到氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)及化學(xué)修飾石墨烯等衍生物?；谄渫怀龅男阅?，石墨烯被認(rèn)為是一種革命性的二維納米材料，受到了學(xué)術(shù)界與工業(yè)界的廣泛關(guān)注。除了在材料學(xué)、新能源等領(lǐng)域具有應(yīng)用前景，石墨烯也有望替代傳統(tǒng)材料，用于構(gòu)筑性能更加優(yōu)異、功能更加多樣的神經(jīng)界面。

4.1 石墨烯對(duì)神經(jīng)界面的調(diào)控

干細(xì)胞擁有自我更新與增殖分化能力，主要應(yīng)用于神經(jīng)再生與修復(fù)、組織器官移植等。干細(xì)胞的活動(dòng)受胞外微環(huán)境的影響，同時(shí)還與生長(zhǎng)基底的表面形貌、應(yīng)力、彈性、剛度及孔隙率等有關(guān)74?；谑┎牧系亩S平面襯底21(如圖4a所示)或三維細(xì)胞支架22能夠提供仿生微環(huán)境，調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)，有助于進(jìn)一步了解干細(xì)胞的命運(yùn)決定機(jī)制。Guo等75用水熱還原法合成線型rGO纖維細(xì)胞支架，rGO纖維直徑約100 μm，表面粗糙，納米級(jí)多孔結(jié)構(gòu)能夠提高神經(jīng)干細(xì)胞新陳代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)效率，從而幫助細(xì)胞更好地粘附在纖維表面并生長(zhǎng)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，神經(jīng)干細(xì)胞在這種纖維上的增殖速率比在石墨烯薄膜、組織培養(yǎng)板上的快，能夠在纖維表面形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，并且更傾向于分化成神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)胞。

除了干細(xì)胞療法，研究人員還致力于新型人工神經(jīng)導(dǎo)管的開發(fā)。神經(jīng)導(dǎo)管允許施旺細(xì)胞聚集、增殖，接納再生軸突，因能解決自體神經(jīng)來(lái)源有限、異體神經(jīng)存在免疫原性等問(wèn)題，成為治療周圍神經(jīng)缺損的自體神經(jīng)移植替代物。Qian等76結(jié)合3D打印與逐層流延技術(shù)構(gòu)建了一種多層多孔神經(jīng)導(dǎo)管，該導(dǎo)管由聚多巴胺/多肽、石墨烯與聚己內(nèi)酯組成，其中聚多巴胺與多肽能夠增強(qiáng)石墨烯對(duì)細(xì)胞膜的親和性，將導(dǎo)管植入大鼠體內(nèi)，在坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中有效促進(jìn)了神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)與髓鞘化，實(shí)現(xiàn)了外周神經(jīng)修復(fù)功能。

圖4 石墨烯電子器件用于檢測(cè)神經(jīng)電活動(dòng)Fig.4 Graphene-based electronics for neural recordings.

4.2 石墨烯神經(jīng)電極用于神經(jīng)電信號(hào)刺激與記錄

用于神經(jīng)信號(hào)刺激與記錄的石墨烯電子器件主要分為微電極和場(chǎng)效應(yīng)晶體管兩類。要實(shí)現(xiàn)高的信噪比和高時(shí)空分辨率的神經(jīng)活動(dòng)記錄及電刺激功能，微電極尺寸最好與單個(gè)神經(jīng)元大小相當(dāng)，界面阻抗低，電荷注入容量適當(dāng)高以確保能夠傳遞足夠數(shù)量的電荷使細(xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)而又不損壞電極與生物介質(zhì)。Wang等77采用濕法紡絲法獲得了以自支撐石墨烯纖維為導(dǎo)電層的神經(jīng)微電極，濺射Pt作涂層(如圖4b所示)，兩種材料的協(xié)同效應(yīng)大大提高了該電極的電學(xué)性能，與單獨(dú)的石墨烯和Pt電極相比，1 kHz時(shí)的阻抗分別降低了5倍和300倍。電極的電荷注入容量為10.34 mC·cm-2，以9.2 dB的較高信噪比成功記錄到大鼠運(yùn)動(dòng)皮層以下1.5 mm深度處的單個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)。

