尹艷楠，吳佳雯，談家金，郝德君

（南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037）

松材線蟲(chóng)病（pine wilt disease）又稱松樹(shù)枯萎病，是由松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus引起的植物病害。自從1982 年于南京中山陵的黑松Pinus thunbergii上首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病以后[1]，30 多年來(lái)，該病相繼在江蘇、安徽、浙江、廣東、山東、臺(tái)灣、香港、江西、湖南、云南、湖北、重慶和貴州等多個(gè)省、市暴發(fā)，給農(nóng)林業(yè)和國(guó)家經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了嚴(yán)重的損失[2]。目前，在松材線蟲(chóng)病防治方面主要采用對(duì)疫木進(jìn)行砍伐、鐵砂網(wǎng)罩等物理方法，但是處理困難，需要耗費(fèi)大量人力和物力；向感病疫木或林地噴灑化學(xué)農(nóng)藥的化學(xué)方法，雖然方法簡(jiǎn)單有效，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境會(huì)造成不可逆的毀壞；以及利用毒殺線蟲(chóng)的細(xì)菌、真菌或者植物性殺松材線蟲(chóng)活性物質(zhì)進(jìn)行生物防治來(lái)實(shí)現(xiàn)[3-5]。

在利用微生物防治松材線蟲(chóng)病方面，具有前景的細(xì)菌有芽孢桿菌Bacilllus，假單胞菌Pseudomonas，巴氏桿菌Pasteurella等，特別是可以在不同的宿主快速定殖，被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治方面的芽孢桿菌，包括解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，枯草芽孢桿菌B.subtilis，巴氏芽孢桿菌B.pasteurii，側(cè)孢芽孢桿菌B.lateralis，蠟樣芽孢桿菌B.cereus，蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis，短小芽孢桿菌B.pumilus和球形芽孢桿菌B.sphaericus等[6-9]。蠟樣芽孢桿菌B.cereus是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，主要分布于空氣、土壤、水及植物中，能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生芽孢，對(duì)高溫、干燥、紫外線輻射等惡劣環(huán)境都具有很強(qiáng)的抵抗能力，在植物的表面容易存活、定殖，且其抑菌范圍較廣泛，能有效地防治許多植物病害[10-12]。本文選用的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 菌株是一株從南京濕地松P.elliottii上篩選的并且可以在馬尾松P.massoniana上定殖的具有殺松材線蟲(chóng)作用的松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌，前期研究表明該菌株菌體水懸液處理線蟲(chóng)48 h 后，線蟲(chóng)死亡率達(dá)到81.5%[13]。若將蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株應(yīng)用于生產(chǎn)，要通過(guò)發(fā)酵使細(xì)胞富集，制成活菌制劑。因此，將蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 菌株發(fā)酵液?jiǎn)挝惑w積活菌數(shù)提高是關(guān)鍵的一步。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高發(fā)酵液活菌數(shù)，從而為后期蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 菌株的微生物制劑開(kāi)發(fā)與生防應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 菌株由南京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NJSZ-13 菌株種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏5 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，pH 值7.2～ 7.4。

1.2 方法

1.2.1 NJSZ-13 菌株的活化 將實(shí)驗(yàn)室保存的NJSZ-13 菌種移接到斜面試管培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)24 h 待用。

1.2.2 種子液的制備 取一環(huán)活化后的NJSZ-13 菌株接種于盛有40 mL 種子培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中，28℃、200 r·min-1條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵初始條件 按5%的接種量將NJSZ-13 菌株的種子液接種到有40 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶里，在28℃、200 r·min-1的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h。進(jìn)行單因素試驗(yàn)、培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)和發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.4 NJSZ-13 發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù) 活菌數(shù)的測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[14]。

1.2.5 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 選擇4 種不同的培養(yǎng)基（見(jiàn)表1），將NJSZ-13 菌株在不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別測(cè)定NJSZ-13 菌株發(fā)酵液的活菌數(shù)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

（1）碳源種類及其濃度篩選

分別用等量的葡萄糖、玉米粉、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源（C 源），以不加C 源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），其他發(fā)酵條件不變，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每處理重復(fù)3 次。采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定不同C 源發(fā)酵液的活菌數(shù)，篩選最佳C 源。在篩選出最佳C 源種類的基礎(chǔ)上，在相同條件下設(shè)置0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%即4，6，8，10，12，14 g·L-16 種不同濃度C 源的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以篩選出最佳C 源濃度。

