史慶豐，黃英男，孫 偉，崔揚(yáng)文，胡必杰,，高曉東

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 1. 感染管理科； 2. 感染科，上海 200032)

肺炎克雷伯菌是一種可以導(dǎo)致社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染的常見致病菌，可無癥狀定植于正常人群呼吸道和腸道，并可廣泛分布于水生環(huán)境中，尤其以醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit, ICU)分離和報(bào)道最為多見[1]。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，我國(guó)住院患者送檢標(biāo)本中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的分離率呈上升趨勢(shì)[2]，其感染可造成26%～44%的歸因死亡[3]。ICU環(huán)境物體表面以及診療設(shè)備作為醫(yī)務(wù)人員手最頻繁接觸的地方，也是多重耐藥菌最容易定植和傳播的關(guān)鍵場(chǎng)所。本次研究對(duì)某綜合醫(yī)院多個(gè)外科ICU進(jìn)行環(huán)境采樣，分析ICU CRKP污染現(xiàn)狀并初步探討其環(huán)境流行的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基(江蘇科馬嘉微生物技術(shù)有限公司)，滅菌棉簽，無菌PBS緩沖液，MALDI-TOF質(zhì)譜儀，PCR Master Mix試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，D2000 DNA marker(北京天根生化科技有限公司)，PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.2 采樣地點(diǎn) 選取某三級(jí)綜合醫(yī)院5個(gè)外科ICU(急診ICU、心外ICU、肝外ICU、大外科ICU、外科ICU A)進(jìn)行環(huán)境采樣，所有ICU采樣點(diǎn)均在近期檢出過CRKP患者的病床周圍。采樣前未通知相關(guān)科室，采樣時(shí)間為工作日10:00左右，所采病區(qū)均已完成當(dāng)日常規(guī)環(huán)境清潔消毒。

1.3 采樣方法 使用浸有PBS的無菌棉簽，對(duì)以下地點(diǎn)進(jìn)行采樣：①選取床欄、呼吸機(jī)面板、聽診器、枕頭等醫(yī)務(wù)人員床旁高頻接觸的物體表面；②治療桌表面、手持機(jī)表面，病房公用電腦鍵盤、藥品存儲(chǔ)柜的把手、治療車把手；③選取洗手池壁、排水孔，治療室洗手池壁、排水孔，污物間拖把清洗池壁、排水孔，污物排放池壁、排水孔；④護(hù)理CRKP定植/感染患者的護(hù)工工作服領(lǐng)口、袖口、口袋口等。按照《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[4]要求進(jìn)行采樣：規(guī)則或平整表面使用棉簽采集面積5 cm×5 cm的區(qū)域，不規(guī)則或不平整的物體表面使用無菌棉簽直接涂抹采樣。將采樣好的棉拭子放置于含有中和劑的試管中保存并轉(zhuǎn)移。將已采樣的棉拭子在mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基平血上反復(fù)均勻涂抹5次將平血置37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

1.4 碳青霉烯酶鑒定 根據(jù)顯色培養(yǎng)基說明書，挑取金屬藍(lán)色、深藍(lán)色的細(xì)菌菌落使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。使用雙紙片協(xié)同法聯(lián)合EDTA-Na2對(duì)過夜培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行碳青霉烯酶表型鑒定。

1.5 DNA提取 使用接種環(huán)挑取碳青霉烯酶表型陽(yáng)性的4～5個(gè)純菌落轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，加入1 mL無菌雙蒸水，震蕩混勻后懸于100℃加熱儀中裂解30 min。取出離心管，13 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于新EP管中，作為PCR試驗(yàn)細(xì)菌DNA模板。

1.6 產(chǎn)碳青霉烯酶基因的檢測(cè) KPC和NDM引物序列見表1[5]，由上海生工生物技術(shù)公司合成。選用含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1705作為KPC陽(yáng)性對(duì)照，不含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1706作為陰性對(duì)照。臨床分離且NDM耐藥基因陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌株作為NDM陽(yáng)性對(duì)照，臨床分離且NDM鑒定陰性的肺炎克雷伯菌株作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系上下游引物各1 μL，DNA模版2 μL，雙蒸水21 μL。擴(kuò)增條件均為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72℃循環(huán)10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電泳30 min后在凝膠成像系統(tǒng)上閱讀結(jié)果。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因引物序列和產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 采樣結(jié)果

