張奧倫, 殷 婷, 張西志

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

結(jié)直腸癌(CRC)位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位(10.2%), 死亡率位居第2位(9.2%)[1]。中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)生率較低，但近年來有升高的趨勢(shì)[2]。目前, CRC的治療已經(jīng)從“外科為主、放化療為輔”的固有治療模式轉(zhuǎn)向了精準(zhǔn)化、個(gè)體化的治療理念，應(yīng)運(yùn)而生的免疫治療也越來越受到重視。不同于依靠外界干預(yù)殺死腫瘤細(xì)胞的傳統(tǒng)模式，免疫治療是依靠自身的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過激活免疫檢查點(diǎn)活性，從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICPI)通過拮抗免疫檢查點(diǎn)蛋白，促進(jìn)T細(xì)胞活化，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種實(shí)體瘤的治療方面已顯示出良好的療效，且具有不良反應(yīng)較少、與放化療無交叉耐藥等優(yōu)勢(shì)。然而，只有部分接受ICPI治療的患者能夠獲得持久的臨床療效[4]。因此，預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的可能性將有助于患者對(duì)這些藥物進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。

在接受免疫治療的結(jié)直腸癌患者的血液或腫瘤組織中已發(fā)現(xiàn)了各種潛在的生物標(biāo)志物。程序性死亡蛋白-1配體(PD-L1)通常表達(dá)于細(xì)胞表面，它將程序性死亡蛋白-1(PD-1)結(jié)合在啟動(dòng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞上，從而抑制細(xì)胞介導(dǎo)的攻擊，這種配體在腫瘤細(xì)胞上的過表達(dá)提供了對(duì)腫瘤細(xì)胞攻擊的保護(hù)。目前，免疫組化檢測(cè)PD-L1已廣泛應(yīng)用于篩選結(jié)直腸癌免疫治療可獲益的患者。然而，腫瘤組織微環(huán)境可干擾PD-L1的表達(dá)，且在結(jié)直腸癌中PD-L1的表達(dá)與免疫治療的療效關(guān)系并不確切。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是ICPI反應(yīng)的一個(gè)已確定的生物標(biāo)志物。然而, MSI-H型結(jié)直腸癌患者對(duì)ICPI的應(yīng)答率也是可變的，且腫瘤應(yīng)答者比無反應(yīng)者具有更多的體細(xì)胞突變和更高的新抗原負(fù)荷[5], 表明需要額外的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。腫瘤突變負(fù)荷(TMB)是一種新興的獨(dú)立生物標(biāo)志物[6-7], 即檢測(cè)腫瘤基因編碼區(qū)的突變總數(shù)，可用于分層患者對(duì)ICPI的反應(yīng)可能。研究[8]發(fā)現(xiàn)，TMB高表達(dá)(TMB-H)肺癌患者中，ICPI組應(yīng)答率高于TMB低表達(dá)(TMB-L)患者，且客觀緩解率(ORR)、無進(jìn)展生存期(PFS)均顯著改善，提示高TMB與免疫治療的療效呈正相關(guān)。本研究對(duì)TMB在結(jié)直腸癌免疫治療中的療效預(yù)測(cè)價(jià)值及其臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 TMB概述

基因突變分為胚系突變和體細(xì)胞突變。TMB是指腫瘤細(xì)胞基因組中所評(píng)估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換、插入、缺失突變的總數(shù)。高度突變的腫瘤被認(rèn)為含有增加的新抗原負(fù)荷，使其具有免疫原性，并對(duì)免疫治療有反應(yīng)[9]。在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中，由于基因組改變導(dǎo)致細(xì)胞功能致病性變化，這一過程被稱為“驅(qū)動(dòng)”突變，它導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生; 大量的體細(xì)胞突變可以產(chǎn)生新抗原，這些新抗原可被患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別。新抗原的大量產(chǎn)生與對(duì)檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)的增強(qiáng)相關(guān)，被認(rèn)為是ICPI作用于腫瘤組織的機(jī)制[10-12]。研究[13]證實(shí)，高突變負(fù)荷和腫瘤新表位負(fù)荷是結(jié)直腸癌免疫活性的主要驅(qū)動(dòng)因素。