除了直接作導(dǎo)電層，石墨烯也可作為電極的修飾層材料，使神經(jīng)界面更加穩(wěn)定高效。Bourrier等78將連續(xù)的單層石墨烯轉(zhuǎn)移到密歇根電極上，植入后電極周邊的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比修飾前的少，在5周時(shí)間內(nèi)均可記錄到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的動(dòng)作電位。然而，有研究顯示，由于受電極制備方法的限制與影響，修飾層材料與基底間的附著并不穩(wěn)固，可能會(huì)從電極上脫落，導(dǎo)致電極性能降低甚至失效。為了解決這一問(wèn)題，Lu等79通過(guò)CO2激光裂解法直接在PI基底上生成三維多孔石墨烯，制備得到柔性ECoG微電極陣列(如圖4c所示)。摻雜硝酸后，電極在1 kHz時(shí)的阻抗為519 Ω，電荷注入容量為3.1 mC·cm-2，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)鉑電極。將該多孔石墨烯電極置于大鼠皮層可記錄到低頻場(chǎng)電位信號(hào)(如圖4d所示)，施加電刺激可引發(fā)大鼠腿部肌肉活動(dòng)。相較于微電極，場(chǎng)效應(yīng)晶體管的突出優(yōu)點(diǎn)是不受熱噪聲的影響，更易于構(gòu)筑高空間分辨率的神經(jīng)電極。Garrido課題組報(bào)道了一種柔性石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管，單層石墨烯作溝道連接兩端的源極和漏極，浸沒(méi)在電解質(zhì)溶液中的參比電極施加?xùn)艠O電壓調(diào)控溝道電流。利用該石墨烯FET，研究人員分別記錄了麻醉狀態(tài)下大鼠皮層產(chǎn)生的自發(fā)慢波、視聽覺誘發(fā)的響應(yīng)信號(hào)以及癲癇大鼠的同步放電活動(dòng)80，發(fā)現(xiàn)石墨烯FET的信噪比與現(xiàn)有的鉑黑電極相當(dāng)，但在低頻范圍內(nèi)信噪比更高，適于記錄活動(dòng)頻率極低的皮層擴(kuò)散性抑制信號(hào)81。近年來(lái)，本課題組也對(duì)石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管用于神經(jīng)活動(dòng)檢測(cè)進(jìn)行了研究。Du等82研制了雙模式的柔性石墨烯FET陣列，ECoG電極貼附在大鼠腦表面，深部電極植入腦組織中，兩種模式的電極同時(shí)記錄青霉素誘發(fā)的癲癇信號(hào)，結(jié)果顯示表面癲癇信號(hào)的幅值明顯大于深部癲癇信號(hào)，癲癇放電過(guò)程始于腦表面，并且隨著時(shí)間的推移，腦表面和深部區(qū)域癲癇活動(dòng)的同步性逐漸增強(qiáng)。

此外，本課題組還利用一維納米材料碳納米管和二維納米材料石墨烯的雜化優(yōu)勢(shì)，采用一步化學(xué)合成法制備了無(wú)縫連接的單片全碳晶體管。全碳晶體管由石墨烯溝道和石墨烯/碳納米管雜化膜組成，具有連續(xù)的接觸電極，利用微納米加工技術(shù)，進(jìn)一步制備了全碳晶體管陣列83。由于石墨烯FET的最小檢測(cè)限與其有效面積的平方根呈反比關(guān)系，所以不能無(wú)限制地減小石墨烯晶體管的尺寸來(lái)提高空間分辨率。為了進(jìn)一步提高全碳晶體管陣列的空間分辨率，Yang等84采用機(jī)械壓縮法制備了柔性褶皺全碳晶體管陣列，在不損失晶體管有效面積的同時(shí)，器件的投影面積降低至原有面積的16%，空間分辨率提高6倍。在大的機(jī)械形變下，常規(guī)的石墨烯/金屬晶體管往往會(huì)產(chǎn)生應(yīng)力破裂和節(jié)的失效，但石墨烯和碳納米管仍能保持穩(wěn)定的電學(xué)性能。研究人員利用該器件實(shí)現(xiàn)了大鼠癲癇信號(hào)的在體高空間分辨檢測(cè)(如圖4e，f所示)。上述結(jié)果表明，新型材料的研究和器件的設(shè)計(jì)對(duì)于推動(dòng)納米神經(jīng)電極的發(fā)展具有重要的作用。

