周 靜，何志偉，簡善軍，顧 菁，闕 挺

甲狀腺癌是臨床上最為常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病年齡相對較低，多發(fā)生于40～60歲之間，且表現(xiàn)有明顯的性別差異，女性群體約占所有患者總數(shù)的75%[1]。甲狀腺癌的來源與類型多種多樣，根據(jù)病理分型，又可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌及髓樣癌，其中乳頭狀癌最為常見，占總患者群體的80%以上，且近年來的發(fā)生率持續(xù)攀升[2-4]。乳頭狀甲狀腺癌往往分化較好，有著良好的預后，外科手術(shù)是乳頭狀甲狀腺癌治療的首選方式。據(jù)研究統(tǒng)計，局限性的乳頭狀腺癌首次實施腺葉切除后對側(cè)腺葉的復發(fā)率約為7%[5]。nm23-H1是20世紀研究人員在小鼠的黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的一組基因，可以通過介入GDP與GTP之間的轉(zhuǎn)化調(diào)控微管蛋白，進而影響腫瘤細胞的增殖和黏附性，在多種腫瘤疾病如肺癌、乳腺癌等中的作用均得到了深入的研究[6-7]。HBME-1作為一種間質(zhì)上皮細胞抗體被認為在甲狀腺腫瘤中具有重要的診斷價值，可以與間質(zhì)上皮細胞表面的糖蛋白特異性結(jié)合，作用于腫瘤細胞的血管生成、細胞周期與遷移[8]。本研究通過回歸性分析的方式，對就診于我院的甲狀腺癌患者術(shù)后病理標本進行nm23-H1和HBME-1水平的相關(guān)檢測，以探究2種指標在乳頭狀甲狀腺癌診斷和預后中的應用價值。

1 資料與試劑

1.1一般資料 選取2010年1月—2018年1月就診于我院，并行外科手術(shù)治療的乳頭狀甲狀腺癌患者90例，術(shù)后病理均明確診斷。其中男34例，女56例；腫瘤直徑1 cm以上48例；年齡(48.67±5.42)歲，50歲以上38例，50歲以下52例；伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者10例，未伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者80例；臨床分期Ⅰ期27例，Ⅱ期38例，Ⅲ期和Ⅳ期25例。①納入標準：術(shù)中活檢結(jié)果提示乳頭狀甲狀腺癌診斷明確；一般臨床資料齊全，患者病理樣本儲備良好；存檔有術(shù)后2年以上的復查記錄；術(shù)前未接受放射治療、化學治療等。②排除標準：合并有其他原發(fā)腫瘤患者；合并尿毒癥、嚴重心肺功能不全等其他重癥患者；術(shù)后其他因素導致的死亡患者；

1.2實驗試劑 nm23-H1與HBME-1的一抗、二抗均購自丹麥Dako公司。蛋白提取試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司，BCA定量試劑盒、Trizol裂解液、ECL發(fā)光試劑盒、PCR擴增、逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑盒均購自德國Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1Western Blot法處理癌組織和癌旁組織：對所有乳頭狀甲狀腺癌患者的癌組織和癌旁組織進行nm23-H1與HBME-1蛋白的測定。量取100 mg組織樣本，反復使用裂解液和蛋白酶抑制劑沖洗裂解6次，每次持續(xù)5 s，靜置片刻后，4℃條件下離心處理，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 000 r/min，離心15 min后收集上清液。使用BCA試劑盒，將組織上清液濃度定量為5 μg/μl，上樣電泳，電壓設(shè)置為70 V，時長90 min，隨后轉(zhuǎn)膜。加入脫脂奶粉封閉，加入一抗在保溫箱處理過夜，TBST洗膜。加入二抗處理，其中nm23-H1二抗稀釋比例1∶2000，HBME-1稀釋比例1∶4000。室溫輕搖孵育90 min，最后ECL化學發(fā)光法顯影。

1.3.2RT-PCR法處理癌組織和癌旁組織：對所有乳頭狀甲狀腺癌患者的癌組織和癌旁組織進行nm23-H1與HBME-1的mRNA測定。量取100 mg組織樣本，勻漿機研磨后加入Trizol裂解液，從樣品中分離總RNA。使用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增。nm23-H1上游引物：5'-CCAGACGGACCTCGGCAGTCG-3'，下游引物：5'-CACCGGCAGCAGGCTGCAG-3'；HBME-1上游引物：5'-GAATGTGAGCATGGACTTGG-3'，下游引物：5'-ACGTGGGGTCCCAGAAGT-3'；擴增反應在LC480熱循環(huán)儀上一式雙份進行。nm23-H1與HBME-1的基因表達使用相對定量模型進行效率校正，對個體的組織表達進行單獨定量，將個體樣品的相對表達值設(shè)置為100%。

2 結(jié)果

2.1癌組織與癌旁組織中nm23-H1和HBME-1的蛋白與mRNA表達水平 癌組織中nm23-H1和HBME-1的蛋白與mRNA表達水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1和圖1。

表1 乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織與癌旁組織中nm23-H1和HBME-1蛋白與mRNA表達水平比較

圖1 乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織與癌旁組織中nm23-H1和HBME-1的蛋白與mRNA定量分析