Panda A等[14]研究提出，在癌癥基因組圖譜33種實(shí)體癌中, 8種存在突變負(fù)荷閾值，該閾值識(shí)別出具有免疫檢查點(diǎn)激活特征的腫瘤。突變負(fù)荷高于閾值(ICAM+)的腫瘤具有如下特征: ① 存在免疫激活，高CD8AmRNA水平、免疫浸潤(rùn)證據(jù)以及白細(xì)胞中高CD8+T細(xì)胞比例; ② 可以上調(diào)免疫檢查點(diǎn)途徑基因表達(dá)。對(duì)黑色素瘤、肺腺癌和結(jié)腸癌等研究分析表明，ICAM+腫瘤患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)治療有更好的反應(yīng)。而突變負(fù)荷低于閾值的腫瘤(ICAM-)和ICAM+腫瘤具有不同的突變模式和免疫微環(huán)境，使用臨床測(cè)序分析可識(shí)別該閾值。

TMB不僅受外源性因素(如受紫外光照射、接觸有毒化學(xué)物質(zhì))的驅(qū)動(dòng)，而且由編碼DNA修復(fù)機(jī)制的基因中的破壞性突變所驅(qū)動(dòng)。Endris V等[15]研究顯示，發(fā)生DNA錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制缺陷的MSI-H腫瘤的TMB值范圍為10～100 Mut/Mb, 同時(shí)具有MSI-H及POLE28核酸外切酶結(jié)構(gòu)域突變的癌癥TMB值大于100 Mut/Mb, 表明這些DNA修復(fù)機(jī)制有缺陷的案例可以從檢查點(diǎn)抑制劑治療方案中明顯獲益。

2 TMB在結(jié)直腸癌免疫治療中的療效預(yù)測(cè)及相關(guān)研究進(jìn)展

目前, TMB對(duì)MSI-H mCRC的免疫治療的療效預(yù)測(cè)價(jià)值已在多項(xiàng)臨床研究中得到證實(shí)。Schrock AB等[16]收集了經(jīng)免疫治療的22例MSI-H mCRC患者的臨床資料，用下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)在DNA的0.8～1.1 Mbp上測(cè)定TMB, 對(duì)療效和進(jìn)展時(shí)間的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行分析。他們通過單因素分析和多變量分析，發(fā)現(xiàn)TMB與ORR和PFS的相關(guān)性最強(qiáng)(P<0.001)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)估計(jì)TMB的最佳預(yù)測(cè)切點(diǎn)在37～41個(gè)突變/Mb。13例TMB-H的病例均有療效，而9例TMB-L中有6例存在病情進(jìn)展。TMB-H患者的中位PFS隨訪大于18個(gè)月，而TMB-L的中位數(shù)PFS為2個(gè)月。該研究[16]還在大量MSI-H mCRC人群(821/18 140, 4.5%)中使用NGS評(píng)估TMB為37.4個(gè)突變/Mb, 與第35百分位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，再一次證實(shí)了評(píng)估TMB可能有助于在MSI-H mCRC人群中進(jìn)一步分層ICPI的可能應(yīng)答者。

Dung T L等[17]探討了TMB和衍生的新抗原對(duì)PD-1阻斷劑敏感性的影響，結(jié)果證明ICPI治療的錯(cuò)配修復(fù)缺陷型(dMMR)結(jié)直腸癌患者顯示出更高的免疫相關(guān)的ORR和PFS，高于錯(cuò)配修復(fù)正常型(pMMR)的結(jié)直腸癌患者。他們分析整個(gè)外顯子的序列發(fā)現(xiàn)，與pMMR型相比, dMMR型腫瘤的每個(gè)體細(xì)胞突變數(shù)明顯更高。研究[18]表明，較長(zhǎng)的PFS與大量的體細(xì)胞突變與潛在的突變相關(guān)的新抗原有關(guān)。由此可見，使用MSI-H/dMMR和TMB作為ICPI的生物標(biāo)志物的原理是相似的，即存在的DNA突變?cè)蕉?，產(chǎn)生的改變肽就越多，導(dǎo)致新抗原被免疫系統(tǒng)成功識(shí)別的可能性就更高。因此, MSI-H/dMMR和具有TMB-H的腫瘤之間存在重疊[19]。