2.1.1 床旁高頻接觸物表采樣結(jié)果 床旁共計(jì)采樣73份，其中床欄27份，聽診器9份，呼吸機(jī)面板28份，枕頭9份。心外ICU床欄處分離1株CRKP，其余采樣點(diǎn)均未分離到CRKP菌株。見表2。

表2 床旁高頻接觸物體表面CRKP檢出情況(陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)/采樣標(biāo)本數(shù))

2.1.2 公共區(qū)域采樣結(jié)果 公共區(qū)域共計(jì)采樣89份，其中治療桌33份，手持機(jī)29份，電腦鍵盤11份，儲(chǔ)物柜把手9份，治療車把手7分。外科ICU A某床手持機(jī)分離到1株CRKP，其余采樣點(diǎn)未分離到CRKP。見表3。

表3 公共區(qū)域環(huán)境CRKP檢出情況(陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)/采樣標(biāo)本數(shù))

2.1.3 水池采樣結(jié)果 ICU水池共計(jì)采樣59份，其中30份分離出CRKP。主要分離于洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔。見表4。

表4 ICU水池CRKP檢出情況(陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)/采樣標(biāo)本數(shù))

2.1.4 護(hù)工衣物采樣結(jié)果 對(duì)CRKP定植/感染患者護(hù)理的8名護(hù)工進(jìn)行采樣，1名肝外ICU護(hù)工袖口處分離到CRKP，其余采樣點(diǎn)未分離到CRKP。見表5。

表5 護(hù)工衣物CRKP檢出情況(陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)/采樣標(biāo)本數(shù))

2.2 碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果 碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果顯示，28株CRKP中5株產(chǎn)A類酶，11株產(chǎn)B類金屬酶。見表6。其中心外ICU床欄分離的1株CRKP以及水池孔分離的2株CRKP同時(shí)產(chǎn)A類酶和B類酶。

表6 28株CRKP碳青霉烯酶表型鑒定結(jié)果

2.3 碳青霉烯酶耐藥基因鑒定結(jié)果 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，2株CRKP攜帶KPC型耐藥基因，3株CRKP攜帶NDM型耐藥基因。其中心外ICU床欄分離的CRKP同時(shí)攜帶KPC和NDM耐藥基因。見圖1。

注：M為DL 2000 DNA Marker; Marker左側(cè)為KPC耐藥基因PCR結(jié)果，其中1泳道標(biāo)本來自心外ICU床欄分離標(biāo)本，2泳道標(biāo)本來自肝外ICU護(hù)工袖口，3～5號(hào)來自水池孔標(biāo)本，6號(hào)為KPC陰性對(duì)照(肺炎克雷伯菌ATCC 1706)，7號(hào)為KPC陽(yáng)性對(duì)照(肺炎克雷伯菌ATCC 1705)。Marker右側(cè)號(hào)為NDM耐藥基因PCR結(jié)果，其中1號(hào)泳道標(biāo)本來自心外ICU床欄分離標(biāo)本，5號(hào)標(biāo)本分離自外科ICU A手持機(jī)，12號(hào)為NDM陰性對(duì)照，13號(hào)為NDM陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本，剩余樣本分離自ICU洗手池。

3 討論

近年來，CRKP呈現(xiàn)全球廣泛流行的趨勢(shì)，正常人可通過食物攝取使其在胃腸道無癥狀定植[6-8]。國(guó)外研究已證實(shí)，50%耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteria，CRE)定植患者可在住院30 d內(nèi)發(fā)展為CRE感染，其感染風(fēng)險(xiǎn)是非定植患者的10.8倍。然而同源分析顯示，其中僅1例患者的腸道定植菌與感染菌同種同源，提示醫(yī)務(wù)人員和ICU周邊環(huán)境在CRE傳播中起到關(guān)鍵作用[9]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究指出，CRKP在ICU暴發(fā)或流行期間，加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生、環(huán)境清潔和消毒以及進(jìn)行隔離可有效降低相關(guān)感染的發(fā)生[10-11]，但研究多聚焦于醫(yī)院感染預(yù)防措施和臨床結(jié)局，對(duì)相關(guān)環(huán)境污染的調(diào)查較為少見。盡管國(guó)內(nèi)相關(guān)規(guī)范和醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)操作流程已對(duì)環(huán)境清潔和消毒的頻次、消毒劑的濃度以及擦拭順序進(jìn)行了詳盡的指導(dǎo)，但仍無法杜絕CRKP在ICU的流行，提示日常環(huán)境清潔和消毒可能存在盲點(diǎn)。

