蔣桂娥，趙利梅，楊晨東，瞿長(zhǎng)偉，馬亞賓，李春芳，劉廷玉，周希梅，倪俊卿

（1.河北省畜牧良種工作總站，石家莊 050061；2.紐勤生物科技（上海）有限公司，上海 200000；3.全國(guó)畜牧總站，北京 100125）

眾所周知，牛乳中的乳蛋白主要分為酪蛋白、白蛋白、乳球蛋白和乳鐵蛋白等，含有20多種氨基酸。其中酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式，占總量的80%，可以說(shuō)是一種全價(jià)蛋白。牛奶中的β-酪蛋白以A1和A2兩種基因型存在。A1基因型β-酪蛋白在消化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生β-酪啡肽（BCM-7），而這種肽與人胃腸道不適反應(yīng)有關(guān)。有報(bào)道指出，中國(guó)居民乳糖不耐受主要原因可能是人體對(duì)牛奶中A1基因型β-酪蛋白的不耐受[1]，從而出現(xiàn)一些消化道的不適，比如腹痛、腹脹、惡心、腹瀉和便秘。有研究認(rèn)為，飲用A1基因型牛奶會(huì)提高心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[2]和Ⅰ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3]，原因也是A1基因型牛奶在消化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生β-酪啡肽（BCM-7），且被人體吸收，而A2基因型β-酪蛋白不會(huì)產(chǎn)生BCM-7[4]。所以，飲用A2基因型牛奶可以降低冠心病的發(fā)病率，減少胃腸道炎癥反應(yīng)[5]。也有報(bào)道稱，飲用A2基因型牛奶可以提高機(jī)體免疫力，且對(duì)兒童的認(rèn)知、大腦發(fā)育或大有裨益。

隨著A2牛奶進(jìn)入高端消費(fèi)市場(chǎng)，對(duì)A2型牛奶和牛群的研究日漸增多。本研究通過(guò)全群基因組分型，一是篩選A2純合基因型荷斯坦牛，組建A2純合基因型荷斯坦牛育種群；二是通過(guò)育種技術(shù)與含有A2純合基因型公牛開展有計(jì)劃選配，自主定向培育A2純合基因型奶牛。以此培育A2純合基因型奶牛群，生產(chǎn)更好的優(yōu)質(zhì)牛奶，豐富市場(chǎng)，滿足不同消費(fèi)群體需求，改善居民體質(zhì)，為河北省創(chuàng)造更加優(yōu)質(zhì)牛奶奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自旗幟乳業(yè)有限公司（察北）和樂(lè)源牧業(yè)威縣有限公司（一牧）兩個(gè)大型奶牛場(chǎng)的健康牛群，其三代系譜完整，隨機(jī)抽取健康泌乳牛只11 785頭。

1.2 試驗(yàn)試劑

毛發(fā)DNA試劑盒（NAP44912），購(gòu)自德國(guó)sbeadex TM公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

NanoDrop 8000（型號(hào)：NANODROP 8000），磁珠法自動(dòng)核酸提取儀（型號(hào)：MagMax-KingFisher FLEX），Multifuge X3R-冷凍離心機(jī)，均購(gòu)自ThermoFisher科技公司；渦旋振蕩器（型號(hào)：Vertex Genie 2），購(gòu)自 Scientifuc Industries廠家； Dispense repeater M4-分液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 毛發(fā)樣品的采集

首先使用刷子清理待檢奶牛尾根部的牛毛，去除糞便和污物，使用止血鉗或手拔出一簇牛毛（約80～100根），挑選20～50根毛發(fā)根部帶有白色完整毛囊的牛毛，并在牛毛采集卡上記錄牛號(hào)和采樣日期，打開牛毛收集卡中間層上的透明不干膠帶，將帶有毛囊的牛毛小心放在中間層上，用透明不干膠密封壓緊，并剪去長(zhǎng)于牛毛采集卡的毛發(fā)，存放于塑料自封袋內(nèi)。

2.2 基因型分型檢測(cè)

樣品采集完成后委托紐勤生物科技（上海）有限公司進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用MassARRAY質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)出SNP位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特意延展引物，在SNP位點(diǎn)上延伸一個(gè)堿基。將制備的樣本分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，此時(shí)核酸分子分解吸附為單電荷離子，電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比。通過(guò)檢測(cè)核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣本基因型分型結(jié)果