一項(xiàng)納入6 004例大腸癌的研究[20]用CLIA批準(zhǔn)的CGP測(cè)序確定MSI和TMB狀態(tài)。他們根據(jù)MSI-H患者TMB分布的90%概率間隔的下限值來定義TMB-H的界值。結(jié)果顯示, 6 004例CRC患者中有302例(5.0%)觀察到MSI-H腫瘤，其中99.7%的病例均為TMB-H (范圍6.3～746.9 μt/Mb), 而其余的5 702例病例中, 5 538例(97.1%)為TMB-L(范圍0～10.8 mut/Mb)。另外，在5 702例微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)的病例中，有164例(2.9%)被證實(shí)為TMB-H (范圍為11.7～707.2 μt/Mb), 而且在MSS/TMB-H的病例中也顯示出了對(duì)PD-1抑制劑的良好反應(yīng)。結(jié)果顯示，從ICPI治療獲益的目標(biāo)人群增加了54%(466人vs. 302人)。由此可見, MSI-H CRC中的TMB普遍升高，但仍然相當(dāng)多變。

TMB檢測(cè)可幫助對(duì)CRC患者進(jìn)行重新分類, TMB-H可能反映突變相關(guān)新抗原的存在，伴隨著腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，即使在MSS結(jié)直腸癌中也存在這種現(xiàn)象[21]。極突變可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的MSS表型超突變[22]。Stadler ZK等[23]的一項(xiàng)NGS研究證實(shí)，突變負(fù)荷增加與MSI相關(guān)，但區(qū)別于MSI腫瘤具有最高突變負(fù)荷的結(jié)直腸腫瘤都含有極突變。在Ⅰ～Ⅲ期CRC中，高達(dá)50%的MSS腫瘤具有高免疫核心，新抗原負(fù)荷升高和/或高免疫核心與較好的生存有關(guān)[21, 24]。根據(jù)Gong J等[25]研究的CRC病例結(jié)論顯示，盡管免疫組化確認(rèn)為pMMR, NGS確認(rèn)了MSS狀態(tài)，但TMB高的隊(duì)列對(duì)免疫治療的臨床療效較好; 高TMB和高突變表型相關(guān)分子的存在可以識(shí)別對(duì)ICPI可能有反應(yīng)的MSS mCRC患者亞群?？梢? TMB檢測(cè)有效地增加了符合ICPI治療的患者數(shù)量。

此外，研究[26]顯示TMB在結(jié)直腸癌患者中與化療結(jié)果具有一定相關(guān)性。在TMB-L組中，與以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療患者相比，以伊立替康為基礎(chǔ)的化療患者的PFS有所改善(11.9月vs. 6.5月,P<0.001), 而在TMB-H中, 2個(gè)治療隊(duì)列間沒有差異。此項(xiàng)研究提出, TMB-L可能是結(jié)直腸癌患者化療結(jié)果的一個(gè)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，但這些結(jié)果還需要在更大的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