本研究使用mSuper CARBA顯色培養(yǎng)基進(jìn)行環(huán)境CRKP篩查，該培養(yǎng)基含有碳青霉烯類抗生素，可有效抑制對(duì)β-內(nèi)酰胺酶敏感，產(chǎn)ESBLs、Ampc酶細(xì)菌的生長(zhǎng)，CRKP菌株在接種24 h后會(huì)顯示金屬藍(lán)色或深藍(lán)色。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定后，可較為準(zhǔn)確識(shí)別環(huán)境中的CRKP。本次采樣未能在CRKP患者床單元的高頻接觸物體表面，如床欄、呼吸機(jī)面板、聽診器、患者使用的枕頭分離到CRKP，同時(shí)公共區(qū)域內(nèi)的高頻接觸物體表面，如治療桌面、手持機(jī)、電腦鍵盤、存儲(chǔ)柜把手以及治療車把手上也未能分離到CRKP，與廖睿純等[12]的研究結(jié)論類似，可能與本次采樣前各ICU病區(qū)已完成常規(guī)環(huán)境清潔和消毒，且工勤人員執(zhí)行情況較好有關(guān)。

研究證實(shí)水龍頭可被大量奧斯陸莫拉菌污染，并伴隨噴濺的水污染周圍直徑約70 cm的區(qū)域[13]。水龍頭水直接流向水槽排水管或水槽內(nèi)表面的沖擊力會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌擴(kuò)散，對(duì)水龍頭上方10 cm處的空氣采樣發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌，達(dá)439 CFU/m3，或成為ICU潛在致病源[14]。水槽的深度可能是細(xì)菌傳播的關(guān)鍵因素，水槽深度>19 cm時(shí)細(xì)菌噴濺污染概率將大大增高[15]。本次采樣的5個(gè)洗手池與患者病床存在2～5 m的物理間距，但CRKP仍在洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔大量定植。ICU洗手池除進(jìn)行手衛(wèi)生外，偶爾還存在傾倒患者體液，沖洗患者使用過的儀器或器具等不當(dāng)行為，可能是多重耐藥菌在水槽中廣泛定植的主要原因。盡管近5年的醫(yī)院監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，5個(gè)外科ICU未曾發(fā)生CRKP感染暴發(fā)事件，但有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，由水槽所引起的CRE感染暴發(fā)平均持續(xù)時(shí)間為37個(gè)月，病例之間平均間隔可長(zhǎng)達(dá)10.2個(gè)月，引起暴發(fā)的水槽存在清潔和消毒困難等問題[16]，更換水槽或管道后暴發(fā)終止[17-19]，給醫(yī)院感染的識(shí)別帶來巨大的挑戰(zhàn)。

產(chǎn)KPC酶和/或產(chǎn)NDM酶是我國(guó)25省市CRKP臨床分離株的主要耐藥機(jī)制，且2個(gè)耐藥基因攜帶率分別高達(dá)74%和17%，部分菌株同時(shí)攜帶有2種耐藥基因[20]。本研究結(jié)果顯示，水池分離的CRKP和高頻接觸的環(huán)境表面分離的CRKP菌株特征差異較大。研究[21]顯示，ICU管道污水和外部檢修孔采集的所有標(biāo)本均含有產(chǎn)碳青霉烯酶的微生物，雖然環(huán)境中采集到的CRE與患者標(biāo)本中采集的CRE在細(xì)菌種屬類別和藥物敏感性上均存在差異，但兩者存在密切的質(zhì)粒交換，考慮可能CRE主要在排水管中發(fā)生接合和重組，繼而通過環(huán)境清潔和醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生等行為導(dǎo)致住院患者發(fā)生感染，所以仍值得警惕和進(jìn)一步研究。

本研究存在以下的局限：①未能對(duì)ICU所有可能污染的區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)期的、系統(tǒng)的采樣，對(duì)了解CRKP環(huán)境動(dòng)態(tài)分布和傳播存在一定盲點(diǎn)；②僅重點(diǎn)關(guān)注CRKP的環(huán)境污染現(xiàn)狀，對(duì)醫(yī)務(wù)人員的手、衣物以及個(gè)人用品未進(jìn)行采樣分析，對(duì)醫(yī)務(wù)人員在CRKP傳播中的媒介作用未能很好的分析；③受限于研究經(jīng)費(fèi)和時(shí)間的影響，本研究尚未完成環(huán)境與臨床分離CRKP的同源性鑒定，因而未能明確護(hù)工袖口處分離的CRKP是否來源于所護(hù)理的患者，無法推測(cè)CRKP感染路徑。