朱兆偉，相芬芬，范 嫣，康向東，吳 蓉

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院檢驗科(上海 200333)

根據(jù)GLOBOCAN 2018統(tǒng)計收集來自185個國家18億人住院登記數(shù)據(jù)，2018年診斷為癌癥的患者是1800萬人，有960萬人死因為癌癥[1]。中醫(yī)藥在抗腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用并取得良好療效。熊果酸(Ursolic acid，UA) 又名烏索酸(烏蘇酸)，屬五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在自然界植物中，如山楂、熊果、烏梅、陸英、蘆筍、野薔薇果、車前草、女貞子。近年來，隨著對熊果酸抗腫瘤特性研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抗腫瘤譜廣、對正常細(xì)胞毒性低的特點，其可從多個途徑抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此其抗腫瘤作用日益受到關(guān)注[2-4]?，F(xiàn)將近幾年熊果酸抑制腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展綜述如下。

1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種細(xì)胞自主、程序性死亡方式，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。因此，靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是抑制腫瘤重要方式。

1.1 半胱天冬酶(Caspase)途徑 Chen等[5]發(fā)現(xiàn)熊果酸抑制口腔癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是通過介導(dǎo)半胱天冬酶途徑，增加了口腔癌細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9的活性，降低了AKT(Ser473)的磷酸化Bcl-2相關(guān)的細(xì)胞死亡激動劑(BAD;Ser136)，以及Bcl-2 和Bcl-xL的蛋白質(zhì)水平，并增加BAD和Bax蛋白在口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)。熊果酸增強(qiáng)口腔癌化療效果具有潛在價值。

1.2 Rho激酶(ROCK)/磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)途徑 Mu等[6]發(fā)現(xiàn)ROCK1/PTEN - 絲切蛋白(Cofilin-1)/細(xì)胞色素(Cytochrome) c蛋白表達(dá)介導(dǎo)了Caspase-3/9活性，部分通過ROCK/ PTEN直接靶向介導(dǎo)Cofilin-1線粒體易位，進(jìn)而誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡。Meng等[7]發(fā)現(xiàn)熊果酸顯著抑制前列腺癌DU145細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及增加DU145細(xì)胞的Caspase-3和Caspase-9活性。此外，熊果酸能顯著激活并抑制細(xì)胞質(zhì)和線粒體細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)。熊果酸的抗癌作用通過ROCK/PTEN介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞中cofilin-1的線粒體轉(zhuǎn)位激活細(xì)胞凋亡。

1.3 PI3K/Akt途徑 Gai等[8]發(fā)現(xiàn)UA不僅抑制細(xì)胞生長，還通過調(diào)節(jié)人前列腺癌中PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。UA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bcl-xl、Survivin、活化Caspase-3的表達(dá)減少，且與抑制PI3K、Akt和mTOR信號蛋白磷酸化的表達(dá)有關(guān)。Chuang等[9]發(fā)現(xiàn)UA與抗凋亡蛋白髓樣細(xì)胞白血病1(Mcl-1)、Bcl-xL、Bcl-2和翻譯調(diào)控腫瘤蛋白(TCTP)的表達(dá)減少，及其凋亡相關(guān)蛋白腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、脂肪酸合成酶(Fas)、 Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、B細(xì)胞白血病淋巴瘤相關(guān)蛋白基因(Bax)、Caspase-3、8、9和聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)表達(dá)增加有關(guān)。UA通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及激活p38/JNK 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路。Villar等[10]發(fā)現(xiàn)UA阻滯AKT/GSK3β/β-連環(huán)蛋白的存活信號通路，導(dǎo)致抗細(xì)胞凋亡蛋白荷瘤小鼠核蛋白類調(diào)控基因(c-Myc)和 p21下調(diào)，共同導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)凋亡的激活。UA能夠誘導(dǎo)人軟組織肉瘤(STS)細(xì)胞凋亡，通過阻斷AKT信號通路使STS細(xì)胞對多柔比星敏感。因此，它作為營養(yǎng)保健佐劑與多柔比星一起使用可以不增加化療藥物劑量和毒性，改善軟組織肉瘤患者的治療結(jié)果。

