駱曉婷 曾奕明

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 福建省呼吸醫(yī)學(xué)中心,泉州362000

通信作者:曾奕明,Email:zeng_yi_ming@126.com

選擇性支氣管封堵術(shù)治療難治性氣胸是通過封堵材料阻斷引流支氣管,使破口停止漏氣、加速愈合來實(shí)現(xiàn)[1]。支氣管封堵后胸膜瘺口一般在4～7 d愈合,較大的瘺口可延長(zhǎng)至14 d。因此,理想的封堵劑應(yīng)維持完整的凝膠狀態(tài)達(dá)14 d以上。纖維蛋白凝膠是一種潛在的封堵劑,具有許多良好的生物學(xué)特性,如可塑性、可黏附性、生物組織相容性、生物可降解性,且抗原性小,不誘發(fā)炎癥反應(yīng),并有促進(jìn)新生血管生成及局部組織修復(fù)的作用。但纖維蛋白凝膠在體外環(huán)境不能穩(wěn)定存在,在體內(nèi)環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞可釋放相關(guān)物質(zhì)使纖溶酶原激活,加上體內(nèi)某些生物介質(zhì)及炎癥細(xì)胞的作用,其降解速度加快,這就限制了其在臨床上的應(yīng)用。如何配制穩(wěn)定性好的纖維蛋白凝膠是本研究擬探索的問題,因此本研究中選擇臨床上常用的纖溶酶抑制劑抑肽酶和氨甲環(huán)酸,通過在體外制備不同特性的纖維蛋白凝膠,探討不同濃度抑肽酶或/和氨甲環(huán)酸對(duì)凝膠溶解過程的影響,期待獲得穩(wěn)定的、降解速度可調(diào)控的纖維蛋白凝膠,以便更好地應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 材料 恒溫震蕩水槽 (型號(hào)DZK-1,上海一恒科技有限公司);纖維蛋白原 (上海翊圣生物科技有限公司);無水氯化鈣 (西隴化工股份有限公司);凝血酶凍干粉(湖南一格制藥有限公司);抑肽酶(上海生物工程有限公司);氨甲環(huán)酸注射液(湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司);精確至0.01 ml的一次性使用無菌注射器(碧迪醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法 采用37 ℃的0.9%氯化鈉注射液于37 ℃恒溫水槽中溶解纖維蛋白原配置成15 g/L的纖維蛋白原溶液備用。采用常溫的0.9%氯化鈉注射液分別配制無水氯化鈣、凝血酶、抑肽酶及氨甲環(huán)酸。無水氯化鈣濃度為145 mmol/L;凝血酶濃度為100 IU/ml;抑肽酶分為3組:15 000 kIU/ml(A 組)、20 000 kIU/ml(B 組)、25 000 kIU/ml(C 組);氨甲環(huán)酸分為3 組:10 g/L (Ⅰ組)、30 g/L (Ⅱ組)、50 g/L (Ⅲ組)。各取上述配制好的A、B、C 3種濃度抑肽酶或Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種濃度氨甲環(huán)酸0.1 ml與凝血酶0.5 ml、氯化鈣溶液0.1 ml、0.9%氯化鈉注射液0.1 ml,于EP 管中充分混勻?yàn)榛旌弦?與5 ml纖維蛋白原溶液分別使用注射器向試管中同時(shí)注入,充分混勻形成纖維蛋白凝膠。設(shè)立未添加抑制劑對(duì)照組。將各組凝膠置于37 ℃的恒溫水槽中,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各8管。

選取抑肽酶25 000 kIU/ml與氨甲環(huán)酸50 g/L各0.1 ml,與凝血酶溶液0.5 ml、氯化鈣溶液0.1 ml于EP 管中混合均勻成混合液,與5 ml纖維蛋白原溶液按上述同樣方法制備纖維蛋白凝膠,并標(biāo)記聯(lián)合組為U,總共8 管,各管凝膠均置于37 ℃的恒溫水槽中。

每隔24 h 觀察凝膠溶解情況,用精確至0.01 ml的一次性注射器將已溶解的液體移出并測(cè)量每管的溶解體積,計(jì)算剩余體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件協(xié)助完成。每日平均剩余體積采用平均值表示,重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析,不符合球形性檢驗(yàn)則采用Greenhouse-Gesisser進(jìn)行校正,采用LSD分析進(jìn)行組間多重比較。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度抑肽酶對(duì)纖維蛋白凝膠溶解速度的影響 各組凝膠每日剩余體積及溶解時(shí)間不同,對(duì)照組的溶解時(shí)間為5 d,A 組、B 組、C 組的溶解時(shí)間分別為13、19、20 d (表1)。通過重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)不同濃度抑肽酶凝膠的總體溶解趨勢(shì)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同濃度抑肽酶對(duì)凝膠溶解速度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =502.379,P ＜0.05)。各組每日剩余體積經(jīng)組間多重比較,對(duì)照組與A組、B組、C組比較,A 組與B組、C 組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05);B組與C 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見,高濃度的抑肽酶可增強(qiáng)纖維蛋白凝膠的穩(wěn)定性,在同一濃度纖維蛋白原中,抑肽酶＜20 000 kIU/ml,酶濃度的增加可延緩溶解速度,而抑肽酶＞25 000 kIU/ml,凝膠溶解速度無明顯變化。