（2）氮源種類及其濃度篩選

在C 源篩選的基礎(chǔ)上，分別用等量的蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨、大豆蛋白胨、玉米漿干粉、酵母粉代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（N 源），以不加N 源的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），其他發(fā)酵條件不變，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每處理重復(fù)3 次。用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算不同N 源發(fā)酵液的活菌數(shù)，篩選最佳N 源。在篩選出最佳N 源的基礎(chǔ)上，在相同條件下設(shè)置0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%即4，6，8，10，12，14 g·L-16 種不同濃度N 源的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以篩選出最佳N 源濃度。

表1 供試培養(yǎng)基及其配方Table 1 Basic medium and their formula

（3）無(wú)機(jī)鹽種類及其濃度篩選

在C 源、N 源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別添加0.6%的ZnSO4，NaCl，CaCl2，MnSO4，MgSO4，KCl 代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，以不加無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK），其他發(fā)酵條件不變，每處理重復(fù)3 次。采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算不同無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵液的活菌數(shù)，篩選最佳無(wú)機(jī)鹽。在篩選出最佳無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，在相同條件下考察在大量元素?zé)o機(jī)鹽不同濃度（0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7% 即2，3，4，5，6，7 g·L-1）發(fā)酵液中的活菌數(shù)，篩選出最佳無(wú)機(jī)鹽的濃度。

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化 篩選得到的培養(yǎng)基最佳C 源為可溶性淀粉，最佳N 源為大豆蛋白胨，最佳無(wú)機(jī)鹽為CaCl2。將可溶性淀粉（A）、大豆蛋白胨（B）和CaCl2（C）三因素按L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素與水平，見(jiàn)表2。按正交驗(yàn)設(shè)計(jì)，在28℃、200 r·min-1、pH 7.2 的條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以發(fā)酵液的活菌數(shù)為優(yōu)化指標(biāo)，比較不同組合發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.8 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 在培養(yǎng)基的優(yōu)化基礎(chǔ)上，對(duì)搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵溫度、初始pH、接種量、裝液量進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)，進(jìn)行一個(gè)因素優(yōu)化期間保證其他條件不變，計(jì)數(shù)不同條件下?lián)u瓶發(fā)酵液的活菌數(shù)。

發(fā)酵溫度：將NJSZ-13 菌株接種后分別在25，28，31，34，37℃條件下?lián)u床發(fā)酵；初始pH：用HCl 和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH 值分別為6.5，7.0，7.5，8.0，8.5；接種量：將NJSZ-13 菌株按照體積分?jǐn)?shù)分別為為1%，2%，3%，4%，5%的接種量進(jìn)行接種；裝液量：將NJSZ-13 菌株分別接種到按體積分?jǐn)?shù)為10%，20%，30%，40%，50%裝液量的培養(yǎng)基中（即100 mL 三角瓶分別裝入盛有10，20，30，40，50 mL 培養(yǎng)基）搖瓶發(fā)酵。

1.2.9 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 生長(zhǎng)曲線的繪制 將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用芬蘭制造Bio Screener 全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀FP-1100-C 每間隔2 h 測(cè)定發(fā)酵液的被檢測(cè)物吸收掉的光密度OD600值，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

由圖1 可知，將蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 接種到不同培養(yǎng)基上進(jìn)行搖床震蕩培養(yǎng)，不同培養(yǎng)基成份對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)量的影響差異顯著（P<0.05），其中，1 號(hào)與3 號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵液中蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 的活菌數(shù)量之間沒(méi)有顯著差異（P>0.05），但是菌株NJSZ-13 在3 號(hào)培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)下，單位體積的活菌數(shù)量最高，為10.00×108cfu·mL-1，1 號(hào)培養(yǎng)基單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量為9.27×108cfu·mL-1，2 號(hào)和4 號(hào)培養(yǎng)基單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量與1 號(hào)、3 號(hào)相比顯著降低，其中，4 號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)應(yīng)的單位體積內(nèi)活菌數(shù)量為6.97×108cfu·mL-1。所以，選擇3 號(hào)培養(yǎng)基作為蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.2.1 培養(yǎng)基C 源的優(yōu)化 由圖2 可知，不同C 源對(duì)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 的活菌數(shù)量有較大的影響，其中，以可溶性淀粉作為培養(yǎng)基C 源時(shí)，單位體積的活菌數(shù)量達(dá)到最大值，為16.17×108cfu·mL-1，其余C 源對(duì)活菌數(shù)量的影響由大到小依次為玉米粉、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和葡萄糖，CK 最低，為7.93×108cfu·mL-1。另外，還可以看出，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 對(duì)多糖的利用高于單糖和二糖，所以選擇可溶性淀粉作為蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的C 源。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株NJSZ-13 發(fā)酵液活菌數(shù)量的影響Figure 1 Effect of different culture media on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

