歐陽鵬文，姜 斌，蔡 亮，王 娟，彭 娜，陶 寅，鄭淑娟，謝良伊

[1. 湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學附屬第一醫(yī)院)檢驗科，湖南 長沙 410005； 2. 湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗室，湖南 長沙 410005； 3. 湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學附屬第一醫(yī)院)呼吸內科，湖南 長沙 410005]

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HvKP)是肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)高毒力變種，有別于引起機會性感染的經典KP(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)，可引起既往體健和年輕者嚴重的社區(qū)獲得性感染，如肝膿腫、肺炎、腦膜炎和眼內炎等[1-2]。自發(fā)現(xiàn)以來，HvKP的分子特征及毒力作用機制一直被廣泛研究，但目前為止仍缺乏嚴格定義。HvKP毒力因子主要位于一些毒力質粒(如pLVPK)和可移動的遺傳原件[3-4]，莢膜多糖產生的上調(rmpA和/或rmpA2介導)和鐵載體系統(tǒng)的過表達(如salmochelin 和 aerobactin)對HvKP的高毒力有著重要貢獻[5]。迄今為止，HvKP莢膜血清型大多數(shù)為K1或K2[6-7]，分布于一些特定的克隆譜系中，如ST23[2，8]。HvKP在全球的流行具有顯著的地域特征，主要分布于亞洲，特別是中國[9]。近年來，對于耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae， CR-HvKP)的報道不斷增加，且這些CR-HvKP以產KPC-2酶為主[2，10-11]。CR-HvKP因其高毒力和高耐藥性，嚴重威脅患者健康，加重患者經濟負擔，給醫(yī)院感染的防控帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。為此，對1例由CR-HvKP引起的重癥肺炎患者病例資料及其分子、毒力特征進行報告，旨在提高醫(yī)務人員對CR-HvKP及其致病特點的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者男性，87歲，無業(yè)，因“反復咳嗽、咳痰4月余，加重伴發(fā)熱、氣促1個月”就診于本院呼吸內科。既往有高血壓、陳舊性肺結核病史和“風濕病”史，8年前因“支氣管擴張”行支氣管栓塞術，否認糖尿病和外傷史，無吸煙和出游史。門診以“重癥肺炎”收治入院。入院后完善三大常規(guī)、肝腎功能、心肌酶、風濕免疫檢查、心電圖、胸部CT、痰培養(yǎng)及支氣管鏡檢查等，并對分離代表株行進一步研究。重癥肺炎診斷標準參照中華醫(yī)學會呼吸病學分會制定的指南[12]。將對碳青霉烯耐藥、含有毒力基因并且經大蠟螟毒力模型評估具有高毒力的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)定義為CR-HvKP。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗 分離株通過VITEK MS(法國梅里埃)和VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)(法國梅里埃)進行鑒定及抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)測定，其中亞胺培南、美羅培南(鄭州安圖生物)和替加環(huán)素(深圳康泰生物)MIC通過E-test法復核，粘菌素MIC采用微量肉湯稀釋法檢測。替加環(huán)素MIC結果判斷參照美國食品和藥物管理局(FDA)文件[13]，多粘菌素敏感性判斷參照歐洲臨床微生物和感染病學會藥敏委員會(EUCAST)文件[14]，其余抗菌藥物的敏感性判斷參照美國臨床試驗室標準化協(xié)會(CLSI)2018文件[15]。

1.3 碳青霉烯耐藥機制的檢測 采用耐藥表型和耐藥基因檢測法。耐藥表型檢測采用CLSI 2018文件推薦的改良碳青霉烯滅活試驗[15]。耐藥基因檢測采用PCR擴增blaKPC、blaNDM和blaIMP三種常見的碳青霉烯酶基因[16]。菌株DNA提取采用煮沸法，PCR反應體系包括引物F/R各0.2 μL，2×PCR super mixture(北京全式金)12.5 μL，DNA模板3 μL，加ddH2O至25 μL。引物序列及退火溫度見表1。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性產物送長沙擎科生物技術公司測序并分析。

1.4 拉絲試驗 采用拉絲試驗確定該菌是否為高黏液表型[2]。將菌株接種至5%羊血培養(yǎng)基中，置于35℃ 5% 的CO2培養(yǎng)箱中孵育18～24 h后，用干燥的5 μL接種環(huán)輕輕挑取菌落，若拉絲>5 mm則判定為拉絲陽性，即為高黏液表型。