4.3 石墨烯構(gòu)筑多模態(tài)集成神經(jīng)電極

神經(jīng)電極記錄神經(jīng)電信號(hào)的時(shí)間分辨率較高，不足之處在于無(wú)法記錄大面積和高通量的神經(jīng)元電活動(dòng)85。透明神經(jīng)電極可將電生理與神經(jīng)成像、光遺傳等技術(shù)結(jié)合起來(lái)，改善這一問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)電極位點(diǎn)處神經(jīng)細(xì)胞在光或電刺激下活動(dòng)狀態(tài)的觀察，有助于更加清晰完整地認(rèn)識(shí)腦的結(jié)構(gòu)與功能。ITO是透明電極的常用材料，但它的缺點(diǎn)是受到外力易產(chǎn)生裂縫，從而影響器件的使用壽命。石墨烯在較寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)的透光性均超過(guò)90%86，且機(jī)械穩(wěn)定性好，兼具柔性、生物相容性，因此成為構(gòu)筑多功能神經(jīng)界面的首選材料。此外，與磁共振成像兼容的神經(jīng)電極，可將高分辨率的電生理檢測(cè)與大腦活動(dòng)成像相結(jié)合，對(duì)于基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究和臨床腦疾病研究都至關(guān)重要。

Park等87發(fā)展了透明的石墨烯μECoG (microelectrocorticography)電極陣列并利用它開展了以下研究：(1)μECoG可對(duì)自發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)和電刺激誘發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行穩(wěn)定記錄；(2)結(jié)合光遺傳，記錄并比較轉(zhuǎn)基因小鼠在不同光刺激下的響應(yīng)信號(hào)；(3)通過(guò)熒光顯微法、光學(xué)相干斷層成像，觀察石墨烯神經(jīng)電極與神經(jīng)組織界面的狀態(tài)特征。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明石墨烯電極的電學(xué)性能、神經(jīng)信號(hào)記錄性能都與常規(guī)的Pt或Au電極相當(dāng)，但在活體光學(xué)成像方面擁有顯著優(yōu)勢(shì)，石墨烯電極位點(diǎn)下方的血管組織成像清晰，而常規(guī)金屬電極則會(huì)阻擋觀察視野(如圖5a，b，c所示)。在此基礎(chǔ)上，研究人員還借助鈣離子成像，繪制了神經(jīng)組織在石墨烯電極施加不同電刺激條件下的時(shí)空活動(dòng)(如圖5d，e，f所示)88。

Kuzum等89報(bào)道了一種同時(shí)用于神經(jīng)信號(hào)檢測(cè)與鈣成像的透明石墨烯電極。該電極可實(shí)現(xiàn)對(duì)自發(fā)腦電和藥物或刺激誘發(fā)的相關(guān)電位的檢測(cè)，且噪聲水平比相同尺寸的Au電極低5-6倍。在鈣成像中，因鈣瞬變緩慢，無(wú)法觀測(cè)高頻神經(jīng)活動(dòng)，可借助石墨烯神經(jīng)電極對(duì)其進(jìn)行記錄；反之，鈣成像能夠反映神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中單個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)狀態(tài)。此外，研究人員在石墨烯電極陣列位置實(shí)現(xiàn)了一系列從微觀到介觀的電信號(hào)記錄與光成像結(jié)構(gòu)觀察，包括距離腦表面1200 μm深度的雙光子成像、光遺傳刺激引發(fā)的小動(dòng)脈擴(kuò)張及電刺激導(dǎo)致的血液動(dòng)力學(xué)響應(yīng)(如圖5g，h，i所示)90。光遺傳刺激和電信號(hào)同時(shí)記錄是神經(jīng)環(huán)路研究的重要方法，但是傳統(tǒng)金屬電極在光刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生偽跡，影響電信號(hào)的記錄。上述兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，石墨烯神經(jīng)電極在同時(shí)進(jìn)行光刺激和電記錄時(shí)，均未產(chǎn)生光學(xué)引發(fā)的偽跡，解決了傳統(tǒng)金屬電極存在的問(wèn)題。

圖5 多模態(tài)集成的石墨烯神經(jīng)電極Fig.5 Graphene microelectrodes for multimodal neural interfaces.