1.4 線粒體途徑 Lewinska等[11]研究發(fā)現(xiàn)，UA誘導(dǎo)AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)的能量應(yīng)激激活，導(dǎo)致細(xì)胞毒性自噬和細(xì)胞凋亡。UA介導(dǎo)的一氧化氮水平升高和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ATM)激活也可以解釋AMPK激活-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。此外，UA增強(qiáng)細(xì)胞凋亡與磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(pERK1/2)信號降低有關(guān)和線粒體膜電位的去極化。UA誘導(dǎo)的糖酵解途徑的變化可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性自噬和細(xì)胞凋亡死亡，是一種有吸引力的抗癌策略。Jin等[12]發(fā)現(xiàn)，UA和葉酸組成(FA-CS-UA-NPs)通過葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑容易地被癌細(xì)胞內(nèi)化。FA-CS-UA-NPs進(jìn)入溶酶體，破壞了溶酶體膜的通透性，然后從溶酶體中釋放出來。FA-CS - UA-NPs在線粒體中的延長保留誘導(dǎo)了ROS的過量產(chǎn)生和線粒體膜電位的破壞，并導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞不可逆的細(xì)胞凋亡。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，熊果酸降低了細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子(BCL2/BAX)的比例，導(dǎo)致線粒體電位紊亂并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制人宮頸癌細(xì)胞模型裸鼠腫瘤生長。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)熊果酸降低肺癌NCI-H292細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。熊果酸增加NCI-H292細(xì)胞Ca2+產(chǎn)生，但不影響ROS的產(chǎn)生。UA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通過NCI-H292細(xì)胞線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和內(nèi)切酶G。

1.5 轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)途徑 Kim等[15]發(fā)現(xiàn)熊果酸通過上調(diào)miR-4500和抑制信號傳導(dǎo)與STAT3磷酸化誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，UA可以抑制由白細(xì)胞介素(IL)-6 信號傳導(dǎo)與誘導(dǎo)磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子3(P-STAT3)在Hep3B肝癌細(xì)胞中表達(dá)。UA也抑制人肝癌細(xì)胞系HEPG2，772和Huh7中組成型STAT3磷酸化。UA還抑制細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移和肝癌細(xì)胞集落形成。UA廣泛存在于水果和草藥，可以通過抑制STAT3的活化來抑制人肝癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的生長。熊果酸可能是一種潛在的預(yù)防保健產(chǎn)品，以及有希望成為肝癌化療輔助藥物。

1.6 其他途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 Lin等[17]發(fā)現(xiàn)UA在K562和K562/G01中與伊馬替尼聯(lián)合使用時具有協(xié)同作用。證據(jù)表明UA在K562細(xì)胞中的促細(xì)胞凋亡作用與獨立生長因子1(Gfi-1)/Stat5/Akt有關(guān)途徑。UA可能是治療慢性粒細(xì)胞白血病有用的藥物。Sohn等[18]發(fā)現(xiàn)熊果酸通過抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和激活let7b誘導(dǎo)間皮瘤細(xì)胞凋亡，作為治療惡性間皮瘤的有效藥物。

2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖

腫瘤的生長與腫瘤細(xì)胞的不受機(jī)體調(diào)控而異常增殖所致，因此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是抑制腫瘤生長的重要方式，有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖也是評價抗腫瘤藥物療效的基本要求。有許多研究明確表明熊果酸對多種腫瘤具有抑制增殖作用。Shan等[19]用熊果酸可抑制CRC細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)奧沙利鉑對細(xì)胞的毒性作用，這種效果是隨著B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-xL、Bcl-2、生存素(Survivin)的下調(diào)，激活半胱天冬酶(Caspase)-3,8,9，抑制鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)1/2、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、p-38、C-Jun 氨基末端激酶(JNK)、蛋白激酶B(AKT)、核因子κB激酶抑制劑(IKKα)、NF-κB抑制蛋白α(IKBα)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)和核因子-kappa B(NF-κB)信號通路p65磷酸化表達(dá)。此外，熊果酸能還原用奧沙利鉑處理過小鼠的肝功能和增加體重。因此，熊果酸可以增強(qiáng)奧沙利鉑對CRC的體外和體內(nèi)治療作用，減輕奧沙利鉑引起的不良反應(yīng)。

