趙瑤，易華山,3，馬鮮平，李前勇,3，謝遠(yuǎn)兵

（1.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，榮昌 402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，榮昌 402460；3.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，榮昌 402460；4.重慶市永川區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 402160）

藍(lán)舌?。˙luetongue,BT）是藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus, BTV）引起的，以庫蠓為傳播媒介的一種反芻動物非接觸性蟲媒傳染病，其易感動物為綿羊、山羊、牛和鹿等反芻動物，是OIE劃定為A類、我國列為一類的重要動物疫病。藍(lán)舌病于1876年最早發(fā)現(xiàn)于南非，隨后美國、澳大利亞、中國、南美、南歐和地中海、北歐等國家和地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)該病，已成為名副其實的世界性流行蟲媒傳染病[1,2]。目前，BTV已發(fā)現(xiàn)至少有27種不同的血清型[3]，不同血清型之間交叉反應(yīng)很低或無交叉免疫保護(hù)反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，有兩個假定的新型 BTV血清型（BTV-28[4]和BTV-29[5]）。BTV主要經(jīng)媒介昆蟲庫蠓叮咬，雌蠓交配后嗜吸牛、羊血而傳播，因此BT的發(fā)生具有地域性（主要大概率存在于南緯40°與北緯53°之間的廣大區(qū)域）、季節(jié)性（5～10月間）和周期性等特點[6]。BTV感染動物具有高感染率和死亡率的特征，綿羊死亡率最高可達(dá)75%。目前，BT分布于除南極洲外的全球大部分地區(qū)，且近年來逐漸呈現(xiàn)出向高緯度地區(qū)蔓延流行的趨勢。

1 BTV蛋白概述

BTV隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的雙股RNA病毒。BTV基因組全長為19 219bp，由L1、L2、L3、M4、M5、M6、S7、S8、S9和S10等10個大小不同的節(jié)段分別編碼VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP7、NS2、VP6/NS4、NS3/NS3a蛋白[7]；其中位于S9片段上的NS4蛋白是目前認(rèn)為最小的非結(jié)構(gòu)蛋白，由具有高度保守性的77～79個氨基酸殘基組成[8]。BTV的病毒粒子呈圓形二十面體對稱，成熟的病毒粒子無囊膜；BTV完整的病毒粒子由7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP2、VP5、VP3、VP7、VP1、VP4、VP6）及基因組dsRNA組成。結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP7構(gòu)成病毒粒子的外層衣殼和病毒核心顆粒（圖1），其中外層衣殼由VP2及VP5兩種蛋白構(gòu)成；病毒核心顆粒由兩種主要蛋白（VP3、VP7）、三種次要蛋白（VP1、VP4、VP6）及10條分節(jié)段的dsRNA構(gòu)成，其中VP3、VP7構(gòu)成病毒粒子的內(nèi)層衣殼，除去外層衣殼和VP7蛋白層的中間結(jié)構(gòu)構(gòu)成BTV的亞核心顆粒（圖1）[9]。