圖2 不同C源培養(yǎng)基對(duì)菌株NJSZ-13活菌數(shù)量的影響Figure 2 Effect of different carbon source in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

2.2.2 C 源濃度的篩選 由圖3 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量隨著可溶性淀粉濃度的增加而增加，當(dāng)可溶性淀粉的濃度增加到10 g·L-1時(shí)，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量達(dá)到最高，為16.80×108cfu·mL-1。而當(dāng)濃度超過(guò)10 g·L-1時(shí)，隨著濃度的增加單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量隨之減少，所以選擇8，10，12 g·L-1這3 個(gè)濃度作為正交試驗(yàn)C 源濃度的三個(gè)水平。

圖3 不同濃度可溶性淀粉對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 3 Effect of different concentrations of soluble starch in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

圖4 不同N 源培養(yǎng)基對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 4 Effect of different nitrogen source in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

2.2.3 培養(yǎng)基N 源的優(yōu)化 由圖4 可知，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 以不同的N 源為培養(yǎng)基成分時(shí)，對(duì)單位體積的活菌數(shù)量影響顯著（P<0.05）。其中，以大豆蛋白胨作為單一N 源時(shí)活菌數(shù)量最大，為17.3×108cfu·mL-1，其余N 源對(duì)單位體積的活菌數(shù)量的影響由大到小依次為玉米漿干粉、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、CK、硫酸銨和尿素，其中，大豆蛋白胨、玉米漿干粉、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏是有機(jī)N 源，硫酸銨是無(wú)機(jī)N 源。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 對(duì)大多數(shù)有機(jī)氮的利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)無(wú)機(jī)氮的利用，將無(wú)機(jī)氮作為單一N 源的時(shí)候單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量甚至比不加N 源的CK 還低。有機(jī)N 源的成分相對(duì)豐富，不只是提供了N 源，還包含了C源和無(wú)機(jī)鹽，而無(wú)機(jī)N源的成分相對(duì)來(lái)說(shuō)比較單一。因此，選擇大豆蛋白胨作為蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的N 源。

2.2.4 N 源濃度的篩選 由圖5 可知，大豆蛋白胨濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 的活菌數(shù)量影響顯著（P<0.05）。在一定濃度范圍內(nèi)，NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量隨著大豆蛋白胨濃度的增加而增加，當(dāng)大豆蛋白胨的濃度為12 g·L-1時(shí)，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量達(dá)到最高值，為24.77×108cfu·mL-1。當(dāng)濃度超過(guò)12 g·L-1時(shí)，隨著大豆蛋白胨濃度的增加，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量反而隨之減少，所以選擇10，12，14 g·L-1這3 個(gè)濃度作為正交試驗(yàn)N 源濃度的三個(gè)水平。

2.2.5 培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化 由圖6 可知，無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量影響顯著（P<0.05），以CaCl2為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，NJSZ-13 對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用最好，單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量達(dá)到最大值，為26.67×108cfu·mL-1，以ZnSO4，MnSO4，MgSO4為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，單位體積發(fā)酵液的活菌數(shù)量都小于不加無(wú)機(jī)鹽的對(duì)照組。因此，選擇CaCl2作為蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

圖5 不同濃度大豆蛋白胨對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 5 Effect of different concentrations of soy peptone in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

圖6 無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 6 Effect of inorganic salt types in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

2.2.6 無(wú)機(jī)鹽濃度的篩選 不同濃度 CaCl2對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的CaCl2對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 的活菌數(shù)量影響顯著（P<0.05），培養(yǎng)基中添加的CaCl2濃度越高，菌株NJSZ-13 在發(fā)酵液中的生長(zhǎng)情況越好，對(duì)CaCl2的利用越好，單位體積發(fā)酵液中的含菌量也越高，在CaCl2濃度為6 g·L-1或者7 g·L-1時(shí)，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），但是濃度在7 g·L-1時(shí)的活菌數(shù)量最高，為28.4×108cfu·mL-1，因此，選擇5，6，7 g·L-1這3 個(gè)濃度作為正交試驗(yàn)中CaCl2濃度的三個(gè)水平。

2.3 培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)

圖7 不同濃度CaCl2 對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 7 Effect of different concentration of CaCl2 in culture medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