2.2 不同濃度氨甲環(huán)酸對(duì)纖維蛋白凝膠溶解速度的影響 對(duì)照組的溶解時(shí)間為5 d,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的溶解時(shí)間分別為7、8、9 d (表1)。通過重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)不同濃度氨甲環(huán)酸凝膠的總體溶解趨勢(shì)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同濃度氨甲環(huán)酸對(duì)凝膠溶解速度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =632.235,P ＜0.05)。各組每日剩余體積經(jīng)組間多重比較,對(duì)照組與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組比較,Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅲ組比較,Ⅱ組與Ⅲ組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05)。由此可見,在同一濃度纖維蛋白原中,高濃度的氨甲環(huán)酸均可增強(qiáng)纖維蛋白凝膠的穩(wěn)定性,氨甲環(huán)酸濃度增加可延緩凝膠的溶解速度。

2.3 抗纖溶劑聯(lián)合與單用對(duì)凝膠溶解速度影響 各組凝膠每日剩余體積及溶解時(shí)間不同,C組、Ⅲ組、U 組的溶解時(shí)間分別為20、9、31 d(表2)。通過重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)凝膠的總體溶解趨勢(shì)進(jìn)行比較,可見抑肽酶+氨甲環(huán)酸聯(lián)合與單用抑肽酶或氨甲環(huán)酸對(duì)凝膠溶解速度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F 值分別為366.417、262.533,P 值均＜0.05)。由此可見,聯(lián)合抑肽酶+氨甲環(huán)酸延緩纖維蛋白凝膠溶解的作用優(yōu)于單用抑肽酶或氨甲環(huán)酸。

3 討論

難治性氣胸是呼吸科常見疾病之一。筆者前期研究[2]報(bào)道了采用自體血+凝血酶進(jìn)行支氣管封堵,成功率達(dá)82.4%。國(guó)外亦有采用纖維蛋白原+凝血酶成功治療膿胸引起的支氣管胸膜瘺的成功案例[3]。二者的本質(zhì)均為利用纖維蛋白凝固形成的膠狀物對(duì)引流支氣管或胸膜瘺進(jìn)行封堵。與支氣管塞相比,纖維蛋白凝膠短時(shí)間內(nèi)能自行降解吸收,對(duì)瘺口起到臨時(shí)性的封堵,避免二次支氣管鏡操作進(jìn)行支氣管塞回收。因此,制備穩(wěn)定性良好的纖維蛋白凝膠在封堵治療中具有重要意義。有學(xué)者[4]研究發(fā)現(xiàn)加入抗纖溶劑均可增強(qiáng)凝膠的穩(wěn)定性。因此,本實(shí)驗(yàn)通過改變抑肽酶及氨甲環(huán)酸的濃度,在一定范圍內(nèi)調(diào)控纖維蛋白凝膠的溶解速度。

在體內(nèi)凝固的纖維蛋白的溶解過程關(guān)鍵在纖溶酶原轉(zhuǎn)化為具有活性的纖溶酶。纖溶酶是一種肽鏈內(nèi)切酶,能在p H 值約為7的環(huán)境中水解纖維蛋白(原)的賴氨酸和精氨酸肽鏈,使其降解為纖維蛋白原降解產(chǎn)物。在體外環(huán)境雖不存在血管內(nèi)皮細(xì)胞可釋放物質(zhì)使纖溶酶原激活,但纖維蛋白凝膠仍不能穩(wěn)定存在。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組纖維蛋白原濃度均固定,對(duì)照組未加入抗纖溶劑,溶解速度較快,在5 d內(nèi)完全溶解,穩(wěn)定性欠佳;實(shí)驗(yàn)組中加入抗纖溶劑,維持凝膠狀態(tài)的時(shí)間明顯延長(zhǎng),溶解速度呈現(xiàn)延緩趨勢(shì),可見高濃度的抑肽酶、氨甲環(huán)酸均可增強(qiáng)纖維蛋白凝膠的穩(wěn)定性,延緩凝膠的溶解過程。

表1 各組纖維蛋白凝膠每日溶解情況 (ml)

表2 抗纖溶劑聯(lián)合與單用凝膠每日溶解情況 (ml)