3 阻遏細(xì)胞周期

熊果酸通過調(diào)節(jié)基因作用對細(xì)胞增殖有影響。Xiang等[20]發(fā)現(xiàn)UA可抑制人胃癌細(xì)胞的體外生長和轉(zhuǎn)移。用UA處理BGC-823細(xì)胞后，使細(xì)胞凋亡和G1期增加，細(xì)胞遷移受到抑制，Bax、Caspase-3、Bcl-2表達(dá)降低。UA上調(diào)了BGC-823細(xì)胞微小RNA-133a(miR-133a)水平。miR-133a過表達(dá)增加了BGC-823細(xì)胞G1期的細(xì)胞周期和降低了Akt1的表達(dá)。UA對治療繼發(fā)miR-133a表達(dá)增加胃癌患者有效。Zhang等[21]在目前的研究中，我們證明了p21在熊果酸的G1細(xì)胞周期停滯中發(fā)揮了中介作用，而p21介導(dǎo)的Mcl-1上調(diào)可以降低熊果酸的凋亡作用。這些結(jié)果表明p21活性，在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)方面起雙重作用。 熊果酸誘導(dǎo)p21的產(chǎn)生是由于p53轉(zhuǎn)錄激活。熊果酸能夠抑制小鼠雙微體基因(MDM2)和T-LAK細(xì)胞源蛋白激酶(TOPK)，是p53的兩個負(fù)調(diào)節(jié)因子，反向促進(jìn)熊果酸誘導(dǎo)p53激活。

4 腫瘤藥物增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥性

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥常常最終導(dǎo)致化療失敗，熊果酸具有逆轉(zhuǎn)腫瘤藥物耐藥性和藥物增敏作用。Manouchehri等[22]發(fā)現(xiàn)UA是一個有效的凋亡誘導(dǎo)配體(rhTRAIL)增敏劑誘導(dǎo)三陰性乳腺癌rhTRAIL耐藥的細(xì)胞凋亡。Zhang等[23]用熊果酸和奧沙利鉑治療CRC細(xì)胞監(jiān)測對細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)和耐藥基因產(chǎn)生的影響。發(fā)現(xiàn)了熊果酸和奧沙利鉑組合治療方法顯著抑制細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生，并顯著抑制耐藥基因P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP) 、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)蛋白和mRNA 表達(dá)水平，達(dá)到增強(qiáng)奧沙利鉑治療結(jié)直腸癌的療效。Wang等[24]證明在缺氧條件下UA可以抑制卵巢癌CSCs細(xì)胞的增殖和逆轉(zhuǎn)耐藥性通過下調(diào)HIF-1α和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2抗體(ABCG2)的表達(dá)。UA誘導(dǎo)的HIF-1α下調(diào)和ABCG2減少，PI3K/Akt信號通路激活在其中起重要作用。研究表明UA是一種傳統(tǒng)的化合物中藥，是一種有希望的逆轉(zhuǎn)卵巢癌CSCs細(xì)胞耐藥性的藥物。Shan等[25]證明UA是能夠通過抑制多藥耐藥基因(MDR)1的表達(dá)，下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α積累，解釋了UA在缺氧條件下逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的化療耐藥性的作用。

5 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬

自噬對腫瘤細(xì)胞所起的作用是兩面性。正常生理情況下，細(xì)胞自噬利于細(xì)胞保持自穩(wěn)狀態(tài)，在發(fā)生應(yīng)激時，細(xì)胞自噬防止有毒或致癌的損傷細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的累積，抑制細(xì)胞癌變；然而腫瘤一旦形成，細(xì)胞自噬為癌細(xì)胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長。Luo等[26]發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。熊果酸可通過PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑的失活來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。熊果酸通過糖原合成酶激酶(GSK)和Bcl-2/Caspase-3信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬和凋亡，并且熊果酸下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的NF-κB來抑制炎癥反應(yīng)的作用也參與抑制細(xì)胞增殖。Jung等[27]研究了UA誘導(dǎo)嗜鉻細(xì)胞瘤(PC-12)細(xì)胞死亡。通過降低Bcl2、激活Caspase-3和誘導(dǎo)聚(ADP-核糖基)聚合酶的裂解來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。探討UA影響自噬進(jìn)展，p62水平及微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)-Ⅰ至LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化率是自噬通量重要檢測標(biāo)志物。UA誘導(dǎo)p62的增加，增大了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率。結(jié)果表明UA引起自噬，但下游信號通路受阻?？傊?，這項研究表明UA通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和損害自噬過程來殺死PC-12細(xì)胞。

