鐘光躍 黃平 楊敏 歐軍 鐘守生 李華雄

摘? ?要? ?月季品種繁多，是我國的傳統(tǒng)名花，其與原種薔薇雜交頻繁、芽變頻率較高，特別是現(xiàn)代技術(shù)讓月季與不同種屬植物遠(yuǎn)緣雜交獲得成功，使月季的形態(tài)特征發(fā)生了巨大的變化?？茖W(xué)分類對月季資源收集、品種評價(jià)、育種、推廣、利用具有指導(dǎo)作用。月季資源分類鑒定的方法很多，有園藝分類法、數(shù)量分類法、花粉形態(tài)分類法、同工酶分類法、染色體核型分類法、分子標(biāo)記分類法等。單一方法的分類結(jié)果都不理想，只有多種分類法結(jié)合使用，才能使分類結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。簡述月季分類研究歷史及進(jìn)展，分析各種分類方法的優(yōu)缺點(diǎn)，提出以形態(tài)分類為主、分子標(biāo)記為輔的月季分類方法是最合理的方法，并建議將月季分類方法統(tǒng)一、過程規(guī)范化，制定一套月季分類規(guī)程，建立一部嚴(yán)格的月季分類標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞? ?月季;分類;歷史;形態(tài)分類;數(shù)量分類;分子標(biāo)記

中圖分類號：S685.12? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.31.019

月季（Rosa chinensis Jacq.）屬薔薇科薔薇屬灌木植物，具有色彩絢麗、花型多樣、觀賞期長等優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜愛，是我國的傳統(tǒng)名花[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)代月季品種有2萬多個(gè)，我國就有1 000多個(gè)[2]。月季具有芽變頻率高、與原種薔薇雜交頻繁的特點(diǎn)，特別是近現(xiàn)代育種學(xué)家通過現(xiàn)代育種手段讓月季與不同種屬植物遠(yuǎn)緣雜交獲得成功，使得月季的形態(tài)特征發(fā)生了巨大的變化。月季品種分類是研究月季的基礎(chǔ)，對資源收集、品種評價(jià)、育種、利用、推廣具有指導(dǎo)作用。本文簡述了月季分類研究的歷史和進(jìn)展，介紹了月季分類方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，提出了以形態(tài)分類為主、分子標(biāo)記分類為輔的月季分類法是最合理的方法，并建議將月季分類方法統(tǒng)一，過程標(biāo)準(zhǔn)化。

1 月季資源分類歷史

1.1 基于遺傳歷史的分類

Wylie A.P.于1954年、1955年分別對月季的歷史進(jìn)行了系統(tǒng)研究，將1800年定為月季發(fā)展的分界時(shí)間，1800年以前的月季品種屬于傳統(tǒng)月季，此類月季包括歐洲的突厥薔薇、法國薔薇、百葉薔薇、長春花、寶相花、月月紅、四季花等，此類月季沒有經(jīng)過種間和屬間雜交;1800年以后，中國月季傳入西方，與歐洲薔薇反復(fù)雜交形成觀賞價(jià)值高且四季開花的月季新品種，俗稱現(xiàn)代月季，包括雜交茶香月季和多花月季的各大類群[3]，從此開辟了現(xiàn)代月季的新篇章。1966年，美國月季協(xié)會定義1867年之前的薔薇屬品種群（包括變種）稱為古老月季，1867年第一個(gè)雜交茶香月季出現(xiàn)以后培育的品種群為現(xiàn)代月季[4]，并將月季細(xì)分為37個(gè)小類，稱ARS分類系統(tǒng)。而后，英國皇家月季協(xié)會對ARS分類系統(tǒng)進(jìn)行簡化，細(xì)分類群縮減到30個(gè)，稱BARB分類法[5]。早期的遺傳分類主要依靠形態(tài)觀察，體現(xiàn)的是月季品系間的血緣關(guān)系和進(jìn)化過程，是月季分類的第一階層，但對于品系間、種屬間和遠(yuǎn)緣雜交的新品種很難判斷。

1.2 基于生活習(xí)性和外部特征的分類

1976年由英國皇家月季協(xié)會提出和修訂，并于1979年在南非比勒陀利亞會議上獲得批準(zhǔn)的園藝分類法至今在沿用，其將月季分為6大類[6]。世界月季聯(lián)合會按園藝分類法將月季分為野生薔薇、古代月季和現(xiàn)代月季三大類，每一大類又按照生活習(xí)性、是否藤本、是否連續(xù)開花、花朵大小、花朵是否簇生進(jìn)行細(xì)分，古代月季細(xì)分為13小類，而現(xiàn)代月季分為8小類[7]，稱之為WFRS分類法。園藝分類法在很長一段時(shí)間作為月季權(quán)威分類法而被各國學(xué)者廣泛采用。