圖1 BTV粒子結(jié)構(gòu)蛋白和基因組分布示意圖

2 主要結(jié)構(gòu)蛋白

2.1 外層衣殼蛋白

VP2和VP5蛋白以三聚體的形式存在，是構(gòu)成BTV外殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是BTV型特異性抗原。VP2是由L2基因編碼的型特異性蛋白，其蛋白上存在多個能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對BTV中和反應(yīng)的中和表位，是中和抗原和血清型的決定因子[11]。當(dāng)外界環(huán)境因素變化及內(nèi)部宿主免疫反應(yīng)不同時，可導(dǎo)致新的BTV血清型出現(xiàn)[12]。VP2蛋白位于病毒表面，介導(dǎo)病毒與宿主最初接觸，參與BTV的吸附及進(jìn)入[13]。VP5蛋白由M6編碼，是BTV唯一的糖基化蛋白，具有細(xì)胞穿透活性，直接參與膜的穿透過程[14]。當(dāng)BTV暴露于早期內(nèi)吞體（Early endosome，pH6.0-6.5）低pH環(huán)境下，VP5 N端匕首結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)想變化，使其M1-S41基序及WHXL脂質(zhì)作用W411-L414基序與內(nèi)吞體膜發(fā)生膜融合作用，隨著VP2蛋白的完全拆卸、降解，VP5蛋白的匕首（dagger domain）蛋白和伸展結(jié)構(gòu)域（unfurling domains）可實現(xiàn)顯著重折疊[15,16]。VP5蛋白錨定結(jié)構(gòu)域中的β-折疊片（β-meander motif）基序含有組氨酸簇，可感知晚期內(nèi)吞體pH（Late endosome，pH 5.5）以釋放四個假定的膜相互作用蛋白而從晚期內(nèi)吞體內(nèi)釋放，實現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒顆粒進(jìn)入感染細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[9]。

2.2 核心衣殼蛋白

病毒核心顆粒由VP3、VP7、 VP1、VP4、VP6及10條分節(jié)段的dsRNA構(gòu)成。VP7蛋白由S7基因編碼，以三聚體形式存在，在不同BTV血清型中具有高度保守性[17]，含有群特異性抗原決定簇，可用于建立BTV群特異性抗原抗體檢測方法[18]。VP3蛋白由L3基因編碼，以十聚體形式存在。BTV VP3蛋白包裹著3個具有酶催化活性的次要蛋白VP1、VP4和VP6及dsRNA片段，共同構(gòu)成BTV的亞核心顆粒，在維持病毒結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮重要作用。VP1、VP4和VP6蛋白在BTV的病毒顆粒內(nèi)部構(gòu)成病毒三蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（tri-protein transcriptase complex，TC）[9]。VP1蛋白由L1基因編碼，具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，能夠在不依賴于其他蛋白的作用下以ssRNA為模板合成ds RNA。VP4蛋白是一種由M4基因編碼的加帽酶，與其他許多病毒的加帽酶不同的是，BTV VP4具有在轉(zhuǎn)錄物的5'末端產(chǎn)生甲基化帽子結(jié)構(gòu)所需的所有催化活性[19]。VP6蛋白由S9基因編碼，具有ATP依賴的RNA解旋酶活性，對BTV的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄具有重要作用，在RNA包裝中必不可少[20]。VP6蛋白還具有ATP結(jié)合活性，與VP3具有特定的結(jié)合親和力，能夠促進(jìn)病毒的復(fù)制及mRNA的合成[21]。

3 非結(jié)構(gòu)蛋白

BTV侵染宿主細(xì)胞后，經(jīng)過大量擴增，釋放到血液中，經(jīng)血液循環(huán)以感染宿主細(xì)胞[22]。BTV感染宿主細(xì)胞后，在感染的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4 5種非結(jié)構(gòu)蛋白。BTV非結(jié)構(gòu)蛋白雖不參與病毒粒子的組成，但在病毒的復(fù)制、成熟、釋放過程中具有重要作用；并且可用作抗BTV的靶抗原用于鑒別診斷BTV野毒感染與疫苗免疫的動物[22]。

