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微衛(wèi)星DNA標記評估湛江光裸星蟲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

2020-12-28 02:42姚澤彬姚維彭錦勝王慶恒郭昱嵩
南方農(nóng)業(yè)·上旬 2020年11期
關(guān)鍵詞:遺傳多樣性

姚澤彬 姚維 彭錦勝 王慶恒 郭昱嵩

摘? ?要? ?為評估湛江地區(qū)光裸星蟲養(yǎng)殖群體的種質(zhì)現(xiàn)狀,利用11對熒光標記微衛(wèi)星引物對光裸星蟲的1個野生群體和2個養(yǎng)殖群體,每個群體取30~31個樣本進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,11 個微衛(wèi)星位點在不同群體呈現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性,野生群體和2個養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)(Na)在4.182~4.636,平均有效等位基因數(shù)(Ne)在2.447~2.632,平均觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)分別在0.442~0.471、0.525~0.536,平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.461~0.475。Hardy-Weinber 平衡分析顯示,3 個群體的大部分位點未偏離平衡。在每個群體中進行連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)有4對位點間顯著(P<0.05)或者極顯著(P<0.01)偏離連鎖平衡。分子方差分析(AMOVA)顯示,光裸星蟲大部分的變異來自于群體內(nèi)而非群體間。綜合分析認為,本研究采集的2個光裸星蟲養(yǎng)殖群體遺傳多樣性豐富,暫未出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞? ?光裸星蟲;遺傳多樣性;微衛(wèi)星標記

中圖分類號:S932? ?文獻標志碼:A? ? DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.31.001

光裸星蟲(Sipunculus nudus L.,1766),隸屬于方格星蟲綱(Sipunculidea)方格星蟲目(Sipunculiformes)方格星蟲科(Sipunculidae)方格星蟲屬(Sipunculus),俗稱“沙蟲”,生長于溫帶及熱帶水域的潮間帶,以沙粒間的底棲藻類、有機碎屑等為食,在中國沿海均有分布。光裸星蟲營養(yǎng)成分豐富,味道鮮美,高蛋白、低脂肪,具有較高的食用價值[1],但自然采捕難度大,且過度采捕、海區(qū)污染、灘涂破壞等威脅光裸星蟲的種質(zhì)資源[2],自然采捕已經(jīng)難以滿足市場的長期需求。近年,光裸星蟲的人工養(yǎng)殖日益成熟[3-7],然而,養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展常會因無序引種、苗種異地交易等導(dǎo)致種質(zhì)資源混雜,進而影響遺傳多樣性的長期穩(wěn)定。因此,有必要對人工養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性進行監(jiān)測和評估。

光裸星蟲的遺傳多樣性研究目前主要集中在對分子標記和線粒體DNA的應(yīng)用上,王慶恒等運用RAPD技術(shù)對4個光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性進行研究,發(fā)現(xiàn)不同地理群體存在較大的遺傳分化[8]。郭昱嵩等利用微衛(wèi)星DNA分子標記分析了北部灣3個光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性,得出“群體間存在較大的基因流、已產(chǎn)生較低水平的遺傳分化”的結(jié)論[9]。Du等利用線粒體COⅠ序列分析了3個地理野生群體的遺傳多樣性差異,認為光裸星蟲目前具有較高的遺傳多樣性和獨特的種群結(jié)構(gòu)[10]。彭銀輝等基于線粒體控制區(qū)序列開展了6個地理野生群體光裸方格星蟲的遺傳多樣性研究,發(fā)現(xiàn)遺傳分化在群體間并不顯著,光裸方格星蟲具有較高的遺傳多樣性,且不同地理群體存在頻繁的基因交流[11]。周于娜等利用線粒體控制區(qū)序列分析了光裸星蟲不同地理野生群體和不同地理養(yǎng)殖群體的遺傳差異情況,認為養(yǎng)殖群體光裸星蟲的遺傳多樣性略低于野生群體,養(yǎng)殖群體正在逐漸積累遺傳變異[12]。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),又稱簡單序列重復(fù)(SSR,simple sequence repeat),是1~6個堿基串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、引物通用性較好和共顯性遺傳等特點,是研究群體遺傳學(xué)的常用手段。目前,運用微衛(wèi)星標記研究光裸星蟲遺傳多樣性的報道較少。