1.5 毒力基因、莢膜抗原基因檢測和多位點序列分型(MLST) 擴增iucA、iroN、prmpA和prmpA2四種毒力基因確定菌株毒力基因表達情況[2]。擴增所用的引物序列及退火溫度見表1，PCR反應體系同1.3。通過多重PCR的方法檢測K1、K2、K5、K20、K54和K57毒力相關莢膜抗原基因了解該菌的莢膜抗原基因表達情況，檢測方法參照文獻[17]。根據(jù)Pasteur Institute MLST 網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)提供的引物序列和條件對該菌進行MLST。

表1 CR-HvKP碳青霉烯酶耐藥基因及毒力基因引物序列及退火溫度

1.6 動物模型毒力試驗 采用大蠟螟模型了解CR-HvKP株菌在體外的毒力表現(xiàn)[2，18]。大蠟螟是鱗翅目、螟蛾科、蠟螟亞科、蠟螟屬的昆蟲。該幼蟲模型目前已成為研究許多人類病原體發(fā)病機制的可靠模型[2，18]。幼蟲在注射菌液后會產生免疫反應并黑化(圖1)，失去運動能力后死亡，通過觀察接種后幼蟲的死亡情況即可比較菌株的毒力大小[19]。將待測菌株經35℃孵育過夜后，挑取單個菌落并用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別調至1×104、1×105、1×106、1×107CFU/mL，然后采用微量注射器將各濃度菌液以10 μL/只的量注入體長2～3 cm活力較好的大蠟螟幼蟲(購自天津惠裕德公司)體內，每間隔2 h觀察幼蟲死亡情況并記錄。每個濃度設10只平行試驗。將HvKP菌株NTUH-K2044和非HvKP菌株ZR2以同樣的方式進行試驗并分別作為陽性對照組和陰性對照組，同時設置PBS空白對照組。試驗重復至少2次。

A：未接種菌液的幼蟲；B：黑化并死亡的幼蟲。

2 結果

2.1 主要診治經過 患者入院時反復咳嗽，咳淡黃色膿性痰，且痰不易咳出，并有呼吸困難，無明顯發(fā)熱，無盜汗及痰中帶血。體格檢查：體溫36.5℃，呼吸21次/min，脈搏79次/min，血壓122/76 mmHg。扶入病房，神志清楚，精神欠佳?？诖綗o發(fā)紺，雙肺呼吸音粗，右下肺可聞及中等濕啰音，心腹部查體未見異常。入院后予以吸氧、止咳化痰及改善通氣功能等對癥支持治療，并經驗性地予以頭孢哌酮/舒巴坦鈉(2 g,靜脈滴注，q6h)抗感染，患者咳嗽、氣促癥狀未見明顯改善。行胸部CT檢查示右上肺病變和雙下肺炎癥，進一步完善纖維支氣管鏡檢查。患者肺泡灌洗液培養(yǎng)分離出CR-HvKP1235，藥敏結果見表2。遂根據(jù)藥敏結果改用其敏感的鹽酸左氧氟沙星(0.3 g，靜脈滴注，q12h)和鹽酸多西環(huán)素(0.1 g，靜脈滴注，q12h)聯(lián)合抗感染，同時予以對癥支持治療。5日后患者咳嗽、呼吸困難癥狀得到明顯改善，無發(fā)熱、胸悶不適，肺部濕啰音較前明顯減少，各項生命體征平穩(wěn)，復查痰培養(yǎng)陰性，遂予出院。兩周后患者門診復查胸部CT提示肺部炎癥較前明顯好轉。

表2 CR-HvKP1235 藥物敏感性試驗結果

2.3 碳青霉烯耐藥表型及基因型檢測結果 CR-HvKP1235 改良碳青霉烯滅活試驗結果為碳青霉烯酶陽性(抑菌圈直徑6 mm)。PCR擴增檢測碳青霉烯基因結果顯示，該菌含有blaIMP-4，未檢測出blaKPC和blaNDM。見圖2。

M為Marker，A～C分別為CR-hvKP1235 blaKPC、陽性對照和陰性對照，D～F分別為CR-HvKP1235 blaNDM、陽性對照和陰性對照，G～I分別為CR-HvKP1235 blaIMP、陽性對照和陰性對照。

2.4 拉絲試驗結果 CR-HvKP1235拉絲試驗結果顯示，拉絲長度<5 mm，拉絲陰性，為非高黏液表型。

2.5 耐藥基因、毒力基因、莢膜抗原基因檢測和MLST結果 CR-HvKP1235僅prmpA2陽性，未檢出iucA、iroN和prmpA，莢膜抗原基因檢測提示含有K54莢膜抗原基因，MLST為ST2928型。見圖3。

M為Marker，A～C分別為CR-HvKP1235 iucA、陽性對照和陰性對照，D～F分別為CR-HvKP1235 iroN、陽性對照和陰性對照，G～I分別為CR-HvKP1235 prmpA、陽性對照和陰性對照，J～L分別為CR-HvKP1235 prmpA2、陽性對照和陰性對照。