2.2癌組織nm23-H1表達與病理特征的關(guān)系 癌組織的nm23-H1蛋白和mRNA表達水平與乳頭狀甲狀腺癌患者的腫瘤直徑、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有相關(guān)性，其中腫瘤直徑>1 cm、伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ和Ⅳ期患者的nm23-H1蛋白和mRNA表達水平更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而癌組織的nm23-H1蛋白和mRNA表達水平與乳頭狀甲狀腺癌患者的年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織nm23-H1表達與病理特征的關(guān)系

2.3癌組織HBME-1的表達與病理特征的關(guān)系 癌組織的HBME-1蛋白和mRNA表達水平與乳頭狀甲狀腺癌患者的腫瘤直徑、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有相關(guān)性，其中腫瘤直徑>1 cm、伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ和Ⅳ期患者的HBME-1蛋白和mRNA表達水平更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。而癌組織HBME-1蛋白和mRNA表達水平與乳頭狀甲狀腺癌患者的年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織HBME-1的表達與病理特征的關(guān)系

2.4乳頭狀甲狀腺癌術(shù)后復發(fā)患者癌組織nm23-H1和HBME-1表達比較 本次研究中2年內(nèi)復發(fā)患者8例，復發(fā)率為8.89%。復發(fā)患者的nm23-H1和HBME-1蛋白與mRNA表達水平均顯著高于未復發(fā)患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 復發(fā)與非復發(fā)乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織nm23-H1和HBME-1表達比較

3 討論

盡管乳頭狀甲狀腺癌在臨床上發(fā)生的頻率較高，約占所有惡性腫瘤的1/30，但是由于分化程度高，所以相較于其他腫瘤，具有預后良好的突出特點，外科治療后的復發(fā)率也較低。本次研究中選取的90例乳頭狀甲狀腺癌患者中2年內(nèi)共有8例出現(xiàn)復發(fā)，復發(fā)率為8.89%，該結(jié)果與相關(guān)研究較為接近[5]。另一方面，由于乳頭狀甲狀腺癌病灶小且隱匿，而且患者往往無任何明顯的臨床表現(xiàn)，一般很難在早期及時發(fā)現(xiàn)，常常是出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移才被確診。由于在臨床上缺乏靈敏的分子標記物協(xié)助診斷以及術(shù)后對患者復發(fā)可能性進行評估。為此，本研究通過回歸性分析的方式，使用更為精確的Western Blot和RT-PCR方法，對乳頭狀甲狀腺癌患者術(shù)后的病理標本進行nm23-H1和HBME-1表達水平的相關(guān)檢測，以探究其在乳頭狀甲狀腺癌診斷和預后評估中的應用價值。

本研究結(jié)果顯示，在癌組織中nm23-H1的蛋白與mRNA表達水平均高于癌旁組織，提示在癌細胞中nm23-H1存在著突出表達。且這種突出表達可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著某種因果聯(lián)系。病理特征相關(guān)性研究中，腫瘤直徑>1 cm、伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ和Ⅳ期患者癌組織中nm23-H1蛋白與mRNA表達水平也更高，驗證了nm23-H1與腫瘤惡化程度的正相關(guān)性。Zhang等[9]通過免疫組織化學、Western Blot和 RT-PCR等方法監(jiān)測nm23-H1在小鼠和人類中的動態(tài)表達，使用siRNA屏蔽了nm23-H1基因的表達后，人類和小鼠胚胎干細胞的增殖與分化都出現(xiàn)了明顯降低，證實了nm23-H1在細胞增殖分化中存在促進作用，并提出該作用是通過PI3K-Akt-mTOR途徑實現(xiàn)的。在肺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，nm23-H1也被證明能夠促進惡性病灶的持續(xù)進展[10]。在本研究復發(fā)患者與非復發(fā)患者的比較中發(fā)現(xiàn)，復發(fā)患者nm23-H1的蛋白與mRNA表達水平均顯著高于未復發(fā)患者。提示nm23-H1的蛋白與mRNA表達水平高的患者復發(fā)率也可能越高。

關(guān)于HBME-1在甲狀腺癌診斷中的應用，早在21世紀初就有研究人員使用免疫組織化學染色得出陽性總體準確率為77.2%的結(jié)論，提出HBME-1免疫組織化學染色在臨床上可能有助于篩查濾泡狀癌高復發(fā)風險的病例，并且良性腺瘤病例需要密切隨訪[11]。本研究結(jié)果顯示，在癌組織中HBME-1的蛋白與mRNA表達水平均顯著高于癌旁組織，提示在乳頭狀甲狀腺癌細胞中HBME-1存在著突出表達。另外，腫瘤直徑>1 cm、伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ和Ⅳ期患者癌組織中HBME-1表達水平更高，而且復發(fā)患者HBME-1的蛋白與mRNA表達水平均顯著高于未復發(fā)患者。提示HBME-1水平的高表達同樣預示著乳頭狀甲狀腺癌的高復發(fā)風險。

綜上所述，nm23-H1和HBME-1的表達水平與乳頭狀甲狀腺癌的臨床病理特征具有相關(guān)性，腫瘤直徑大、分期高、伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的nm23-H1和HBME-1表達水平更高，其高表達提示不良預后。故nm23-H1和HBME-1檢測對于臨床上乳頭狀甲狀腺癌的診斷和預后評估具有一定的參考價值。