華曉敏 王昌明

桂林醫(yī)學(xué)院附屬桂林市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科541002

通信作者:王昌明,Email:13607731185@163.com

肺纖維化是一種以持續(xù)上皮細(xì)胞損傷和過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix,ECM)沉積為主要病理特征的慢性纖維增生性疾病[1]。肺纖維化主要是肺組織受損后修復(fù)調(diào)節(jié)失控、重建異常所引起的病變,在這一過(guò)程中,一系列細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)異常、炎癥反應(yīng)、血管增生和重建、纖維蛋白溶解障礙及外界環(huán)境等因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激都參與肺纖維化的發(fā)病過(guò)程,由此造成上皮細(xì)胞缺損、成纖維細(xì)胞增生和ECM 沉積等主要病變,最終結(jié)果是成纖維細(xì)胞替代了行使正常功能的肺泡上皮細(xì)胞,導(dǎo)致了纖維化的發(fā)生[2]。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞分泌膠原、促進(jìn)ECM 的沉積,在肺纖維化形成過(guò)程中起著重要作用[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是重要的促纖維化因子,TGF-β1可以促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化,進(jìn)而導(dǎo)致ECM 的沉積[4]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5(extracellular signal-regulated protein kinase-5,ERK5)是一種促分裂原活化蛋白激酶,與細(xì)胞存活、抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化有關(guān)[5]。本研究通過(guò)建造肺纖維化細(xì)胞模型和動(dòng)物模型,探討ERK5在肺纖維化中的作用及其可能的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肺成纖維細(xì)胞 (human lung fibroblasts,HLFs)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào):KCB200695)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱條件為5%CO2、37 ℃。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要試劑 重組人TGF-β1(2μg粉劑)購(gòu)于美國(guó)Pepro Tech 公司。ERK5 抑制劑BIX02189 (5 mg粉劑)購(gòu)于美國(guó)Selleck 生物科技有限公司。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco FBS-10099-141)、1%雙抗 (青霉素及鏈霉素)、0.25%含EDTA 胰酶 (Trypsin)購(gòu)于美國(guó)Gibco 公 司。ERK5、α-平 滑 肌 肌 動(dòng) 蛋 白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、p62、LC3Ⅱ、Beclin-1一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的二抗購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TGF-β1誘導(dǎo)HLFs表型轉(zhuǎn)化 用濃度為10μg/L的TGF-β1 作用24 h 誘導(dǎo)肺纖維化細(xì)胞模型。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot) 采用Western blot分析從TGF-β1 處理組與對(duì)照組中提取的表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志性蛋白Fibronectin和α-SMA 的表達(dá)。收集細(xì)胞后加入RIPA 裂解液,在冰上裂解30 min后離心提取蛋白質(zhì),用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE 電泳、壓片后進(jìn)行條帶灰度值量化分析。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光 采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TGF-β1處 理 組 和 對(duì) 照 組 細(xì) 胞 中Fibronectin 和α-SMA的表達(dá)量。HLFs 在24 孔板中培養(yǎng),經(jīng)TGF-β1處理24 h后固定細(xì)胞30 min,通透15 min,封閉1 h,孵育一抗和熒光二抗,經(jīng)過(guò)核染色后用抗熒光衰減封片劑封片,在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 q RT-PCR 檢測(cè)BIX02189 的最佳作用濃度 BIX02189按 照 濃 度 梯 度0、1、2、5、10、15μmol/L作用于HLFs,培養(yǎng)后利用Trizol 提取細(xì)胞RNA,純化后酶標(biāo)儀定量,進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄和ERK5引物PCR擴(kuò)增,進(jìn)行ERK5的定量分析。