本研究運用科研團隊自主開發(fā)的SSR標記,篩選出多態(tài)性高的標記對光裸星蟲3個群體的遺傳多樣性進行檢測,并以野生群體作為參考群體來評估養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性,從而為光裸星蟲種質(zhì)資源保護和合理利用提供參考依據(jù),還可為養(yǎng)殖光裸星蟲的種苗優(yōu)劣評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及DNA提取

實驗用野生光裸星蟲采集自湛江遂溪縣下六鎮(zhèn)(遂溪野生群體,SX)的自然灘涂。2個湛江養(yǎng)殖群體分別采集自湛江碧海灣水產(chǎn)有限公司樂民繁育基地(樂民養(yǎng)殖群體,LM)和廣東海洋大學(xué)覃斗(覃斗養(yǎng)殖群體,TD)試驗基地。參照文獻[13]的苯酚/氯仿抽提法,稍作修改后用于提取光裸星蟲基因組DNA,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用凝膠成像儀進行觀察,估算DNA的濃度和純度。

1.2 微衛(wèi)星序列的引物篩選

本實驗中項目組自主開發(fā)20對光裸星蟲微衛(wèi)星引物[14],委托上海生工生物工程有限公司合成。將合成好的微衛(wèi)星引物進行群體初篩選,篩選實驗用20個隨機個體,提取DNA后對所有引物進行預(yù)擴增,根據(jù)預(yù)擴增的結(jié)果篩選出11對多態(tài)性引物(見表1)。預(yù)擴增體系與程序如下:PCR預(yù)擴增總體系為10 μL,包含DNA模板0.5 μL,上下游引物(5 μmol·L-1)各0.5 μL,PCR Mix 5 μL,剩余體積用ddH2O 補齊至10 μL。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性80 s;94 ℃

30 s,退火(溫度依據(jù)引物而定)30 s,72 ℃ 45 s,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離,銀染顯色,以出現(xiàn)清晰主帶為標準,篩選出多態(tài)性引物和每對引物最適退火溫度,等位基因大小以 20 bp DNA Ladder Marker為參照標準進行判讀。

1.3 PCR擴增及微衛(wèi)星檢測

委托上海生工生物工程有限公司合成熒光引物,用于光裸星蟲3個群體樣本的擴增,每個群體30~32個個體。

PCR擴增體系為25 μL,包含DNA模板2 μL,上下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL,Taq酶0.125 μL,10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5 μL,dNTPs (2.2 mmol·L-1) 2 μL,剩余體積用ddH2O 補齊至25 μL。每個微衛(wèi)星標記隨機抽取4個PCR產(chǎn)物進行檢測,用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,然后放入凝膠成像儀中觀察,檢測PCR產(chǎn)物是否正常。將檢測到無異常的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進行毛細管電泳檢測,檢測儀器為3730XL序列分析儀(ABI公司,美國)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GenAlEx 6.503軟件對生物公司反饋的基因片段長度等數(shù)據(jù)進行遺傳分析,計算11個位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、等位基因數(shù)(Na) 、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、Hardy-Weinberg平衡檢驗、固定指數(shù)(Fis)、群體間遺傳距離(DA)、遺傳相似系數(shù)(I)和分子方差分析(AMOVA)。利用PIC-CAL0.6軟件計算每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(PIC)。利用PopGen32軟件對每個群體的連鎖不平衡進行檢測。無效等位基因用Micro-checker軟件進行分析。群體間基于Nei's遺傳距離的聚類樹使用MEGA-X軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物的篩選

