陳棟，彭小媚，林永恩，陳善昌

(廣西賀州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 賀州)

0 引言

地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)地貧)疾病分為輸血依賴(lài)型地中海貧血和非輸血依賴(lài)型地中海貧血。該分類(lèi)基于患者的臨床嚴(yán)重程度，確定他們是否確實(shí)需要定期輸血才能生存。地中海貧血的兩個(gè)主要類(lèi)別是α 和β 地中海貧血，然后將其分為其他子類(lèi)別，這取決于珠蛋白鏈的缺陷和潛在的分子缺陷，目前尚無(wú)有效的治療方法。地貧最常見(jiàn)于東南亞和南亞，中東，然而，鑒于持續(xù)的遷徙，地貧現(xiàn)在在北歐和北美也變得越來(lái)越普遍。就我國(guó)患病情況來(lái)看，地貧在廣東、廣西、四川多見(jiàn)，長(zhǎng)江以南各省區(qū)有散發(fā)病例，北方則少見(jiàn)。

因此，使用準(zhǔn)確、高效、適用的地貧篩查和診斷方法，將有利于臨床對(duì)該病的診斷和適當(dāng)治療，并且還能引導(dǎo)患者進(jìn)行婚前檢查及后面的產(chǎn)前診斷，避免重癥地貧患兒的出生，起到預(yù)防及優(yōu)生優(yōu)育的作用，對(duì)社會(huì)人口健康發(fā)展有著重要指導(dǎo)意義。目前實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要包括地貧的篩查方法和基因診斷技術(shù)。正確的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對(duì)于鑒別不同形式表征的地貧至關(guān)重要，對(duì)預(yù)防，診斷和治療具有重要意義。本文就地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 地中海貧血篩查方法

1.1 血紅蛋白電泳技術(shù)

血紅蛋白是由兩對(duì)多肽鏈組成，每一條鏈含有血紅素和絡(luò)合鐵原子的卟啉，血紅蛋白的蛋白稱(chēng)為珠蛋白。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)，分子特性不同是由于其肽鏈氨基酸順序和性狀改變?cè)斐伞Ｑt蛋白(Hb)電泳是最常用的評(píng)估方法。不同的血紅蛋白(例如HbA，HbA2 和HbS)具有不同的電荷，這使它們通過(guò)電場(chǎng)在凝膠中以不同的速度運(yùn)動(dòng)。Hb 蛋白中的畸變會(huì)改變其電荷，這可以通過(guò)其在凝膠中遷移速度的變化來(lái)識(shí)別。在堿性條件下，以瓊脂糖凝膠電泳方式進(jìn)行，電泳待凝膠干燥后，肉眼可直接判斷條帶有無(wú)異常。運(yùn)用掃描儀檢測(cè)可準(zhǔn)確定量分析電泳條帶的異常情況。有報(bào)道稱(chēng)，當(dāng)血紅蛋白HbA2＜2.5%時(shí)，則高度懷疑是α 地貧基因攜帶者，如果發(fā)現(xiàn)了HbH 包涵體，則為中間型α 地貧。其余類(lèi)型增多則無(wú)法直接判斷，但可作為β 地貧的排除性診斷[1]。

1.2 血液學(xué)檢查

地貧作為隱性疾病，通過(guò)血液學(xué)檢查來(lái)識(shí)別地貧的攜帶者是必不可少的。α 或β 地中海貧血攜帶者( 雜合子) 均表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血，紅細(xì)胞形態(tài)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有助于將地中海貧血患者與其他血液病患者區(qū)分開(kāi)來(lái)，而最常見(jiàn)的缺鐵性貧血是最需要鑒別診斷以排除的[2]。在測(cè)定鐵蛋白或原卟啉鋅之后，調(diào)查家族史可能為地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷提供有用的信息[3]。血液學(xué)參數(shù)包括血紅蛋白含量、平均血紅蛋白含量、紅細(xì)胞體積分布寬度、平均紅細(xì)胞體積及平均血紅蛋白濃度等。每當(dāng)檢測(cè)到缺鐵時(shí)，在明確診斷之前，必須先補(bǔ)充鐵后再重復(fù)血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)。在大多數(shù)地中海貧血攜帶者中都可以檢測(cè)到紅細(xì)胞的形態(tài)變化：最典型的變化是小紅細(xì)胞增多癥，色素減退和異紅細(xì)胞增多癥(紅細(xì)胞大小和形狀的變化)。