抑肽酶抑制作用的激活位點(diǎn)是蛋白酶的絲氨酸殘基,主要通過與纖溶酶等多種絲氨酸蛋白酶結(jié)合形成抑肽酶-蛋白酶復(fù)合物,競(jìng)爭(zhēng)性抑制纖溶酶的活性,抑制程度取決于抑肽酶與纖溶酶的相對(duì)親和力及纖維蛋白濃度。有臨床研究[5-7]發(fā)現(xiàn)使用抑肽酶后,纖溶酶原激活物減少,纖溶酶原激活抑制因子增加,ɑ-2抗纖溶酶-纖溶酶水平、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、D-二聚體水平降低,而纖維蛋白原維持較高的水平,證明其明顯抑制纖溶過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑肽酶可抑制纖維蛋白凝膠溶解,增強(qiáng)其穩(wěn)定性,與Coffin 和Gauuette[8]的研究結(jié)果相符。當(dāng)抑肽酶濃度＜20 000 kIU/ml時(shí),隨著抑肽酶濃度增加,凝膠溶解速度減慢,存在量效關(guān)系,與本研究小組前期得到的結(jié)果[9]相近。而當(dāng)抑肽酶濃度＞20 000 kIU/ml時(shí),凝膠溶解速度無明顯變化,呈現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。其主要原因是體外環(huán)境下蛋白水解酶的量有限,當(dāng)抑肽酶濃度達(dá)到一定程度時(shí)(本實(shí)驗(yàn)為20 000 k IU/ml),抑肽酶與蛋白水解酶的結(jié)合已達(dá)到飽和現(xiàn)象,發(fā)揮抑制纖維蛋白降解的最大作用,此時(shí)繼續(xù)增加抑肽酶,也不再增強(qiáng)其延緩凝膠降解的作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),隨著氨甲環(huán)酸濃度的增加,纖維蛋白凝膠的穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng),溶解速度減慢,呈線性關(guān)系。氨甲環(huán)酸則通過競(jìng)爭(zhēng)性地封閉纖維蛋白親和部位的賴氨酸結(jié)合部位,減少纖溶酶原的吸附率,從而減少纖溶酶原的激活,保護(hù)纖維蛋白不被降解和溶解,且能直接抑制纖溶酶的活性,減少纖溶酶激活補(bǔ)體的作用。Sitek等[10]認(rèn)為氨甲環(huán)酸作為一種抗纖維蛋白溶解劑,可替代抑肽酶增強(qiáng)纖維蛋白凝膠的穩(wěn)定性。而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,氨甲環(huán)酸維持凝膠狀態(tài)的時(shí)間較抑肽酶短,溶解速度降低程度小于抑肽酶,抑制凝膠溶解的效果仍不如抑肽酶。

在本研究中與單用抑肽酶或氨甲環(huán)酸相比,二者聯(lián)合應(yīng)用使溶解反應(yīng)速率明顯降低,提示聯(lián)合抑肽酶+氨甲環(huán)酸可顯著延緩凝膠的降解速度,與Meinhart等[11]和張力等[12]的研究結(jié)果相符。抑肽酶及氨甲環(huán)酸是臨床常用的抗纖溶藥,二者均通過減少纖溶酶原的激活、抑制纖溶酶的活性而起到抗纖溶作用,但抑制作用的位點(diǎn)各不相同:抑肽酶作用于蛋白酶的絲氨酸殘基,氨甲環(huán)酸作用于蛋白酶賴氨酸結(jié)合位點(diǎn),因此考慮二者聯(lián)合作用下可增加抑制纖維蛋白凝膠降解的作用。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取濃度為25 000 kIU/ml的抑肽酶和濃度為50 g/L的氨甲環(huán)酸作為聯(lián)合抗纖溶劑制備纖維蛋白凝膠,可維持9 d不溶解、第14天仍有90%左右纖維蛋白膠體維持凝固狀態(tài),可滿足臨床選擇性支氣管封堵治療難治性氣胸的需要。

綜上所述,在選擇性支氣管封堵術(shù)中,可在纖維蛋白凝膠中加入抗纖溶劑,增強(qiáng)凝膠穩(wěn)定性,起到較長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械封堵的作用。不同濃度抑肽酶及氨甲環(huán)酸對(duì)纖維蛋白凝膠的溶解過程的影響有明顯差異,在臨床應(yīng)用過程中可根據(jù)實(shí)際需要改變抑肽酶及氨甲環(huán)酸的濃度,對(duì)凝膠溶解曲線進(jìn)行干預(yù),以便更好地應(yīng)用于實(shí)際工作。但本實(shí)驗(yàn)纖維蛋白凝膠的制作均在體外環(huán)境下進(jìn)行,與體內(nèi)環(huán)境是否存在差異,需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突