1.3 基于現(xiàn)代科學(xué)的分類

隨著月季育種技術(shù)的提高，種間甚至屬間雜交新品種越來越多，經(jīng)常會出現(xiàn)傳統(tǒng)分類的中間類型，怎樣劃分新資源、新品種的歸屬問題日趨復(fù)雜。借助現(xiàn)代科學(xué)輔助分類，是近現(xiàn)代月季分類學(xué)研究的重點(diǎn)，也是熱點(diǎn)。如基于數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法的數(shù)量分類法，基于遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)發(fā)展的花粉形態(tài)分類法、同工酶分類法、分子標(biāo)記分類法等?，F(xiàn)代分類方法豐富了月季分類的內(nèi)容，克服了傳統(tǒng)分類法受環(huán)境變化而不準(zhǔn)確的弱點(diǎn)，更客觀地反映月季的屬性。

2 月季分類方法

2.1 園藝分類法

園藝分類法是以月季進(jìn)化過程中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、生活習(xí)性、觀賞價(jià)值等綜合評價(jià)而進(jìn)行的分類。我國花卉協(xié)會沿用的分類法主要是WFRS分類法。對觀賞植物來說，園藝性狀是種以下分類的重要依據(jù)，它直觀地反映植物的演化關(guān)系。

2.2 形態(tài)分類法

2.2.1 數(shù)量分類法

形態(tài)分類以其簡單直觀、快捷方便的特點(diǎn)最早為人們所認(rèn)識和接受，是其他分類方法的基礎(chǔ)[8]。數(shù)量分類學(xué)則將形態(tài)性狀編碼，進(jìn)行數(shù)學(xué)方法分析，研究從定性升級到定量水平。數(shù)量分類方法可以綜合分析多種生態(tài)性狀，得出客觀系統(tǒng)的分類結(jié)果。這種方法不僅能進(jìn)行植物分類，還能測定種質(zhì)間的親緣關(guān)系，以及物種進(jìn)化的效率等，已廣泛應(yīng)用在植物分類學(xué)中[9]。數(shù)量分類根據(jù)分析性狀的多少，可采取不同的數(shù)學(xué)分析方法，對單一性狀的評價(jià)，一般采用方差多重比較法，它操作過程簡單、分析程式化、結(jié)論明晰，是目前最普遍的評價(jià)方法;對多個(gè)性狀的評價(jià)最常用的是系統(tǒng)聚類法，其原理核心是將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化處理，使不同性狀量綱也能進(jìn)行綜合比較和分析，是比較理想的處理方法;另外還有基于數(shù)學(xué)模型的模糊數(shù)學(xué)法和灰色系統(tǒng)理論法、基于層次權(quán)重的層次分析法和百分制計(jì)分法等[10-11]。我國科學(xué)家在月季的數(shù)量分類領(lǐng)域做過很多研究，李寶忠選取36個(gè)月季形態(tài)性狀，花部指標(biāo)定為分類的第一級標(biāo)準(zhǔn)，枝部指標(biāo)定為第二級標(biāo)準(zhǔn)，葉部綜合指標(biāo)定為第三級標(biāo)準(zhǔn)，然后將這些主要性狀進(jìn)行Q型聚類分析，結(jié)果24個(gè)月季品種可分為5大類型[2]。于守超以種源作為第一級分類標(biāo)準(zhǔn)，以花徑、花色等為第二級分類標(biāo)準(zhǔn)，以枝色、枝刺作為第三級分類標(biāo)準(zhǔn)，初步建立了玫瑰品種的3系5類10型分類體系[12]。李東麗等對月季花朵顏色、株高等8個(gè)主要表型性狀進(jìn)行分析，將306份月季種質(zhì)資源分為5組[13]。數(shù)據(jù)分析中，可以先對性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析或R型聚類分析，剔除不穩(wěn)定性狀和與分類無關(guān)的性狀，并從極顯著相關(guān)的每一組中只選取一個(gè)易于觀測的性狀參與分析，避免分析數(shù)據(jù)的繁瑣性和重復(fù)性，節(jié)約觀察記錄時(shí)間。不同性狀在植物分類上的貢獻(xiàn)是有主次之分的，對主要性狀進(jìn)行加權(quán)處理顯得尤為重要。對性狀進(jìn)行分析，終究要將性狀描述翻譯成數(shù)學(xué)語言，即數(shù)字，怎樣確定性狀的編碼數(shù)值最終會影響到分類結(jié)果。數(shù)量分類法因性狀取舍、性狀編碼、分析方法的不同，分類結(jié)果也會不同，對同一性狀觀察的時(shí)期和時(shí)間不同，記錄的結(jié)果也會不同。若要數(shù)量分類法具有可重復(fù)性和統(tǒng)一性，必須制定一套月季數(shù)量分類規(guī)程，規(guī)定取樣性狀，統(tǒng)一性狀編碼，規(guī)范操作流程，使試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化。對植物外部形態(tài)的觀察記錄受光照強(qiáng)度、日照時(shí)間、土壤、空氣溫度和濕度、病蟲害等環(huán)境因素影響，僅針對植株形態(tài)性狀進(jìn)行數(shù)量分類比較片面，分類結(jié)果存在誤差，數(shù)量分類法與傳統(tǒng)分類法結(jié)合才更合理。