篩選實驗結(jié)果顯示,微衛(wèi)星多態(tài)位點有11個,其余9個為單態(tài)位點。所篩選出來的11對多態(tài)性引物的特征見表1。

2.2 等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)

3個光裸星蟲群體的11個微衛(wèi)星標記均表現(xiàn)出多態(tài)性,由表2可知,3個群體中,遂溪野生群體的平均Na和平均Ne均最低,為4.182個和2.447個;樂民養(yǎng)殖群體的平均Na最高,為4.636個;覃斗養(yǎng)殖群體的平均Ne最高,為2.632個。

2.3 遺傳雜合度、Hardy-Weinberg平衡與連鎖不平衡

表2數(shù)據(jù)顯示,3個群體的平均觀測雜合度Ho和期望雜合度He的范圍分別在0.442~0.471和0.525~0.536,其中,平均Ho遂溪野生群體最大,為0.471,樂民養(yǎng)殖群體最小,為0.442;覃斗養(yǎng)殖群體的平均He在3個群體中最大,為0.536,另外2個群體的平均He均為0.525。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗,在3個群體11個多態(tài)微衛(wèi)星位點中大部分未偏離平衡狀態(tài)(P>0.05),每個群體均有4個位點偏離平衡狀態(tài)(P<0.05),其中Snu06、Snu07和Snu20位點在3個群體中均偏離平衡,Snu05位點在2個養(yǎng)殖群體偏離平衡狀態(tài),Snu19位點在野生群體偏離平衡。在每個群體中進行連鎖不平衡分析,結(jié)果表明4對位點間顯著(P<0.05)或者極顯著(P<0.01)偏離連鎖平衡;在樂民養(yǎng)殖群體中有2對連鎖不平衡(Snu05/Snu19、Snu07/Snu13),野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體均只出現(xiàn)1對相同的連鎖不平衡(Snu7/Snu19)。

2.4 多態(tài)信息含量(PIC)與無效等位基因

3個群體11個微衛(wèi)星位點的平均PIC在0.461~0.475,遂溪野生群體最小,2個養(yǎng)殖群體相對較大。Micro-checker檢測發(fā)現(xiàn),Snu07、Snu19和Snu20位點在3個群體中均存在無效等位基因,Snu05位點在2個養(yǎng)殖群體中存在無效等位基因,其余位點在各個群體中均不存在無效等位基因。

2.5 群體間遺傳分化分析

利用GenAlEx 6.503軟件計算得到了3個群體間的Nei遺傳距離(DA)和遺傳相似系數(shù)(I)(見表3)。樂民養(yǎng)殖群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最大,I最小;遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最小,I最大。3個群體間的DA為0.020~0.034。根據(jù)Nei遺傳距離采用鄰接法和UPGMA 法對3個群體進行聚類分析,結(jié)果顯示遂溪野生群體和樂民養(yǎng)殖群體聚為一支,覃斗養(yǎng)殖群體為一支(見圖1,僅列出鄰接圖)。

種群的遺傳分化系數(shù)(Fst)表明種群遺傳分化的水平,F(xiàn)st在0~0.05表明種群遺傳分化很弱,F(xiàn)st在0.05~0.15表明種群遺傳分化處于中等水平,F(xiàn)st在0.15~0.25表明種群遺傳分化較大,F(xiàn)st大于0.25表明種群遺傳分化很大。本研究中方格星蟲3個群體的Fst在0.008~0.012,均不顯著。AMOVA分析表明,99%的遺傳變異源于群體內(nèi),群體間的遺傳變異僅占1%(見表4)。