Jeong等91制備了透明的石墨烯/垂直排列碳納米管神經(jīng)電極，其中碳納米管與細(xì)胞形成緊密接觸，石墨烯為光學(xué)觀察與調(diào)控提供了便利，同時(shí)雜化材料顯示了突出的導(dǎo)電性，利用該電極可檢測(cè)到大鼠皮層神經(jīng)元自發(fā)的動(dòng)作電位，峰間幅值高達(dá)1600 μV。Zhao等92通過(guò)低壓化學(xué)氣相沉積(low pressure chemical vapor deposition，LPCVD)法在銅微絲外包覆無(wú)縫、全覆蓋的石墨烯，得到與磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)兼容的神經(jīng)電極。石墨烯的加入能夠解決常規(guī)銅材料電極具有生物毒性不適于活體檢測(cè)的難題。該電極可以記錄到局部場(chǎng)電位和動(dòng)作電位，且MRI研究證明其不會(huì)產(chǎn)生磁共振偽影。隨著神經(jīng)檢測(cè)和各種成像技術(shù)的更新迭代，對(duì)大腦研究的方法將更加的多樣化，神經(jīng)電極必將向著多模態(tài)集成的方向發(fā)展。

5 其他一維和二維納米材料構(gòu)筑神經(jīng)界面

除了上述受到廣泛關(guān)注的碳納米管、硅納米線和石墨烯納米材料，金屬及金屬氧化物納米線、氮化硼納米管、黑磷(black phosphorus，BP)及過(guò)渡金屬碳/氮化物(MXene)等一維和二維納米材料也被應(yīng)用于神經(jīng)界面的構(gòu)筑，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏窠?jīng)活動(dòng)檢測(cè)與刺激、視覺假體、組織修復(fù)等方面發(fā)揮了重要作用。

5.1 其他一維納米材料構(gòu)筑神經(jīng)界面

金屬納米線是一維納米材料的重要組成部分，具有獨(dú)特的電學(xué)和機(jī)械性能，可改善神經(jīng)界面，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)電活動(dòng)的在體穩(wěn)定記錄。Kang等93在鎢絲尖端粘附單晶金納米線制備得到亞細(xì)胞尺寸的神經(jīng)電極，將該電極植入小鼠海馬腦區(qū)，信噪比及空間分辨率均優(yōu)于鎢絲電極，可記錄到單個(gè)神經(jīng)元電活動(dòng)，以及社交情景與疾病狀態(tài)下腦電活動(dòng)的變化。神經(jīng)電極的記錄功能不同，對(duì)電極的性能要求不同，用于脊髓神經(jīng)元活動(dòng)檢測(cè)的神經(jīng)電極需要具有可拉伸性。Lu等94通過(guò)熱拉伸聚合物，隨后包覆一層網(wǎng)狀銀納米線作導(dǎo)電層和PDMS作絕緣層，制得一種柔性可拉伸的光電電極。與連續(xù)的金屬薄膜相比，網(wǎng)狀銀納米線導(dǎo)電層在彎曲和拉伸狀態(tài)下不易破裂，確保電極兼具良好的機(jī)械與電學(xué)性能，實(shí)驗(yàn)表明該電極在拉伸100%后仍能保持較低的阻抗。該電極可記錄光刺激響應(yīng)下的脊髓神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?，研究人員還發(fā)現(xiàn)光誘導(dǎo)的神經(jīng)活動(dòng)可導(dǎo)致小鼠后肢肌肉收縮。進(jìn)一步增加電極通道數(shù)、排除信號(hào)檢測(cè)時(shí)運(yùn)動(dòng)噪聲的干擾是脊髓用神經(jīng)電極的發(fā)展方向。