2.2.2 孢粉形態(tài)分類法

花粉的形態(tài)特征受植物基因型控制而不受外界條件影響，具有很強(qiáng)的遺傳保守性，可以為植物系統(tǒng)分類學(xué)提供依據(jù)，是探討植物起源、演化及親緣關(guān)系的重要特征[3]。孢粉學(xué)是研究植物孢子和花粉形態(tài)的一門邊緣學(xué)科，主要涉及花粉及孢子的壁，而對孢子和花粉的內(nèi)含物研究很少。王文莉等對玫瑰花粉進(jìn)行了電鏡掃描，采用聚類分析將24個(gè)平陰玫瑰花粉分為玫瑰系和薔薇系兩大類，發(fā)現(xiàn)玫瑰外壁紋飾可作為玫瑰品種鑒別的依據(jù)[14]。賈元義通過花粉性狀分析將20個(gè)品種分為5大類型，花粉性狀中溝長、條脊寬、P/E、赤道軸長、紋飾類型、脊洼深度這幾個(gè)指標(biāo)比較重要，其次是極軸長、溝間距、條脊距、溝深等級、D/L、赤道面觀、L/P和孔徑等級，而孔頻等級和極面觀所占的系數(shù)很小[3]。孫佳等通過孢粉特征將微型月季分為外壁條紋和網(wǎng)眼密集型、外壁條紋密集網(wǎng)眼較少型、外壁條紋和網(wǎng)眼較少型[15-16]。一些學(xué)者對花粉的其他性狀也開展了研究：石俊英等利用電泳技術(shù)對月季花粉進(jìn)行分析[17];利用不同月季品種之間的花粉活力不同進(jìn)行月季品種分類[18];楊攀等測定不同月季花粉生活力，并根據(jù)花粉萌發(fā)率將30個(gè)月季品種分成3個(gè)等級[19]。孢粉學(xué)分類結(jié)果和外部形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本相同，但也有細(xì)微差異，孢粉性狀畢竟有限，只憑孢粉性狀的差異還不能精確地將月季分類[20]。

2.3 染色體核型分類

薔薇屬核型分類主要是研究DNA的倍性和形態(tài)。薔薇屬染色體基數(shù)為x=7，且染色體倍性復(fù)雜多樣，從二倍體到八倍體都有[21]，月季發(fā)現(xiàn)有二倍體、三倍體、四倍體、六倍體[22-24]。古代薔薇都是2倍體，進(jìn)而進(jìn)化成多倍體。薔薇中有5套染色體類型（A、B、C、D、E），每套中含有7對不同的染色體，不同染色體攜帶有不同的基因群，據(jù)此可以將月季按染色體類型進(jìn)行分類。至今報(bào)道的月季染色體類型有1A、2A、1B、2B[22，25]，大部分品種的核型均由其中部和近中部著絲點(diǎn)染色體組成，少數(shù)種具近端著絲點(diǎn)染色體[26]。另外，月季染色體在核不對稱系數(shù)、著絲粒指數(shù)、隨體數(shù)目及位置、染色體相對長度組成等方面差異較大，說明在月季種質(zhì)資源中存在著豐富的核型多樣性，可以作為分類的依據(jù)[27]。遺傳物質(zhì)染色體的性狀變異是新品種形成的基礎(chǔ)，在現(xiàn)代月季育種過程中遠(yuǎn)緣雜交和反復(fù)回交使得月季染色體在數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了許多變化。月季核型性狀雖然存在多樣性，能追溯其來源及演化過程，但是核型性狀與月季外形性狀沒有必然的聯(lián)系，只能為月季的分類提供參考。