3.1 NS1蛋白

NS1蛋白由M5基因編碼，長度為1 689bp，共編碼552個氨基酸，其蛋白大小為64kDa。在BTV感染細(xì)胞的過程中，NS1蛋白表達(dá)量高，以聚合物形式在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成一種病毒特異性管狀結(jié)構(gòu)（tubular）和一種非管狀結(jié)構(gòu)（non-tubular），促進(jìn)病毒mRNA的復(fù)制及其蛋白的合成[23]。由這種管狀結(jié)構(gòu)形成的蛋白具有高度保守性，目前僅在呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的病毒感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。研究表明，BTV NS1與BTV單鏈RNA的3′端ACUUAC六核苷酸相互作用，保證病毒RNA的優(yōu)先選擇性表達(dá)[24]。反向遺傳學(xué)（RG）研究表明，BTV的NS1、NS2帽狀RNA對促進(jìn)病毒 VP1、VP3、VP4、VP6蛋白的表達(dá)及對BTV病毒的拯救具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，當(dāng)BTV感染宿主細(xì)胞后，NS1蛋白聚集于細(xì)胞中心體區(qū)域，在一定程度上會導(dǎo)致細(xì)胞中心體的破壞，從而影響細(xì)胞正常的有絲分裂[25]。Agüero等在2000年利用BTV-2型NS1基因建立的RTPCR方法檢測感染動物的組織和血液樣本中的BTV，該方法還可用來鑒別診斷BTV-2型野毒感染和商業(yè)疫苗免疫動物[26]。Rojas等為了評估BTV感染過程中T細(xì)胞免疫應(yīng)答，利用BTV-8型NS1蛋白在C57BL/6小鼠中篩選了11個潛在的T細(xì)胞表位，在接種BTV-8的C57BL/6小鼠和綿羊中具有引起特定IFN-γ和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）產(chǎn)生；并進(jìn)一步用IFN-γ ELISPOT分析綿羊BTV-8感染，證明這些T細(xì)胞表位的特征可用來開發(fā)更加廣譜的BTV血清型疫苗，并實現(xiàn)BTV感染動物與疫苗免疫動物的鑒別診斷[27]。

3.2 NS2蛋白

NS2是一種由S8基因編碼的多功能蛋白質(zhì)，編碼357個氨基酸，分子量為42kDa。NS2是BTV感染細(xì)胞期間合成的唯一的以磷酸化形式存在的病毒蛋白，參與受感染細(xì)胞中形成BTV病毒纖維網(wǎng)絡(luò)狀包涵體（Viral inclusion bodies，VIBs）；在BTV復(fù)制的早期階段，NS2促進(jìn)了三種酶蛋白和VP3形成起初的復(fù)制酶復(fù)合物[28]。研究表明，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的NS2蛋白具有結(jié)合核糖核酸的特性，并通過結(jié)合ATP和GTP，可將兩個核苷水解成相應(yīng)的NMPs，NS2對ATP的結(jié)合親和力遠(yuǎn)高于GTP，對ATP水解效率更高；Ca2+、Mg2+和Mn2+可以作為所需的二價陽離子參與水解反應(yīng)[29]。在BTV感染細(xì)胞后，NS2破壞細(xì)胞內(nèi)微管與染色體的相互作用，導(dǎo)致染色體有絲分裂中紡錘體不能正確地與微管對接，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行異常有絲分裂[25]。研究表明，在BTV感染細(xì)胞中NS2主要位于細(xì)胞核附近，經(jīng)細(xì)胞激酶磷酸化后，具有很強的單鏈RNA結(jié)合活性，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)招募BTV基因組mRNA；NS2蛋白對新產(chǎn)生的亞核蛋白（VP1、VP4、VP6和VP3）和10個節(jié)段的RNA轉(zhuǎn)錄物直接募集到VIBs中，并在VIBs中與VP3組裝成亞核心顆粒，然后再獲得VP7蛋白生成穩(wěn)定的病毒核心粒子，但非磷酸化狀態(tài)的NS2則會干擾VIBs的形成而影響病毒粒子的形成[30]。Roy[31]等研究表明，BTV NS2是病毒復(fù)制和組裝的調(diào)節(jié)劑，也是VIB的一個重要組成成分，干擾NS2蛋白則影響VIB的形成而導(dǎo)致病毒釋放量減少。