2.6 動物模型毒力試驗結果 選擇在菌液濃度為1×106CFU/mL時進行各組間比較。PBS空白對照組幼蟲全部存活，CR-HvKP1235試驗組幼蟲在接種菌液14 h后存活率低于NTUH-K2044高毒力KP組和ZR2非高毒力cKP組，表明該菌株在大蠟螟幼蟲毒力模型中表現(xiàn)出較高的毒力。見圖4。

圖4 CR-HvKP1235的大蠟螟感染模型試驗結果

3 討論

自1986年第1例HvKP引起的肝膿腫被報道以來，HvKP這一高毒力變種逐漸引起人們的重視[20]。以往報道的HvKP大多引起社區(qū)獲得性感染，并且常對多種抗菌藥物有較高的敏感性，但隨著抗菌藥物的大量使用及其他諸多因素的共同作用，近幾年CR-HvKP已廣泛出現(xiàn)，給醫(yī)院感染的預防和控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2，21]。隨著對HvKP毒力機制研究的深入，許多毒力相關因子已被發(fā)現(xiàn)，如高黏液表型、莢膜血清型、MLST型及包含毒力基因的毒力質粒等[22]。雖然研究表明，peg-344、iroB、iucA、prmpA和prmpA2等毒力因子在鑒定HvKP時表現(xiàn)出較高的診斷正確性[5]，但目前仍缺乏精確區(qū)分HvKP和cKP的方法。為了解本地區(qū)KP的分子流行病學及毒力情況，為此對本院臨床微生物室分離的KP進行了連續(xù)搜集并分析，發(fā)現(xiàn)了1株具有不常見的ST型和莢膜血清型的CRKP，經進一步研究最終鑒定為CR-HvKP。

本研究中感染CR-HvKP的患者為老年男性，合并有高血壓和支氣管擴張病史，入院時精神差，雖未出現(xiàn)發(fā)熱，但有反復咳嗽、氣促的臨床表現(xiàn)，肺部炎癥范圍廣泛且遷延不愈。行纖維支氣管鏡檢查并送檢肺泡灌洗液培養(yǎng)為KP，且為多重耐藥菌，根據(jù)藥敏結果更改抗菌藥物并積極對癥支持治療后患者癥狀逐漸好轉。老年患者的重癥肺炎表現(xiàn)可不典型，若早期未引起重視易導致難以挽回的結局[23]。本例患者無發(fā)熱，白細胞計數(shù)、C反應蛋白及降鈣素原等炎癥指標均正常，血常規(guī)中性粒細胞比例升高，胸部CT發(fā)現(xiàn)雙下肺廣泛炎癥，臨床極易忽視和漏診。本次引起感染的病原菌為致病性較強并且對多種常用抗菌藥物具有較高耐藥性的KP，給臨床診治增加了一定的難度。及時完善纖維支氣管鏡檢查，明確病原菌并選擇恰當?shù)目咕幬锸潜纠斡年P鍵。值得注意的是，CR-HvKP的典型感染癥狀是肝膿腫[24]，但該患者并未出現(xiàn)此種感染的表現(xiàn)。

本研究通過毒力基因和大蠟螟毒力模型兩種方法定義了CR-hvKP。以往報道中的CR-HvKP多屬于ST11，并且大多產KPC-2[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)的CR-hvKP屬于ST2928、莢膜抗原為K54型和產IMP-4碳青霉烯酶，ST2928 CR-HvKP目前尚未見報道，說明HvKP克隆譜系具有多樣性。雖然該株CR-HvKP在體外動物模型中表現(xiàn)了較高的毒力，但患者并未出現(xiàn)嚴重的結局，其原因目前尚不明確，菌株在體內的毒力表現(xiàn)和宿主免疫之間的作用關系值得探究，相關結論需要更大樣本量和更深入研究數(shù)據(jù)的支持。由于研究的樣本十分有限，難以進一步分析這種新型ST CR-HvKP的感染危險因素或流行病學特征，同時對此株新型CR-HvKP的毒力基因背景了解也十分有限，但研究結果提示HvKP可能正在向新的克隆譜系進化，提醒應該更加密切關注CR-HvKP，需要更加積極地監(jiān)測此種病原體，以便為臨床醫(yī)生和流行病學家提供可靠的信息。在中國，CR-HvKP的報道正在增加，新的ST型出現(xiàn)令人擔憂，及早發(fā)現(xiàn)并隔離是控制此菌進一步傳播的主要措施，同時，對CR-HvKP的毒力機制和耐藥性的發(fā)生需要進行更深入地研究，以幫助臨床醫(yī)生應對危機。