2.4 同工酶分類法

植物個(gè)體的性狀是由基因決定的，而基因在植物生長發(fā)育過程中的表達(dá)需要通過器官或組織同工酶來完成。同工酶譜表現(xiàn)的是基因表達(dá)后的分子水平表型，其類型和含量的變化先于植物形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，是形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的前因[28]。同工酶譜可以直接反映對應(yīng)基因的存在和表達(dá)與否，是一種十分有效的遺傳標(biāo)記方法。賈元義等通過電泳檢測出了月季的8條過氧化物酶同工酶譜帶，將18個(gè)月季品種分成5類，其分類結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果有一定的差別[29]。劉承源研究了27份月季資源的過氧化物酶同工酶譜帶，發(fā)現(xiàn)不同月季種質(zhì)間存在一定同源性，同時(shí)也有較大差異;通過聚類分析，將種質(zhì)資源分為3大類[30]。同工酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，有很高的穩(wěn)定性，然而植株器官中的同工酶類型及含量是隨生長發(fā)育進(jìn)程變化的[31]，又具有不穩(wěn)定性，要擬定嚴(yán)格的取樣標(biāo)準(zhǔn)和操作程序，才能獲得準(zhǔn)確的可重復(fù)的研究結(jié)果。

2.5 分子標(biāo)記法

2.5.1 RFLP

Hubbard等采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism） 技術(shù)鑒定了3個(gè)來源不同的月季品種[32]。Ballard等對22個(gè)月季栽培品種進(jìn)行了RFLP分析，鑒定出其中20個(gè)月季品種[33]。Majapakse用RFLP技術(shù)進(jìn)行了月季品種鑒別，并建立了分子數(shù)據(jù)庫，為月季品種分類和專利保護(hù)提供了基礎(chǔ)[34]。RFLP法DNA用量大，提取DNA費(fèi)時(shí)費(fèi)工，成本高，操作程序多，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，檢測中需要放射性同位素，不利于實(shí)驗(yàn)操作人員的身體健康。目前，此項(xiàng)技術(shù)總體來說在國內(nèi)應(yīng)用得較少，究其原因是RFLP技術(shù)缺點(diǎn)太明顯，而且我國分子標(biāo)記研究起步較晚，RFLP已被更簡便的分子標(biāo)記技術(shù)所取代。

2.5.2 RAPD

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD，Random Amplified Polymorphism DNA）是在酶和隨機(jī)引物的作用下對DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨機(jī)引物是人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸系列，通常為10個(gè)堿基對，然后通過DNA圖譜分析擴(kuò)增片段的差異[35]。最早通過RAPD技術(shù)研究月季的是Torres，區(qū)分出了5種月季品種[36]。RAPD 標(biāo)記在月季的基因遺傳分析中是一種靈敏、準(zhǔn)確的工具，適合建立月季染色體連鎖圖譜[37]。郭立海通過RAPD技術(shù)將5個(gè)月季品種及5個(gè)家系準(zhǔn)確地鑒別開來，但對每個(gè)家系內(nèi)親本和后代的鑒別十分困難[38]。最近，李玉潔以中國古老月季的新鮮幼葉為試材，進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記反應(yīng)擴(kuò)增體系的優(yōu)化，通過優(yōu)化后的RAPD-PCR反應(yīng)體系獲得了清晰、穩(wěn)定、條帶多的電泳圖;用40個(gè)RAPD引物在22個(gè)中國古老月季品種中共擴(kuò)增出321個(gè)條帶，在遺傳距離為0.627 9時(shí)可將22個(gè)中國古老月季品種劃分成兩大類[39-40]。RAPD技術(shù)具有簡單、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合分析大量群體，但其缺點(diǎn)是引物篩選工作量大，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差和多態(tài)性不足。

