姜燁琪，張瑞真，王雅麗，崔璐瑩，王亨，李俊，李建基

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

子宮內(nèi)膜炎的直接病因是病原微生物的感染。細菌是引起子宮內(nèi)膜炎的最重要病原微生物。目前，大腸桿菌是從子宮內(nèi)膜炎患牛子宮分離出的重要細菌之一[1]。核轉(zhuǎn)錄因子-kB（NF-κB）信號通路在炎癥反應和先天免疫中具有重要作用。為了探索大腸桿菌對子宮內(nèi)膜細胞的致病作用是否與激活此信號通路有關(guān)這一問題，本研究設計了體外試驗，采用106CFU/mL大腸桿菌處理原代培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞，并檢測其NF-κB信號通路的磷酸化情況，以研究大腸桿菌對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛子宮組織

自揚州某屠宰場，無菌采集未孕的健康奶牛子宮組織。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、106CFU/mL大腸桿菌；無內(nèi)毒素胎牛血清（四季青生物科技公司）；蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；BCA法蛋白濃度測試試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗鼠Phospho-NF-κB p65，Phospho-IκB-α、β-actin一抗（CTS，美國）；山羊抗兔二抗（CST，美國）。儀器：PVDF膜（Millipore，美國）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）；蛋白電泳系統(tǒng)（BIO-BAD公司，美國）等。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng)與細胞傳代

將無菌采集的奶牛子宮組織送回實驗室。在超凈工作臺內(nèi)將子宮角剪成3～4cm的小段，用提前預冷的含有5%雙抗的PBS反復沖洗3次，直到洗出澄清液體，于4℃靜置30min，然后將子宮角縱向剖開，修剪為約3×3cm2的小塊，放入含0.1%鏈蛋白酶的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，完全浸沒子宮角組織，于4℃消化16～20h。取出子宮角，用滅菌手術(shù)刀輕輕刮取子宮角內(nèi)膜，放置于PBS中重懸，1 200r/min離心5min，棄去上清液，再加PBS重懸，離心，重復3次。然后加入含15% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液，于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換一次細胞培養(yǎng)液，3～4d可獲得原代細胞。采用胰蛋白酶消化法進行上皮細胞傳代培養(yǎng)，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每天更換一次細胞培養(yǎng)液，約3d即可獲得傳代培養(yǎng)細胞[2]。

1.2.2 Western blot 法檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的表達量

將細胞按106cells/孔濃度接種到六孔細胞板內(nèi)，待80%以上細胞匯合后用PBS清洗，更換含大腸桿菌（106CFU/mL）的基礎培養(yǎng)基分別處理0、15、30、45、60、90min，收集細胞。將細胞加入適量的細胞裂解液提取總蛋白。每組統(tǒng)一上樣5μg/孔，將蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳1.5h。然后將所需蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂乳封閉1h。使用1∶1 000稀釋的β-actin一抗孵育PVDF膜，4℃過夜。清洗后，將PVDF移到含有兔抗鼠HRP偶聯(lián)IgG二抗的封閉液中（1∶10 000 稀釋），室溫孵育1h。使用DAB顯色試劑盒顯影，并用化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，根據(jù)得到的圖像數(shù)據(jù)對試驗結(jié)果進行分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA和Duncan法進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均值±標準誤表示。P〈0.05表示差異顯著，P〈0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞經(jīng)大腸桿菌（106CFU/mL）的基礎培養(yǎng)基處理不同時間（0、15、30、45、60、90min），用Western blot法檢測P65、IκB-α和p-P65、p-IκB-α蛋白的表達水平。結(jié)果如圖1所示。與空白對照組相比，在經(jīng)大腸桿菌（106CFU/mL）的基礎培養(yǎng)基處理30min時，p-P65蛋白表達量顯著升高，其他時間點的p-P65蛋白表達量沒有顯著變化。在經(jīng)大腸桿菌（106CFU/mL）的基礎培養(yǎng)基處理15min和30min時，p-IκB-α蛋白表達量顯著升高，其他時間點的p-IκB-α蛋白表達量沒有顯著變化。

圖1 大腸桿菌處理不同時間點對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞p65和I κB-α蛋白表達的影響

3 討論

大腸桿菌是奶牛腸道內(nèi)正常菌群成員之一，在幼畜出生后數(shù)小時即可經(jīng)口進入消化道后段并在消化道大量繁殖而定居，終生伴隨。該菌在奶牛腸道內(nèi)，大多數(shù)條件下是不致病的共棲菌，在特定條件下移位入侵腸外組織或器官可致病[3]。在正常情況下，哺乳動物子宮是一種無菌環(huán)境，但在交配或分娩期間通常容易被大腸桿菌等病原菌感染[4,5]。病原菌侵入子宮后，黏附并侵入子宮內(nèi)膜組織中，子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞通過先天免疫受體（如TLRs）感知病原體和損傷相關(guān)分子（PAMPs），誘導炎癥介質(zhì)的大量分泌，并促進中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤[6,7]。奶牛子宮在交配、分娩和產(chǎn)后恢復期間易受細菌感染[8～10]，而感染細菌后，25%～30%奶牛的子宮會出現(xiàn)持續(xù)的炎癥反應，并最終導致不孕[11,12]。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在奶牛子宮受細菌感染后能參與轉(zhuǎn)錄各種與炎癥和免疫反應有關(guān)的基因[13]。所以，本研究將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞經(jīng)大腸桿菌（106CFU/mL）處理不同時間（0、15、30、45、60、90min），模擬奶牛子宮內(nèi)膜受到大腸桿菌侵染的過程，研究大腸桿菌對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞NF-κB信號通路的影響，以探究大腸桿菌對奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病機理[14]。

本試驗通過Western blot法檢測P65、IκB-α和p-P65、p-IκB-α蛋白的表達水平，結(jié)果提示大腸桿菌（106CFU/mL）培養(yǎng)一定時間可顯著提高p-P65蛋白和p-IκB-α蛋白表達量，促進NF-κB信號通路的激活。研究證實，大腸桿菌通過激活NF-κB信號通路引起奶牛子宮內(nèi)膜炎癥損傷，因此，抑制NF-κB信號傳導通路可能成為治療大腸桿菌引起的奶牛子宮內(nèi)膜炎的有效途徑[15～17]。