1.3 高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜技術(shù)(HPLC)是采用分離率高的離子交換層析法進(jìn)行自動(dòng)快速血紅蛋白分析的。最近，陽(yáng)離子交換高效液相色譜已成為檢測(cè)許多Hb 亞型的流行方法，是一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性高的電泳替代方法，故HPLC 被國(guó)際地貧協(xié)會(huì)推薦作為β 地貧常規(guī)篩查方法。其檢測(cè)結(jié)果可對(duì)血紅蛋白組分中的HbA2，HbF 準(zhǔn)確定量，同時(shí)還能檢測(cè)到HbBart’s，HbH，提示患者有α 地貧，對(duì)β 地貧也可以作出準(zhǔn)確的診斷。HPLC 同時(shí)還可對(duì)地貧基因無(wú)法查出的多種異常血紅蛋白病作出診斷。

然而，盡管地貧的高效液相色譜技術(shù)有逐漸被基因診斷所替代的趨勢(shì)，但在實(shí)驗(yàn)室條件缺乏、非典型突變或是復(fù)雜類(lèi)型的地貧患兒的診斷中，高效液相色譜技術(shù)對(duì)地貧的診斷依然具有非常重要的地位[4]。

2 地中海貧血的基因診斷技術(shù)

依據(jù)分子生物學(xué)基礎(chǔ)的基因診斷技術(shù)，正在臨床被廣泛地應(yīng)用。研究表明約5% 的β 地貧及約95% 的α 地貧是由于基因缺失引起的。DNA 分子診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于地中海貧血。當(dāng)前，有許多不同的基于PCR 的技術(shù)可用于診斷已知的珠蛋白基因突變，以及用于鑒定未知突變的其他方法。傳統(tǒng)的印記雜交技術(shù)，是用顯影技術(shù)顯示不同的DNA 位置及其含量大小，從而判斷基因片段的缺失與否，可作為α 地貧基因缺失型診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。但由于操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)已逐漸被取代。目前地貧檢測(cè)最常用的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[6]。

2.1 以PCR 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)

2.1.1 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)

反向斑點(diǎn)印跡技術(shù)已被廣泛使用，其中擴(kuò)增的DNA 與固定在尼龍條上的一組突變特異性探針雜交，通過(guò)分子雜交及顯色反應(yīng)，觀察膜條信號(hào)的有無(wú)，判斷探針與產(chǎn)物的雜交與否，從而確定待檢樣本的基因型。對(duì)于β 地中海貧血突變，反向斑點(diǎn)印跡技術(shù)更是在臨床被廣泛使用。

2.1.2 裂隙聚合酶鏈反應(yīng)