3 TMB的應(yīng)用現(xiàn)狀及其局限性

檢測(cè)TMB的具體方法為對(duì)腫瘤組織切片或血液標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序(HTS)。根據(jù)最新研究[27]結(jié)果，可以使用NGS測(cè)定法，用經(jīng)過驗(yàn)證的算法來可靠地估算TMB, 該算法可查詢足夠大的外顯子集，以替代全外顯子組測(cè)序。但TMB檢測(cè)目前仍未廣泛應(yīng)用于臨床，主要的因素有: ① 高成本。全基因組、全外顯子組測(cè)序檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且價(jià)格高昂，目前在臨床應(yīng)用較多的是選擇性測(cè)序，但相比免疫組化法測(cè)定MSI及PD-L1, 其消耗成本相對(duì)較大。② 不同檢測(cè)平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)不一。目前有多家基因檢測(cè)公司都建立了自己的 TMB檢測(cè)方案，但是每個(gè)公司的基因集合所涵蓋的基因不同，設(shè)定的閾值不同，因此目前TMB檢測(cè)的現(xiàn)狀無法標(biāo)準(zhǔn)化，這是無法廣泛應(yīng)用于臨床最為關(guān)鍵的因素。③ 不同類型腫瘤TMB水平差異大。需要區(qū)分不同類型腫瘤的可能致病基因組[28]。Chowell D等[29]指出，由于腫瘤免疫機(jī)制及微環(huán)境尚在進(jìn)一步的探索中，且基因突變產(chǎn)物具有免疫原性的差異，僅僅依據(jù)TMB的數(shù)值可能并不能足以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)免疫治療的療效，同時(shí)還取決于TMB突變的“質(zhì)量”，即HLA分型。研究[30]報(bào)道，富含移碼基因突變(堿基插入或缺失)的腫瘤比含有非同義突變的腫瘤更具免疫原性。還有研究[31]提示石蠟包塊組織樣本與血液樣本檢測(cè)的TMB結(jié)果有所偏差。

總之, TMB的檢測(cè)雖然已從臨床研究逐步走向臨床應(yīng)用，但仍面臨較多的問題，影響TMB表達(dá)的相關(guān)因素及如何提高其準(zhǔn)確度、靈敏度等都需要進(jìn)一步的研究。

4 總結(jié)與展望

近年來，免疫治療將結(jié)直腸癌的治療帶入了一個(gè)精準(zhǔn)治療的時(shí)代, PD-1/PD- L1抗體可誘導(dǎo)惡性腫瘤的持久緩解，極大延長(zhǎng)了疾病緩解期。然而，免疫治療在結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的總體有效率并不高，如何篩選優(yōu)勢(shì)人群更加迫切。TMB是跨多種腫瘤類型的ICPI治療結(jié)果的最新獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。某些NGS技術(shù)從外顯子組的一個(gè)子集就能夠可靠地評(píng)估TMB, 而無需使用全外顯子測(cè)序，從而有助于在臨床采用TMB評(píng)估結(jié)腸癌患者的免疫治療療效。在結(jié)直腸癌中，雖然PD-L1和MSI-H/dMMR都已被確立為對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行分層的生物標(biāo)志物，但還是不夠完美，在敏感性和特異性方面都存在缺陷。

TMB可以幫助在MSI-H患者人群中進(jìn)一步篩選，并且可以在MSS/TMB-H的亞組中找到在MSI檢測(cè)中被遺漏的可能獲益的優(yōu)勢(shì)人群。雖然PD-L1檢測(cè)可以預(yù)測(cè)療效，但其在結(jié)直腸癌患者中的陽性率并不高, TMB檢測(cè)可以與之相互補(bǔ)充，成為評(píng)估結(jié)直腸癌患者免疫治療療效的更具包容性的生物標(biāo)志物。TMB可在血液中進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)腫瘤組織不可用或無法獲得時(shí), TMB便成為優(yōu)勢(shì)生物標(biāo)志物[32-35]。然而，當(dāng)前TMB的檢測(cè)仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，有待更多的前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。當(dāng)然，除了腫瘤突變負(fù)荷外，關(guān)于免疫治療療效預(yù)測(cè)因素的研究還有非常廣闊的空間，比如腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞數(shù)量及種類、外周血循環(huán)標(biāo)志物等，都有希望將更多的合適患者篩選出來接受免疫治療，從而獲得更低的副作用及更久的療效維持時(shí)間。