6 通過調(diào)控癌基因和抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞生長

腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、耐藥過程中，受癌基因與抑癌基因的調(diào)控。因此，通過調(diào)控癌基因和抑癌基因抑制腫瘤生長。Yang等[28]結(jié)果顯示UA抑制HCC細(xì)胞的生長，是通過介導(dǎo)p38MAPK誘導(dǎo)抑制胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)1和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a(FOXO3a)的表達(dá)的。Yie等[29]發(fā)現(xiàn)UA抑制了HCC細(xì)胞的生長，以劑量和時間依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)UA誘導(dǎo)AMP激活的蛋白激酶α(AMPKa)磷酸化和呈劑量依賴性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)。此外，UA抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)。相反，Sp1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了UA對DNMT1表達(dá)和影響細(xì)胞的生長。結(jié)果首次表明了UA通過AMPKa介導(dǎo)抑制作用Sp1蛋白來抑制HCC的生長，這反過來導(dǎo)致DNMT1的抑制。該研究揭示了UA抑制HCC細(xì)胞的生長的新機(jī)制，并揭示DNMT1可能是HCC化療新靶點。Wang等[30]結(jié)果表明下調(diào)組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Setd7可以降低核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和Nrf2-靶基因的表達(dá)，以及苯乙基異硫氰酸酯(PEITC)和UA誘導(dǎo)Setd7表達(dá)，激活Nrf2/抗氧化反應(yīng)元素(ARE)信號通路并保護(hù)DNA免受氧化損傷來抑制人前列腺癌細(xì)胞生長。

7 細(xì)胞毒性作用

熊果酸對腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用，通過結(jié)合補體抗體介導(dǎo)。Junco等[31]發(fā)現(xiàn)熊果酸對皮膚癌細(xì)胞毒性作用有顯著影響，是通過AMPK和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)途徑起作用。Shen等[32]發(fā)現(xiàn)，UA組成的兩親性自組裝納米藥物，由乳酸菌酸(LA)和低聚氨基胺(low-PAMAM)樹突狀大分子構(gòu)成。結(jié)果表明，該近球形納米藥物對肝癌SMMC7721細(xì)胞有增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，并有可能在無毒濃度下通過抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)，降低SMMC7721細(xì)胞的遷移和粘附。此外，體內(nèi)研究表明，納米藥物具有延長血液循環(huán)時間的作用同時增加AUC、MRT、Cmax，能有效抑制H22小鼠模型腫瘤生長?？傊?，UA的納米藥物傳遞系統(tǒng)，為靶向腫瘤治療提供一種新的策略。

8 抑制血管生成

血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)支持。抑制腫瘤血管生成是一種全新的靶向治療策略，可以最大限度地控制和殺滅腫瘤。Wu等[33]發(fā)現(xiàn)熊果酸及其衍生物下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)，通過抑制其合成，降低血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

9 抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲

惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征是轉(zhuǎn)移和侵襲，也是臨床病人死亡的主要原因。熊果酸具有抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的作用。Ruan等[34]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸顯著減弱了轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF- β1)誘導(dǎo)的E-鈣粘蛋白水平的降低和N-鈣粘蛋白水平的升高。此外，熊果酸抑制H1975細(xì)胞中的間充質(zhì)樣反應(yīng)，包括細(xì)胞遷移、侵襲和基質(zhì)金屬肽酶(MMP)-2和-9的活性。熊果酸可通過TGF-β1信號通路介導(dǎo)的整合素αVβ5表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，這可能是熊果酸抑制NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。熊果酸減弱了H1975細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，可能是有希望治療NSCLC的藥物。

10 結(jié) 語

總之，上述研究結(jié)果表明，熊果酸具有顯著抑制多種腫瘤療效，但熊果酸抗腫瘤作用的分子機(jī)制涉及到對不同的基因和細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞周期的變化，并且這些調(diào)節(jié)作用相互交叉，共同產(chǎn)生抑制腫瘤的作用。

熊果酸通過多因素、多環(huán)節(jié)相互作用發(fā)揮抑制腫瘤作用。然而，熊果酸難溶于水，且劑型較為單一，口服藥物的生物利用率較低，限制了其在臨床抗腫瘤方面的進(jìn)一步應(yīng)用[35]。近期文獻(xiàn)報道，Jin等[12]制備裝載UA的殼聚糖納米顆粒(CH-UA-NPs)具有抗血管生成和抗腫瘤作用。這種合成CH-UA-NPs可以節(jié)省大約10倍的UA劑量，這意味著可以顯著降低高劑量UA對人體的引起的藥物不良反應(yīng)。Wang等[36]研究表明，熊果酸納米粒子抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)，這可能是一個潛在未來臨床治療策略。