1.3.5 自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、p62、Beclin-1 和α-SMA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為DMSO 組、BIX02189組、DMSO+TGF-β1 組、BIX02189+TGF-β1 組、BIX02189+TGF-β1+3-MA 組 和3-MA 對(duì) 照 組。Western blot分析各組細(xì)胞中自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、p62、Beclin-1和表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志因子α-SMA的表達(dá)。1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠24只,雄性,6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)于湖南斯克萊景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SCXK 桂2013-0001。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要試劑 注射用鹽酸博來(lái)霉素(1.5萬(wàn)U/支)購(gòu)于翰輝制藥有限公司,用3 ml注射用生理鹽水稀釋為濃度5 g/L。ERK5 抑制劑BIX02189 (5 mg粉劑)購(gòu)于美國(guó)Selleck 生物科技有限公司,按照2% DMSO+30% PEG300+5% Tween 80+dd H2O 的比例配置溶劑,用1.135 ml溶劑稀釋粉劑為10 mmol/L溶液。ERK5、α-SMA、LC3Ⅱ一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的二抗購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組(NS組)、博來(lái)霉素模型組(BLM 組)、BIX02189治療組(BT組)和BIX02189對(duì)照組(BC組),每組6只。1.6.2 建造肺纖維化動(dòng)物模型 參照文獻(xiàn) [6-7],BT 組于造模當(dāng)日一次性氣管內(nèi)滴注50μl博來(lái)霉素3.5 mg/kg,造模前2 h 腹腔注射10 mg/kg BIX02189 100μl,自第3 日起隔日注射等量BIX02189;BC組氣管內(nèi)滴注50μl生理鹽水,腹腔注射10 mg/kg BIX02189 100μl;BLM 組氣管內(nèi)滴注3.5 mg/kg博來(lái)霉素50μl,腹腔注射生理鹽水;NS組氣管內(nèi)、腹腔內(nèi)均注射生理鹽水。

1.6.3 觀察小鼠一般狀態(tài)及肺組織改變 觀察各組小鼠體型變化、進(jìn)食量的差別、活躍程度差別及有無(wú)呼吸急促等情況。將小鼠麻醉后,稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。開胸后觀察小鼠肺部大小、顏色及質(zhì)地變化。取出全肺,用去離子水清洗后吸干水分,稱量全肺的重量并記錄,計(jì)算小鼠肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.6.4 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 飼養(yǎng)28 d后,用7%水合氯醛(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上,從下腹部開始剪開皮膚,逐層暴露,腹主動(dòng)脈放血,逐漸向上剪開直至暴露氣管,先用手術(shù)線結(jié)扎右主支氣管,然后切斷氣管,鈍性分離肺組織與其他軟組織。從氣管內(nèi)緩慢注入4%多聚甲醛使左肺充盈,用夾子夾閉左主支氣管,將左右肺分離。左肺組織放入已盛有4%多聚甲醛的標(biāo)本瓶中,固定24 h后送去病理科做切片進(jìn)行Masson染色和HE 染色。右肺組織用錫紙包好后放入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.5 Western blot檢測(cè)小鼠肺組織中ERK5、α-SMA、LC3Ⅱ的表達(dá) 從-80 ℃冰箱取出組織放入研缽里,倒入適量液氮,用研磨錘不斷研磨,直至組織成粉末狀,將組織放入2 ml離心管中,加入1 ml組織裂解液 (PMSF∶RAPI=1∶100),在冰上超聲裂解后提取蛋白質(zhì),定量后進(jìn)行SDSPAGE電泳,同前述Western blot步驟,最終進(jìn)行條帶灰度值量化分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x-±s表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn),多組資料比較時(shí)采用單因素方差分析,各組資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布、方差齊者兩兩比較采用S-N-K 法分析,方差不齊者采用Dunnett t 3檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)HLFs表型轉(zhuǎn)化 Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,TGF-β1 處理組Fibronectin和α-SMA 的蛋白表達(dá)量明顯增加 (圖1、2);細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到經(jīng)TGF-β1 處理后胞質(zhì)中Fibronectin 和α-SMA 蛋白表達(dá)量增加 (圖3、4)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)對(duì)照組和TGF-β1 處理組人肺成纖維細(xì)胞中Fibronectin的表達(dá)

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)對(duì)照組和TGF-β1 處理組人肺成纖維細(xì) 胞 中α-SMA 的 表 達(dá)