金屬氧化物納米材料具有多種氧化態(tài)、配位數(shù)和對(duì)稱性，展現(xiàn)出更加復(fù)雜的晶體結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的光電學(xué)性能95，這也使其在神經(jīng)界面構(gòu)筑中具有特殊的地位。Tybrandt等96以金修飾的二氧化鈦(Au-TiO2)納米線作導(dǎo)電層制備32通道的柔性神經(jīng)網(wǎng)格電極(如圖6a所示)，并將該電極植入大鼠的軀體感覺皮層，由于該電極可拉伸，動(dòng)物手術(shù)時(shí)的開顱面積可小于電極尺寸。該電極可檢測(cè)刺激后肢產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)、不同睡眠時(shí)期的場(chǎng)電位變化(如圖6b所示)，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定可靠地對(duì)神經(jīng)電活動(dòng)進(jìn)行記錄。高取向性和各向異性的一維納米線的形貌和結(jié)構(gòu)與感光體類似，能夠有效實(shí)現(xiàn)光吸收和電荷分離，因此非常適宜構(gòu)建視覺神經(jīng)假體。受光感受器的結(jié)構(gòu)與納米線光伏器件的功能啟發(fā)，Tang等97研發(fā)了一種Au-TiO2納米線陣列人工光感受器(如圖6c所示)，定向排列在柔性基底上的納米線增強(qiáng)了與視覺神經(jīng)界面交互的有效性，在光照的作用下可以產(chǎn)生光電流使神經(jīng)元去極化，而Au納米顆粒通過(guò)表面等離子體共振效應(yīng)提高TiO2納米線在可見光范圍內(nèi)的光吸收。研究人員將Au-TiO2納米線陣列植入失明小鼠的視網(wǎng)膜下方，發(fā)現(xiàn)小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)綠光、藍(lán)光及近紫外光的響應(yīng)(如圖6d所示)，空間分辨率約50 μm。此外，在初級(jí)視覺皮層記錄到光誘導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)和瞳孔反射活動(dòng)增強(qiáng)，表明這種人工光感受器有助于重建視覺功能。此外，進(jìn)一步提高納米線陣列對(duì)光的靈敏度以改善空間分辨率、發(fā)展具有不同頻段光譜響應(yīng)的納米線類型以實(shí)現(xiàn)彩色視覺的感知，是下一步需要解決的問(wèn)題。

氮化硼納米管是碳納米管的結(jié)構(gòu)類似物，具有獨(dú)特的機(jī)械、化學(xué)和電學(xué)性能。Ciofani等98提出了一種由氮化硼納米管與超聲波聯(lián)合調(diào)控的非侵入式間接電刺激方法。由于氮化硼納米管具有良好的壓電性，可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，接收超聲波后因壓電效應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)部極化，從而給予細(xì)胞電刺激。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受到氮化硼納米管電刺激的PC12細(xì)胞的突起長(zhǎng)度比未受刺激的長(zhǎng)30%，推測(cè)電刺激可能激活了神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)信號(hào)通路中TrkA受體下游的的信號(hào)分子，氮化硼納米管充當(dāng)了內(nèi)流的鈣離子角色。盡管這種電刺激方法得到了概念性驗(yàn)證，借助壓電效應(yīng)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)刺激引發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)變化尚未揭露，氮化硼納米管的生物安全性也還有待更加詳細(xì)全面的評(píng)估。

5.2 其他二維納米材料構(gòu)筑神經(jīng)界面

二維半導(dǎo)體層狀材料BP是最穩(wěn)定的磷同素異形體，能帶間隙調(diào)控范圍較寬，常用作高性能場(chǎng)效應(yīng)晶體管的溝道材料，基于BP的光電器件的響應(yīng)波長(zhǎng)范圍涵蓋紫外光波段到微波波段99。近年來(lái)，黑磷-生物界面的多項(xiàng)研究表明，BP在生物醫(yī)學(xué)方面同樣具有很大的應(yīng)用前景。過(guò)渡金屬離子代謝異常是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵因素之一，使用螯合劑將它們變?yōu)闊o(wú)毒的金屬配合物能夠起到神經(jīng)保護(hù)的作用。Chen等100首次將BP納米片用作納米藥物，它不需要額外負(fù)載其他藥物，可高效地選擇性螯合過(guò)多的銅離子，減少活性氧，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不受到毒害。與其他納米藥物相比，BP納米片的顯著優(yōu)勢(shì)是可通過(guò)光熱效應(yīng)提高血腦屏障的通透性從而穿越血腦屏障進(jìn)入腦組織。BP在生理環(huán)境下可被氧化成磷酸根離子等小分子產(chǎn)物，起到促進(jìn)細(xì)胞粘附和軸突延伸作用101。Qian等102制備了同軸逐層組裝的黑磷/聚己內(nèi)酯納米支架，BP能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被緩慢釋放。該支架具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和導(dǎo)電性，在輕度氧化應(yīng)激條件下能夠誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)、刺激鈣依賴的軸突和髓鞘再生，植入后4個(gè)月時(shí)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。Liu等103則考察了BP與氧化石墨烯納米片對(duì)細(xì)胞增殖和骨再生的協(xié)同效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯主要在初期增強(qiáng)細(xì)胞粘附，BP促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。