由圖8 可知，培養(yǎng)基C 源可溶性淀粉、N 源大豆蛋白胨及無(wú)機(jī)鹽CaCl2不同濃度比對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量影響差異顯著（P<0.05），正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)極差分析可知（表3），N 源大豆蛋白胨對(duì)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液中的的活菌數(shù)量影響最大，其次是無(wú)機(jī)鹽CaCl2，C 源可溶性淀粉，對(duì)應(yīng)的組合為4號(hào)培養(yǎng)基A2B1C2，其單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量為37.00×108cfu·mL-1。因此，確定蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉10 g·L-1，大豆蛋白胨14 g·L-1，CaCl26 g·L-1。

2.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 由圖9 可知，不同溫度下?lián)u瓶發(fā)酵得到的單位體積蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 活菌數(shù)量差異顯著（P<0.05），在28℃時(shí)搖瓶得到發(fā)酵液中最大單位體積的活菌數(shù)量，為35.80×108cfu·mL-1，當(dāng)溫度超過(guò)28℃時(shí)，隨著溫度的增加，發(fā)酵液中單位體積活菌數(shù)量急劇減少，特別是超過(guò)34℃以后，單位體積活菌數(shù)量比在28℃時(shí)培養(yǎng)的減少了大半，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 的發(fā)酵培養(yǎng)溫度不適合超過(guò)34℃，其最適培養(yǎng)溫度為28℃。

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Orthogonal test and results

圖8 正交各組培養(yǎng)基對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 8 Effect of orthogonal groups of medium on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

圖9 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 9 Effect of different fermentation temperature on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

2.4.2 發(fā)酵初始pH 的優(yōu)化 由圖10 可知，培養(yǎng)基初始pH 在6.5～ 8.5，蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液中的含菌量差異顯著（P<0.05），在發(fā)酵初始pH 7.5 時(shí)單位體積發(fā)酵液中的含菌量最高，其活菌數(shù)量為37.67×108cfu·mL-1，但是pH 在 8.0～ 8.5 時(shí)，菌株NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量雖然有差異，但活菌數(shù)量保持較高的水平，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌菌株NJSZ-13 對(duì)pH 適應(yīng)范圍較寬且更偏向弱堿性的生活環(huán)境，因此，選擇pH 7.5 為菌株NJSZ-13 搖瓶發(fā)酵的最佳初始pH 值。

2.4.3 發(fā)酵接種量的優(yōu)化 由圖11 表明，不同接種量對(duì)發(fā)酵最終活菌數(shù)量的影響有顯著差異（P<0.05），在接種量為1%和2%時(shí)，對(duì)菌株NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量沒(méi)有顯著影響，但是在2%接種量時(shí)單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量達(dá)到最大值，為3.81×109cfu·mL-1，接種量超過(guò)2%時(shí)，隨著接種量的增加單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量逐漸降低，所以選擇2%為搖瓶發(fā)酵的最佳接種量。

2.4.4 發(fā)酵裝液量的優(yōu)化 由圖12 表明，發(fā)酵裝液量對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響差異顯著（P<0.05），在培養(yǎng)基為20%的裝液量時(shí)，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量顯著高于其他裝液量的活菌數(shù)，其有效含菌量最高值為4.13×109cfu·mL-1，當(dāng)裝液量超過(guò)30%時(shí)，隨裝液量的增加單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量顯著降低。但是考慮到發(fā)酵設(shè)備的空間充分利用，選擇30%作為搖瓶發(fā)酵的最佳裝液量。

圖10 不同發(fā)酵初始pH對(duì)菌株NJSZ-13活菌數(shù)量的影響Figure 10 Effect of different initial pH of fermentation on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

圖11 不同接種量對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 11 Effect of different inoculum size on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

2.5 NJSZ -13 培養(yǎng)基優(yōu)化前后的生長(zhǎng)曲線與活菌數(shù)量對(duì)比

從圖13 可以看出，在0～ 4 h，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13處于延緩期。在4 h 以后開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)期，但是在指數(shù)期間，使用優(yōu)化前的培養(yǎng)基即3 號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)的指數(shù)期為4～ 24 h，優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)指數(shù)期為4～ 30 h，相較優(yōu)化前的條件指數(shù)期延長(zhǎng)了6 h，使得菌體在這個(gè)階段呈現(xiàn)了倍數(shù)增長(zhǎng)，在30 h 以后才進(jìn)入穩(wěn)定期。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，24 h 后取樣稀釋涂布，優(yōu)化后單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量平均值為4.10×109cfu·mL-1，是原始發(fā)酵培養(yǎng)液的4.1 倍（表4）。

圖12 不同裝液量對(duì)菌株NJSZ-13 活菌數(shù)量的影響Figure 12 Effect of different liquid volume on viable count of strain NJSZ-13 in fermentation broth