圖3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)對(duì)照組和TGF-β1 處理組人肺成纖維細(xì)胞中Fibronectin的表達(dá)

2.2 ERK5抑制劑通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制α-SMA的表達(dá) qRT-PCR 在m RNA 水平檢測(cè)ERK5 抑制劑最佳作用濃度為15 μmol/L (圖5)。BIX02189+TGF-β1組 較DMSO+TGF-β1組p62蛋白表達(dá)量降低,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)量增加,表明細(xì)胞自噬增強(qiáng);α-SMA 蛋白表達(dá)量減弱,表明細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化受到抑制。而應(yīng)用自噬抑制劑后的BIX02189+TGF-β1+3-MA 組 較BIX02189+TGF-β1組α-SMA 的表達(dá)量增加,表明自噬受到抑制后促進(jìn)了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化(圖6)。

2.3 小鼠一般狀態(tài)及肺組織改變 NS組和BC組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好,精神狀態(tài)良好,呼吸平穩(wěn),食欲佳,有活力。BLM 組和BT 組小鼠一般狀態(tài)不好,體型較另外兩組小,精神狀態(tài)差,呼吸急促,進(jìn)食減少,缺乏活力。但BT 組較BLM 組小鼠狀態(tài)稍好。麻醉后解剖小鼠,可見NS組和BC 組小鼠肺組織顏色紅潤(rùn),質(zhì)地柔軟,表面光滑飽滿。BLM 組和BT 組小鼠肺組織顏色蒼白,質(zhì)地較硬,表面凹凸不平。BLM 組肺系數(shù)明顯高于NS 組(P ＜0.01),BT 組肺系數(shù)較BLM 組降低 (P ＜0.01),BC 組與NS 組肺系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

圖5 qRT-PCR 檢測(cè)BIX02189最佳作用濃度

圖6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組p62、LC3Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達(dá)

圖7 各組小鼠肺系數(shù)的比較

2.4 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE 染色顯示NS組無(wú)明顯炎癥及纖維化特征;BC組與NS組無(wú)明顯差別,可見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作手法引起的肺組織局部炎癥反應(yīng);BLM 組肺泡壁明顯增寬,可見大量膠原纖維增生,肺實(shí)變明顯,并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);BT 組上述病理情況較BLM 組減輕,可見灶狀的纖維化區(qū)域,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少 (圖8)。Masson染色顯示NS組、BC 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整,可能是注入4%多聚甲醛固定時(shí)不夠輕柔導(dǎo)致肺泡壁破裂,肺泡間隔未見增厚,僅有少量藍(lán)色膠原纖維沉積;BLM 組小鼠可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積,顏色較深,彌漫性纖維組織形成;BT 組較BLM 組肺泡間隔變窄,藍(lán)色的膠原纖維沉積量減少,纖維化程度減輕(圖9)。2.5 各組小鼠肺組織中ERK5和α-SMA、LC3Ⅱ的表達(dá) NS組小鼠ERK5蛋白有表達(dá),BC 組小鼠ERK5蛋白較NS 組降低,BLM 組小鼠ERK5蛋白表達(dá)量較NS組升高,BT 組小鼠ERK5蛋白表達(dá)量較BLM 組降低(圖10)。BLM 組小鼠肺組織中α-SMA 的蛋白表達(dá)量明顯高于NS組,BT 組和BC 組小鼠肺組織中α-SMA 的蛋白表達(dá)量較BLM 組明顯降低;BLM 組小鼠肺組織中LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量明顯低于NS 組,BT 組和BC 組較BLM 組LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量升高(圖11)。

圖8 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE ×200 A:生理鹽水對(duì)照組;B:博來(lái)霉素模型組;C:BIX02189 治療組;D:BIX02189對(duì)照組

圖9 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) Masson ×200 A:生理鹽水對(duì)照組;B:博來(lái)霉素模型組;C:BIX02189 治療組;D:BIX02189對(duì)照組

圖10 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組小鼠肺組織中ERK5表達(dá)