過(guò)渡金屬碳/氮化物(MXene)是二維納米材料的新成員，片層結(jié)構(gòu)與石墨烯類似，由于具有良好的導(dǎo)電性、親水性和大的比表面積，成為構(gòu)筑神經(jīng)界面的理想材料。Xu等104利用超薄導(dǎo)電的Ti3C2MXene構(gòu)建了FET，用于海馬神經(jīng)細(xì)胞的多巴胺檢測(cè)和神經(jīng)電信號(hào)記錄，時(shí)間分辨率可達(dá)50 ms。透明的Ti3C2MXene有助于同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)電信號(hào)記錄與鈣離子成像，可與神經(jīng)細(xì)胞形成長(zhǎng)期穩(wěn)定的兼容性神經(jīng)界面。Driscoll等105將Ti3C2MXene分散液直接旋涂到硅片上制備神經(jīng)電極。與同樣尺寸的Au電極相比，Ti3C2電極的阻抗值降低4倍，信噪比更高(如圖6e，f所示)。神經(jīng)元可在Ti3C2薄膜上生長(zhǎng)并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明Ti3C2無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。

圖6 其他一維和二維納米材料構(gòu)筑神經(jīng)界面Fig.6 Other 1D and 2D nanomaterials for neural interfaces.

6 總結(jié)與展望

實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元集群活動(dòng)的實(shí)時(shí)觀察，進(jìn)而解析神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)認(rèn)識(shí)腦、保護(hù)腦、開發(fā)腦具有重要意義。神經(jīng)電極是檢測(cè)神經(jīng)電生理信號(hào)的重要工具，電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性有賴于電極-神經(jīng)組織界面的物理、化學(xué)、機(jī)械及電學(xué)性質(zhì)106。傳統(tǒng)的神經(jīng)電極由硅或貴金屬組成，但因力學(xué)性能與腦組織不匹配，電極尺寸受到限制，電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、時(shí)空分辨率都有待提高。具有優(yōu)異性能的納米材料的出現(xiàn)，為構(gòu)筑及調(diào)控神經(jīng)界面開辟了新的途徑。在前文中，我們對(duì)一維碳納米管和硅納米線、二維石墨烯以及其他一維二維納米材料各自的性質(zhì)、與細(xì)胞的相互作用以及在神經(jīng)電極中的應(yīng)用做了綜述。眾多研究表明，納米材料具有良好的生物相容性，其尺寸及電學(xué)性能可以被精準(zhǔn)調(diào)控，易于轉(zhuǎn)移到柔性基底上制備成柔性神經(jīng)電極，電極與腦組織的力學(xué)性能更加匹配，長(zhǎng)期植入的機(jī)械相容性更好，大大改善了傳統(tǒng)記錄方法存在的局限性，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞、腦片和活體動(dòng)物大腦組織神經(jīng)元電活動(dòng)的記錄與刺激、神經(jīng)遞質(zhì)的微量檢測(cè)以及與光遺傳、光成像、核磁共振等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。

盡管取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，基于納米材料構(gòu)筑的神經(jīng)電極還需要更深入、更全面的研究，特別是作用機(jī)制以及在實(shí)際應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題。例如，納米材料與神經(jīng)組織的相互作用、干細(xì)胞在納米材料上的命運(yùn)決定機(jī)制、電極材料在植入腦組織后的動(dòng)力學(xué)變化以及納米材料在體內(nèi)的毒性等都尚未得到清楚的認(rèn)識(shí)。Pampaloni等107通過(guò)理論模擬及實(shí)驗(yàn)觀察，提出單層石墨烯能夠調(diào)控細(xì)胞外離子分布，在石墨烯表面俘獲鉀離子，降低了鉀離子的遷移率，從而導(dǎo)致石墨烯上生長(zhǎng)的神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)。Li等108在石墨烯上體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)與聚苯乙烯組織培養(yǎng)板相比，石墨烯上神經(jīng)元的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)水平更高，推測(cè)這是石墨烯能夠促進(jìn)神經(jīng)突起出芽生長(zhǎng)的原因之一。