表4 菌株NJSZ-13 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化前后的活菌數(shù)量Table 4 The viable count before and after optimization of culture

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出了蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 發(fā)酵培養(yǎng)基的最適C 源為可溶性淀粉，最適N 源為大豆蛋白胨，最適無(wú)機(jī)鹽為CaCl2。應(yīng)用正交試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基的最佳配比：可溶性淀粉10 g·L-1，大豆蛋白胨14 g·L-1，CaCl26 g·L-1。在此基礎(chǔ)上，單因素優(yōu)化獲得了最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵初始pH 值為7.5，接種量為2%，裝液量為30%。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，延長(zhǎng)了發(fā)酵過(guò)程的指數(shù)期，使得菌體在這個(gè)階段呈現(xiàn)了倍數(shù)增長(zhǎng)，單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量達(dá)到4.10×109cfu·mL-1，是原始發(fā)酵培養(yǎng)液?jiǎn)挝惑w積活菌數(shù)量的4.1 倍。

3.2 討論

對(duì)于在工業(yè)生產(chǎn)中具有開(kāi)發(fā)潛力及利用價(jià)值的菌株，通常要先對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到菌體富集的目的。除了受到自身代謝調(diào)控的影響外，芽孢桿菌的發(fā)酵液活菌數(shù)量還會(huì)受外界環(huán)境條件（主要是發(fā)酵培養(yǎng)基成分、濃度和發(fā)酵條件）的影響。在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中，溫度是影響菌體生長(zhǎng)繁殖的一個(gè)重要因素，溫度過(guò)低影響菌體的代謝從而影響它的生長(zhǎng)，溫度升高可以增加菌體內(nèi)酶的反應(yīng)速率從而提高代謝，但溫度過(guò)高時(shí)又會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)甚至使菌體失活；適度的酸堿環(huán)境及溶氧量是滿足微生物生長(zhǎng)、繁殖及產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本要求；較大的接種量可以使菌體快速進(jìn)入生長(zhǎng)指數(shù)期，縮短發(fā)酵周期，但是接種量過(guò)大容易造成營(yíng)養(yǎng)消耗快，菌體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不上，影響菌體的生長(zhǎng)和芽孢的形成。因此對(duì)微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)通常對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分和條件優(yōu)化。

為了環(huán)境保護(hù)，減少松材線蟲(chóng)病防治中對(duì)化學(xué)藥品的依賴，國(guó)內(nèi)已有多名研究者從生物防治角度篩選獲得對(duì)松材線蟲(chóng)有毒殺活性的芽孢桿菌菌株[15-17]。在微生物發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化中的首要環(huán)節(jié)就是發(fā)酵工藝的優(yōu)化，目前有很多實(shí)驗(yàn)技術(shù)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法應(yīng)用于發(fā)酵工藝的優(yōu)化。已有研究表明，張慧等[18]對(duì)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）CS27 液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后單位體積發(fā)酵液中的細(xì)胞生物量達(dá)到1.75×109cfu·mL-1，廣澤宇等[19]對(duì)生防蠟樣芽孢桿菌BQ-4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后單位體積發(fā)酵液中的的細(xì)胞生物量達(dá)到2.936×109cfu·mL-1。本試驗(yàn)選用的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 已經(jīng)證實(shí)了對(duì)松材線蟲(chóng)有殺線蟲(chóng)效果[13]。為了將該菌株用于生產(chǎn)，提高菌株的利用價(jià)值，對(duì)該菌株進(jìn)行了發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化。蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 單位體積發(fā)酵液中的活菌數(shù)量除了受自身代謝的影響外，外界環(huán)境條件（培養(yǎng)基成分，發(fā)酵過(guò)程參數(shù)）也是重要因素。為了使蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13 盡快結(jié)束生長(zhǎng)遲緩期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，同時(shí)延長(zhǎng)穩(wěn)定期，以提高單位體積發(fā)酵液中的菌體濃度，對(duì)其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。本試驗(yàn)先是通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，接著利用三因素三水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，在保證準(zhǔn)確性的前提下，減少了試驗(yàn)次數(shù)，縮短了周期。相比劉瑩瑩等[20]對(duì)兩株生防菌株芽孢桿菌 STW-2 和 STW-64 進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和王勇等[21]對(duì)解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensGZ-5 發(fā)酵條件中以O(shè)D600為優(yōu)化參數(shù)，本文以單位體積發(fā)酵菌體的活菌數(shù)量為優(yōu)化參數(shù)具有更直接更準(zhǔn)確的效果。