圖11 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組小鼠肺組織中α-SMA 和LC3Ⅱ表達(dá)

3 討論

成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是肺纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié),Fibronectin和α-SMA 的高表達(dá)常被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的特有標(biāo)志,所以檢測(cè)Fibronectin和α-SMA 的表達(dá)量可有效反映成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化,即成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化情況[8]。根據(jù)課題組的前期研究成果,TGF-β1可成功誘導(dǎo)體外肺纖維化細(xì)胞模型,因此本研究直接選取TGF-β1的最佳作用濃度和時(shí)間處理HLFs,通過(guò)Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到Fibronectin和α-SMA 的表達(dá)量增加,證明成功誘導(dǎo)HLFs的表型轉(zhuǎn)化。

Beclin-1在自噬的啟動(dòng)階段發(fā)揮了重要作用,介導(dǎo)自噬起始[9];LC3Ⅱ參與自噬溶酶體膜的延伸和自噬溶酶體的形成[10];p62 在自噬形成的過(guò)程中不斷被消耗[11]。所以,本研究通過(guò)檢測(cè)這3 個(gè)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量來(lái)反映自噬情況。在HLFs中,抑制ERK5 的表達(dá),Western blot 檢測(cè)到LC3Ⅱ與Beclin-1的表達(dá)水平增加,p62表達(dá)水平降低,可以在一定程度上說(shuō)明ERK5 抑制劑可促進(jìn)自噬,而ERK5 是起到抑制自噬的作用;抑制ERK5的表達(dá),Western blot檢測(cè)到成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白α-SMA 表達(dá)水平下降,說(shuō)明ERK5參與了TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上,對(duì)ERK5 抑制劑組應(yīng)用自噬抑制劑后,LC3Ⅱ與Beclin-1的表達(dá)水平降低,p62和α-SMA表達(dá)水平升高,說(shuō)明自噬受到抑制,并且促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的分化,所以筆者考慮,ERK 抑制劑可以抑制成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化,并且此作用很有可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬而實(shí)現(xiàn)的。但是自噬的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,僅通過(guò)幾個(gè)表型因子的檢測(cè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠解釋其調(diào)控的機(jī)制,若要得出ERK5通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)影響成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的結(jié)論,需要更深入、具體的研究,這也是本課題組未來(lái)的研究方向。

在肺成纖維細(xì)胞構(gòu)建的肺纖維化細(xì)胞模型中探究了表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志因子及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與ERK5的關(guān)系后,開始進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證ERK5的調(diào)控是否與在人的細(xì)胞模型中一致,所以利用經(jīng)典的博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的造模方法構(gòu)建纖維化模型,通過(guò)腹腔注射ERK5 抑制劑的方法干預(yù)治療,觀察小鼠的一般狀態(tài)及肺組織改變,進(jìn)而檢測(cè)檢測(cè)小鼠肺組織中α-SMA 和LC3Ⅱ的表達(dá)變化,來(lái)說(shuō)明ERK5 抑制劑對(duì)肺纖維化程度的改變和對(duì)自噬的影響。氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素是肺纖維化小鼠造模的經(jīng)典方法,本課題組的前期研究成果表明,在博來(lái)霉素所致的大鼠肺纖維化模型中,α-SMA、波形蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)增加,促進(jìn)ECM 的沉積[12]。通過(guò)對(duì)各組小鼠肺組織病理切片的分析及α-SMA 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)可知,治療組與模型組相比,炎癥程度和纖維化程度較輕,α-SMA 蛋白表達(dá)水平下降,LC3Ⅱ表達(dá)水平升高,這與在細(xì)胞模型中檢測(cè)到的變化一致。所以,ERK5抑制劑可在一定程度上改善小鼠肺纖維化,并且ERK5抑制劑對(duì)自噬有一定的促進(jìn)作用。但是若要明確ERK5抑制劑通過(guò)促進(jìn)自噬改善肺纖維化及其分子機(jī)制,還需要進(jìn)一步的研究及更深入的實(shí)驗(yàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突