裂隙聚合酶鏈反應(yīng)(gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于α 地貧的檢測(cè)，其特點(diǎn)是高特異性和高靈敏度，在大樣本、多突變位點(diǎn)篩查上比傳統(tǒng)非均一性方法更方便、性?xún)r(jià)比更高，相比定量探針?lè)ㄍ蛔兎治龊推渌?lèi)型快速突變分析法，應(yīng)用面更廣，成本更低[7]，其原理是兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用引物間距過(guò)遠(yuǎn)，超出有效擴(kuò)增范圍而不能生成擴(kuò)增產(chǎn)物。大片段缺失的存在會(huì)使斷端連接，上下游引物靠近，生成特定擴(kuò)增產(chǎn)物[8]。由于α珠蛋白基因簇內(nèi)的序列同源性很高，因此α 珠蛋白基因簇中的序列擴(kuò)增比β 珠蛋白基因簇中的擴(kuò)增困難。α 地中海貧血主要是由于不同長(zhǎng)度的缺失所致，可以通過(guò)Gap-PCR 優(yōu)先檢測(cè)。已經(jīng)公開(kāi)了引物序列以診斷幾種α+或α°[9-11]，近年來(lái)該檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床。歐陽(yáng)紅梅等[12]對(duì)云南少數(shù)民族地區(qū)新生兒α 地貧基因，以Gap-PCR、熒光定量PCR 熔解曲線法檢測(cè)，攜帶率為9.0%。唐笑等人[13]對(duì)湖南地區(qū)的7914 例樣本采用Gap-PCR 法進(jìn)行α 地貧基因缺失檢測(cè)，檢出率為17.44%。戴慶福等[14]對(duì)7823 例血常規(guī)指標(biāo)異常的病人采用Gap-PCR 檢測(cè)3 種缺失型α 地貧，攜帶率為15.66%。Gilad 等[15]也選擇Gap-PCR 檢測(cè)常見(jiàn)的缺失型α 地貧，該方法具有較高的檢出率，對(duì)臨床診斷意義重大，被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用檢測(cè)。Gap-PCR 法還能診斷β 地貧大片段基因的缺失。已知有200 多種β 地貧突變，其中大多數(shù)是單核苷酸取代，插入或短缺失，大多數(shù)可以通過(guò)Gap-PCR 診斷出來(lái)[16]。然而，Gap-PCR 的結(jié)果判讀需電泳，易造成污染，且繁瑣，不適于檢測(cè)大量樣本[17]。

2.2 基因芯片技術(shù)

地中海貧血基因診斷芯片是一種基于芯片檢測(cè)地貧基因突變的新技術(shù)，它能同時(shí)檢測(cè)α 與β 地貧基因突變類(lèi)型?；蛐酒捎梦⒘奎c(diǎn)樣或是光導(dǎo)原位合成等方法，將生物分子作為探針固定于支持物表面，然后與已標(biāo)記的待測(cè)分子進(jìn)行雜交，通過(guò)激光共聚焦掃描對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)該分子的數(shù)量和性質(zhì)進(jìn)行分析。該技術(shù)能準(zhǔn)確快速地從分子水平診斷該疾病，在地貧的基因診斷方面應(yīng)用前景廣闊。地中海貧血基因芯片診斷體系，DNA 測(cè)序的改進(jìn)和成本的降低使得基因芯片在許多實(shí)驗(yàn)室中得到了最廣泛的應(yīng)用，僅用病人一點(diǎn)血液標(biāo)本，就可以分析出基因的確切核苷酸序列或所評(píng)估的基因區(qū)域，可以準(zhǔn)確判斷病人是否攜帶地貧致病基因，準(zhǔn)確快速地對(duì)中國(guó)人常見(jiàn)的8 種地貧突變進(jìn)行分子學(xué)診斷。

2.3 多重連續(xù)探針擴(kuò)增技術(shù)

多重連續(xù)探針擴(kuò)增技術(shù)是依賴(lài)探針來(lái)進(jìn)行的擴(kuò)增技術(shù)，可檢測(cè)約50 個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異[18]。其原理是把目的基因復(fù)制到探針上，再用引物擴(kuò)增捕獲片段，再對(duì)片段進(jìn)行電泳分析得出結(jié)果。引入多重連續(xù)依賴(lài)性探針擴(kuò)增，由于它的靈敏性和可靠性，現(xiàn)在可以使用該方法代替Southern 印跡，而無(wú)需使用放射性檢測(cè)[19]。