2.5.3 SSR

簡單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR，Simple Sequence Repeats）是使用PCR擴(kuò)增簡單重復(fù)DNA片段，通過電泳中檢測SSR圖譜的多態(tài)性，原理是植物基因組中有一類特殊的由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位的DNA片段，其兩端含有穩(wěn)定單拷貝堿基序列，將SSR兩端堿基序列設(shè)計(jì)成特定的引物，可對SSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增[41]。SSR是近年來在植物資源研究中應(yīng)用最多的鑒定方法。我國學(xué)者邱顯欽等利用優(yōu)化體系對部分月季品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，擴(kuò)增結(jié)果清晰且有較高的多態(tài)性，表明該體系適用于月季的遺傳多樣性分析;并對云南省主要分布的8種大花月季居群的遺傳性進(jìn)行分析，將14個(gè)野生月季品種分為6個(gè)群[42]。黃平運(yùn)用SSR標(biāo)記研究不同月季資源，得出近似結(jié)論[43]。張非亞、邱彤、楊旭等通過SSR標(biāo)記花色分類[44-46]。SSR標(biāo)記法成本低，程序簡單易操作，多態(tài)性高，但是引物的設(shè)計(jì)和篩選比較困難。

2.5.4 AFLP

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP，Amplified Fragment Length Polymorphism）的基本原理是通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，其擴(kuò)增片段多態(tài)性強(qiáng)。AFLP可用于形態(tài)差異不明顯的品種鑒定，能將品種從其半同胞和全同胞品種中鑒別出來，但變種與其原種的AFLP差異不大[47]。Rajapakse采用AFLP技術(shù)建立了兩張4倍體月季的遺傳連鎖圖譜[48]。Leus對88個(gè)月季野生種和栽培品種做了AFLP分析，證明在野生種和栽培品種間存在較大的差異[49]。Anne對魁北克特有的2個(gè)月季品種進(jìn)行了AFLP分析，表明這2個(gè)月季品種與另一分布廣泛的月季品種實(shí)屬同種[50]。王開錦對薔薇屬50個(gè)種/變種進(jìn)行AFLP分析，表明變異程度隨物種表現(xiàn)出明顯差異[51]。AFLP具有多態(tài)性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，操作程序繁瑣、步驟多，要求很高的實(shí)驗(yàn)技能和精密的儀器設(shè)備，技術(shù)成本高，且需要放射性同位素的標(biāo)記檢測。

分子標(biāo)記分類直接以核酸作為研究對象，在植物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可檢測，不受季節(jié)和環(huán)境的限制，與發(fā)育時(shí)期無關(guān)，這一點(diǎn)優(yōu)于形態(tài)分類;分子標(biāo)記數(shù)量極多，且多態(tài)性高，這一點(diǎn)優(yōu)于細(xì)胞學(xué)分類;基因表現(xiàn)為中性，不受目標(biāo)性狀表達(dá)與否的限制，這一點(diǎn)優(yōu)于同工酶法分類。

3 展望

我國月季資源豐富、類群多樣、品種繁多，但至今缺乏統(tǒng)一的分類和命名準(zhǔn)則，給月季的分類、鑒定和育種工作帶來了困難。隨著月季資源的不斷發(fā)現(xiàn)和育種技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是遠(yuǎn)緣雜交的成功率增大，種間、亞種間、屬間遺傳物質(zhì)交叉滲透，新類群、新品種層出不窮，單一傳統(tǒng)的園藝分類法已不能適應(yīng)現(xiàn)代月季的分類和鑒定研究了。分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性強(qiáng)，分析結(jié)果穩(wěn)定，不受環(huán)境的影響，是月季分類鑒定中強(qiáng)有力的輔助手段，已廣泛應(yīng)用于月季親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定中[52]，其準(zhǔn)確性和可靠性依賴選定DNA片段的代表性和數(shù)量。輔以分子標(biāo)記的形態(tài)分類法應(yīng)是月季分類鑒定研究的方向。選取一定數(shù)量的形態(tài)性狀并編碼，作為分類研究的規(guī)定性狀;選取一種分子標(biāo)記并規(guī)定所用引物，將試驗(yàn)程序標(biāo)準(zhǔn)化，以此建立一套嚴(yán)格的月季分類標(biāo)準(zhǔn)。建立表型性狀數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)和分子指紋圖譜，將植物鑒定結(jié)果長期分類保存，以供瀏覽和比對。新分類標(biāo)準(zhǔn)的建立，將對月季資源收集和新品種的鑒定起到直接促進(jìn)作用;對判斷資源的親緣關(guān)系和育種起到輔助作用，對新品種栽培技術(shù)的制定起到指導(dǎo)作用。相信經(jīng)過科學(xué)家的篩選和試驗(yàn)，一定能制定出一套科學(xué)的分類標(biāo)準(zhǔn)，助推月季資源的鑒定、分類、利用工作。

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（責(zé)任編輯：易? 婧）