3.3 NS3/NS3a蛋白

NS3、NS3a蛋白均由BTV基因組中S10基因編碼，是NS3基因產(chǎn)物的兩種形式。NS3a是NS3全長序列的N端截短蛋白，長度分別為26kDa、24kDa，兩種蛋白的氨基酸序列在不同的環(huán)狀病毒屬之間存在較大的差異[32]。NS3/NS3a在哺乳動物細(xì)胞中具有細(xì)胞毒性，在昆蟲細(xì)胞中毒性更強，也能抑制哺乳動物細(xì)胞中病毒誘導(dǎo)的干擾素免疫應(yīng)答[33]。研究表明，NS3/NS3a蛋白是BTV編碼蛋白中唯一具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜糖蛋白，參與BTV感染細(xì)胞中釋放子代病毒顆粒的過程。非洲馬瘟（AHSV）與BTV結(jié)構(gòu)相似，其非結(jié)構(gòu)蛋白NS3/NS3a同樣參與細(xì)胞膜的改變及其病毒粒子釋放，推測BTV NS3/NS3a也通過改變細(xì)胞膜功能來促進(jìn)病毒粒子的釋放[34]。NS3/NS3a在BTV蛋白中具有序列一致性和高度保守性，其在昆蟲細(xì)胞中高度表達(dá)，但在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)量較少或者不表達(dá)[35]。與BTV同屬的茨城病病毒（IBAV）可誘導(dǎo)多種哺乳動物細(xì)胞系的凋亡，而在昆蟲中不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種病毒引起的細(xì)胞凋亡可能與NS3/NS3a表達(dá)有關(guān)，推測BTV也可能有類似的調(diào)節(jié)機制[36]。NS3還可與NS1形成融合蛋白，經(jīng)純化后的NS1-NS3融合蛋白可用于間接ELISA檢測BTV抗體[37]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，NS3在通過ERK1/2的磷酸化水平和翻譯起始因子eIF4E作用下能夠激活MAPK/ERK通路，從而促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制[38]。

3.4 NS4蛋白

Mourad Belhouchet等在S9片段中發(fā)現(xiàn)的一個重疊ORF編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4，長77～79個氨基酸，是最小的非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)NS4蛋白存在2個α-螺旋區(qū)，無跨膜區(qū)，具有亮氨酸拉鏈（bZIP）典型結(jié)構(gòu)；存在典型的核定位信號及具有線粒體亞細(xì)胞定位特征。呂爽等[39]對NS4二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，其N端α-螺旋結(jié)構(gòu)域中具有富含堿性氨基酸的核定位信號（NLS），而C端α-螺旋結(jié)構(gòu)域中具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核輸出信號(NES)。研究表明，在BTV侵染細(xì)胞過程中，NS4蛋白具有核-胞漿穿梭過程[39]。BTV NS4在使用I型干擾素處理的細(xì)胞中具有復(fù)制的優(yōu)勢，表明NS4是一種干擾素拮抗劑。與其他病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白一樣，BTV NS4蛋白可能與JAK1/TYK2相結(jié)合，抑制感染細(xì)胞中IFN-α/β的產(chǎn)生而逃避宿主天然免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)拮抗干擾素介導(dǎo)的天然免疫，逃脫宿主天然免疫應(yīng)答[40]。

4 展望

BTV編碼的7種結(jié)構(gòu)蛋白在BTV基因的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、病毒的吸附、感染宿主細(xì)胞的過程中是必需的，4種非結(jié)構(gòu)蛋白也參與BTV的復(fù)制、組裝及釋放，其中NS1蛋白促進(jìn)病毒RNA的翻譯及調(diào)節(jié)病毒蛋白的合成；NS2蛋白是病毒包涵體的主要組成成分；NS3/NS3a參與BTV感染細(xì)胞中釋放子代病毒顆粒的過程；NS4參與拮抗干擾素介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答。BTV作為一種重要的dsRNA媒介病毒和病毒研究的模型系統(tǒng)已被廣泛研究，對BTV非結(jié)構(gòu)蛋白及其在病毒基因組復(fù)制及其蛋白組裝機制的深入研究，為開發(fā)新的診斷試劑、蛋白質(zhì)和衣殼疫苗以及符合DIVA標(biāo)準(zhǔn)的新型減毒病毒BTV疫苗提供了基礎(chǔ)。