表1 荷斯坦?；蚍中徒Y(jié)果

表1結(jié)果顯示，在隨機(jī)抽取的試驗(yàn)樣本中，A1純合基因型奶牛1 890頭，占16.13%； A2純合基因型奶牛4 219頭，占36.01%；A1A2雜合基因型奶牛5 607頭，占47.86%。結(jié)果表明，本次試驗(yàn)中A1A2雜合型奶牛占比最高，A2純合基因型次之，占檢測(cè)樣本的三分之一以上，A2型等位基因頻率為59.94%。

3.2 A2A2純合基因型牛群選育技術(shù)研究

目前國(guó)外的一些乳企已經(jīng)開始生產(chǎn)和銷售A2型牛奶，國(guó)內(nèi)君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司、三元乳業(yè)公司也開始生產(chǎn)和銷售A2品牌的乳制品。其奶源均來(lái)自β-酪蛋白A2型牛群。因此，應(yīng)用MassARRAY質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)快速、精準(zhǔn)地對(duì)奶牛基因組分型，是目前篩選A2純合型基因奶牛個(gè)體行之有效的方法之一。針對(duì)篩選出的A2純合型奶牛個(gè)體，與A2純合基因型的公牛計(jì)劃選配，可自主培育A2純合基因型荷斯坦牛育種核心群；對(duì)A1A2雜合基因型奶牛個(gè)體組建單獨(dú)核心群，利用與A2純合基因型的公牛計(jì)劃選配，使A2型基因不斷純合，可達(dá)到擴(kuò)增A2純合基因型育種核心群的目的。同時(shí)，結(jié)合DHI測(cè)定、線性鑒定技術(shù)，可定向培育出高產(chǎn)、A2基因型β-酪蛋白遺傳基礎(chǔ)的種公牛，為河北省乳制品品質(zhì)優(yōu)化奠定種質(zhì)基礎(chǔ)。

4 討論

關(guān)于A2純合基因型奶牛在牛群中所占比例的報(bào)道不一致。在國(guó)內(nèi)A2純合型所占比例也存在差距，山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司檢測(cè)23頭種公牛，A2純合基因型公牛占56.52%，A2型等位基因頻率為72.7%[6]；武澤文等研究結(jié)果表明，寧夏地區(qū)荷斯坦牛A2純合基因型占38.49%，A2型等位基因頻率為62.70%[7]。本次研究結(jié)果表明，在隨機(jī)抽取的11 785份樣本中A2純合基因型奶牛占36.01%，A2型等位基因頻率為59.94%，低于寧夏和山東的研究結(jié)果。但與國(guó)外的研究結(jié)果基本吻合，即在新西蘭、英國(guó)和意大利中部一些牧場(chǎng)A2等位基因頻率的奶牛占牛群比例分別為55%[8]、58%[9]和60.65%[4]，而意大利中部地區(qū)荷斯坦福瑞斯品系A(chǔ)2純合基因型奶牛占36.96%[4]。這可能與篩選的牛群品種、品系、牛群結(jié)構(gòu)和檢測(cè)樣本基數(shù)有直接關(guān)系，也可能與樣本類型和檢測(cè)流程有關(guān)。也有不少學(xué)者的鑒定結(jié)果顯示，不同品種牛的A2基因頻率存在顯著差異，如：水牛A2等位基因的頻率為100%，瘤牛為98.7%，更賽牛為96%～98%，瑞士褐牛為66%～70%，娟珊牛為50%～63%，荷斯坦牛為44%～53%，愛(ài)爾夏牛為40%～49%，丹麥紅牛為23%[10]。

5 小結(jié)

就A2基因型牛奶的特性而言，通過(guò)現(xiàn)代分子生物技術(shù)，找出可用于分子標(biāo)記輔助選擇的關(guān)鍵基因SNPs位點(diǎn)，開展驗(yàn)證性檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析，從而更好地開展A1和A2基因型母牛分型，并利用選育技術(shù)，組建A2純合基因型奶牛核心群，不僅對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究意義深遠(yuǎn)，還對(duì)促進(jìn)奶業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)型升級(jí)，優(yōu)化乳品品質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益作用重大。