目前基于納米材料的神經(jīng)電極主要在嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，如何利用神經(jīng)電極實(shí)現(xiàn)全腦尺度的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制追蹤以及如何對(duì)人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行臨床診斷與治療是未來(lái)的研究趨勢(shì)，這也對(duì)神經(jīng)界面提出了更高的要求。首先是納米材料的安全性，顆粒濃度、尺寸大小、幾何形狀、組成及表面等多種復(fù)雜因素共同決定了納米材料的毒性效應(yīng)，體現(xiàn)在產(chǎn)生活性氧、溶入有毒離子、改變蛋白質(zhì)折疊構(gòu)象、造成細(xì)胞膜變薄或斷裂等109。例如，Yang等110發(fā)現(xiàn)碳納米管可以進(jìn)入并聚集在小鼠胚胎干細(xì)胞中導(dǎo)致DNA氧化損傷。Pulskamp等111發(fā)現(xiàn)材料合成過(guò)程中引入的金屬催化顆粒會(huì)殘留在碳納米管中帶來(lái)毒副作用。雖然這些研究顯示了碳納米管對(duì)細(xì)胞存在毒性效應(yīng)，但當(dāng)其被固定在基底或電極上，經(jīng)過(guò)純化或表面功能化修飾處理后，危險(xiǎn)程度比自由活動(dòng)狀態(tài)的碳納米管低112。Hu等113探究了痕量氧化石墨烯對(duì)斑馬魚產(chǎn)生的生物效應(yīng)，結(jié)果表明氧化石墨烯可誘導(dǎo)神經(jīng)功能障礙，子代斑馬魚的多巴胺能神經(jīng)元丟失66-87%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)受損，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào)。石墨烯納米材料產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制目前尚不十分明確，但已有的研究表明產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是其導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要機(jī)制114。Jiang115系統(tǒng)研究了不同硅納米線的細(xì)胞毒性，隨著硅納米線濃度的增加和共孵育時(shí)間的推移，細(xì)胞活性呈明顯下降趨勢(shì)，相同培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞的活性高于正常細(xì)胞，濕法化學(xué)刻蝕法制備的硅納米線的生物相容性優(yōu)于氣-液-固相法制備的硅納米線?？梢娂{米材料的安全性存在爭(zhēng)議，在實(shí)際應(yīng)用中需針對(duì)具體的使用對(duì)象及方式，優(yōu)化材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與合成方法，并對(duì)安全性進(jìn)行充分謹(jǐn)慎的評(píng)估。其次是神經(jīng)元活動(dòng)信號(hào)的采集，如何將電極在不受損的情況下植入腦組織更深的位置、對(duì)跨腦區(qū)的多個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)、降低或消除多種來(lái)源的噪聲等，都是值得研究的課題。最后是納米材料神經(jīng)電極的商業(yè)化開發(fā)。規(guī)模化生產(chǎn)要求反應(yīng)條件盡量溫和，成本消耗較低，合成出的納米材料質(zhì)量均一。因柔性聚合物基底不耐CVD法中的高溫條件，石墨烯往往需要在其他基底上生長(zhǎng)，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這一步容易造成石墨烯出現(xiàn)褶皺和缺陷，限制了石墨烯用于高通量設(shè)備的制造。改良轉(zhuǎn)移操作技術(shù)以保持石墨烯性質(zhì)不變，或讓石墨烯在較低溫度直接生長(zhǎng)在最終所需的基底上，成為打破這項(xiàng)限制的兩個(gè)研究方向116。

一維及二維納米材料可構(gòu)筑性能優(yōu)異、功能多樣的神經(jīng)界面，為新型神經(jīng)電極的構(gòu)想創(chuàng)造了機(jī)遇。在多學(xué)科、跨領(lǐng)域研究人員的通力合作下，將電極作為記錄模塊與光學(xué)成像、電子工程等集成在一起，構(gòu)建閉環(huán)系統(tǒng)按需調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)設(shè)備的微型化、智能化以及多功能化，是未來(lái)神經(jīng)電極發(fā)展的趨勢(shì)。