3 討論

遺傳雜合度(H)是指微衛(wèi)星位點為雜合子的比例,可反映各群體在多個位點上的遺傳變異,是描述群體遺傳變異的一個重要指標。群體H高,表明該群體的遺傳變異多,群體遺傳多樣性高[15]。郭昱嵩等在2012年報道了北部灣三個光裸星蟲野生群體的遺傳多樣性[9],我們用與該研究相同的11個多態(tài)性位點對其平均雜合度進行矯正,得到湛江烏石群體的平均Ho、平均He分別為0.458、0.500,北海山口群體的平均Ho、平均He分別為0.471、0.484,越南錦普群體的平均Ho、平均He分別為0.484、0.532。矯正后的數(shù)據(jù),本研究遂溪野生群體的平均Ho和平均He略高于郭昱嵩等報道的湛江烏石野生群體,2個養(yǎng)殖群體的平均Ho和平均He除了樂民群體的平均Ho低于烏石群體外,其他均略高于烏石群體,但差異很小,這表明光裸星蟲遂溪群體的遺傳變異程度目前仍處于較高水平。

多態(tài)信息含量(PIC)反映了微衛(wèi)星標記所包含的遺傳信息含量。在一個群體中該雜合子的比例越大,PIC值越大,該雜合子提供的遺傳信息越多。根據(jù)Botstein等[16]提出的標準,本研究的11個多態(tài)性位點中有4個高度多態(tài)性位點(PIC>0.5)、6個中度多態(tài)性位點(0.25

遺傳距離(DA)的大小可以用來確定群體之間的親緣關(guān)系,群體間的DA與親緣關(guān)系呈正比,與遺傳相似度(I)呈反比。DA越大,表明群體間的親緣關(guān)系越遠,I越小;反之亦然[17]。本研究采用11個微衛(wèi)星位點對3個光裸星蟲群體進行遺傳多樣性分析,根據(jù)Nei's指數(shù)法對光裸星蟲3個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析,結(jié)果顯示遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體之間的I最大(0.980)、DA最小(0.020),鄰接法和UPGMA法聚類分析為一支。遺傳分化指數(shù)(Fst)是指群體內(nèi)的變異位點在群體位點中所占的比值,比值越大,群體遺傳分化程度越高,本研究中光裸星蟲3個群體間的Fst值在0.008~0.012,均小于0.05,3個群體均分化較小[18],這可能與養(yǎng)殖群體為遂溪野生群體繁育的后代有關(guān)。AMOVA分析表明,群體間的變異僅1%,提示群體內(nèi)的遺傳變異是引起種群總體變異的主要因素。這與光裸星蟲海球幼體時期浮游生活相吻合,因為這增加了群體間的基因交流,導(dǎo)致群體間的變異程度遠不如群體內(nèi)部??偟膩碚f,光裸星蟲養(yǎng)殖群體和野生群體之間分化很小,養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化,這與周于娜等[12]報道的結(jié)果相似。

整體而言,本研究篩選的11個微衛(wèi)星位點具有較高的多態(tài)性,適用于3個光裸星蟲群體的遺傳多樣性研究。研究結(jié)果表明遂溪野生群體與2個養(yǎng)殖群體的各項遺傳多樣性參數(shù)之間總體上差異不大,群體間分化水平較低,光裸星蟲養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象,這與現(xiàn)階段光裸星蟲大群體親本育苗、沙蟲苗養(yǎng)殖群體沙灘放養(yǎng)等養(yǎng)殖模式吻合。但是,近年來海洋環(huán)境污染特別是海灘垃圾污染導(dǎo)致的灘涂破壞有加重趨勢[19-21],加上人為無序引種、苗種異地交易等,可能會進一步導(dǎo)致光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平下降,因此保護光裸星蟲種質(zhì)資源已經(jīng)刻不容緩。我們認為只有加強對海洋垃圾源頭的控制,定期檢測光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平,同時推廣科學(xué)合理的養(yǎng)殖模式,才能保護好光裸星蟲資源,達到星蟲資源的可持續(xù)利用。

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(責(zé)任編輯:丁志祥)

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