2.4 高通量測(cè)序

在Sanger 測(cè)序時(shí)代之后，下一代測(cè)序(NGS)代表了測(cè)序技術(shù)的新原理。一次分析即可將測(cè)序能力從幾百個(gè)堿基對(duì)增加到幾千個(gè)。NGS 基于克隆擴(kuò)增的DNA 分子的大規(guī)模并行測(cè)序，再加上足夠的計(jì)算能力和用于高效數(shù)據(jù)分析的適當(dāng)軟件，已將遺傳學(xué)診斷以可承受的價(jià)格引入了臨床實(shí)踐[20]。它可以應(yīng)用于整個(gè)基因組，整個(gè)外顯子組和到基因組的特定目標(biāo)區(qū)域。目前，在文獻(xiàn)中，沒(méi)有關(guān)于用這種方法對(duì)球蛋白基因進(jìn)行測(cè)序的數(shù)據(jù)。只有一個(gè)商業(yè)測(cè)序小組可用，報(bào)告包括HbB 和HbA1 基因。

NGS 的最關(guān)鍵步驟是用于DNA 捕獲的探針集的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：α和β 簇中基因之間的高度同源性使NGS 治療地中海貧血的方法非常困難，耗時(shí)且昂貴，NGS 的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是，它可用于檢測(cè)單核苷酸取代，插入或小缺失，但對(duì)于其他類(lèi)型的基因組變異而言卻不那么準(zhǔn)確。盡管現(xiàn)在生物信息學(xué)的研究也正在研究用于檢查是否存在復(fù)雜的重排的工具，但現(xiàn)在遺漏了大的缺失或三聯(lián)，尤其是在α 地中海貧血的情況下，這使整個(gè)過(guò)程完全無(wú)用。

總之，重要的是要強(qiáng)調(diào)，不需要DNA 分析球蛋白基因突變即可診斷大多數(shù)攜帶者狀態(tài)。建議了解TDT 的診斷，了解父母突變，以及在NTDT 病例中，不同球蛋白基因缺陷的共存性可能導(dǎo)致不同的表型表達(dá)。

由于存在輕度突變或α 和β 地貧相互作用，即使通過(guò)家庭血液學(xué)評(píng)估，有些病例在血液學(xué)和臨床上也難以診斷；因此，在這種情況下，在開(kāi)始治療之前進(jìn)行分子分析很方便。

絨毛膜絨毛DNA 的分析是產(chǎn)前診斷的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施和專(zhuān)業(yè)知識(shí)，所使用的方法與突變檢測(cè)的方法相同。產(chǎn)前診斷的必要步驟是切除任何母體組織，因?yàn)槟阁w殘留組織的存在可能會(huì)導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤。為了排除母體污染，通過(guò)PCR 檢測(cè)胎兒和父母DNA 樣品中的短串聯(lián)重復(fù)序列或可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列是必不可少的[21]。

3 小結(jié)

地中海貧血是最常見(jiàn)的隱形遺傳病，目前無(wú)有效的治療方法，大部分靠輸血為生，不僅加重患者的家庭負(fù)擔(dān)，還影響人類(lèi)素質(zhì)的優(yōu)生優(yōu)育。不過(guò)有報(bào)道稱(chēng)，目前造血干細(xì)胞移植(HSCT)仍是該疾病的唯一綜合治療方法，在重型地中海貧血中，與HLA 匹配的家庭供體仍被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)的造血干細(xì)胞移植(HSCT)，在骨髓或臍帶血移植后均取得了優(yōu)異的效果[22]。但費(fèi)用昂貴，且難找到匹配的供體，不是一般家庭所能承受的。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)地貧比較常見(jiàn)的技術(shù)是血紅蛋白電泳，Gap-PCR 和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，但不管是哪一種方法，都有它的局限性，存在漏檢等，影響檢出率。而多重連續(xù)探針擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序等技術(shù)成本較高，不適于大規(guī)模樣本，但隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步在不斷的完善當(dāng)中，相信這些技術(shù)能發(fā)展的更好，同時(shí)我相信不久的將來(lái)會(huì)有更好的地貧檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)，從而更好的服務(wù)患者，造福人類(lèi)。