楊明霞，連紅娟，王曉芳，杜宜洋，董志剛，紀 薇，，*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 果樹研究所，山西 太原 030031； 2.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801)

線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體(mitochondrial phosphate transporter， MPT)是位于線粒體內(nèi)膜上的一種重要的功能蛋白，負責將重要代謝底物無機磷酸通過線粒體內(nèi)膜從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)中，在細胞維持正常功能中起到了關(guān)鍵的生理作用[1]。植物體中，MPT主要分為Pi/H+同向轉(zhuǎn)運體，Pi/OH-逆向轉(zhuǎn)運體以及Pi/Pi轉(zhuǎn)運體。源于膜兩側(cè)的pH梯度的線粒體電子傳遞鏈是Pi吸收的主要動力。MPT相對分子質(zhì)量約為30 ku，由3個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每個結(jié)構(gòu)域含有100個氨基酸左右，扭轉(zhuǎn)串聯(lián)成兩個α-螺旋組成跨膜結(jié)構(gòu)，因此MPT總共有6個跨膜結(jié)構(gòu)域[2]。

高度保守的MPT的氨基酸序列比對在近年來才在植物中開展[3-4]。很多殘基的功能還沒有被試驗驗證，但其磷酸轉(zhuǎn)運活性被一致認可。隨后的表達分析表明，樺樹的MPT的表達隨著幼葉的長大緩慢提高，在幼莖中表達量最高，經(jīng)臭氧脅迫2 h后，mRNA在轉(zhuǎn)錄水平上積累，在處理12 h后，受誘導程度最高[3]。也有報道說明，植物中的MPT除了受到臭氧的誘導外，還存在真菌誘導響應(yīng)[4]?？偠灾琈PT在發(fā)育中的器官和組織中，有很高的表達量，來滿足這些部位對高能量的需求。這些表達模式說明MPT對于細胞維持正常功能起到了關(guān)鍵的生理作用。

對于葡萄MPT基因家族已有部分研究，但大多集中于能量的需求及運輸途徑探究，對于植物MPT與逆境脅迫抗性的關(guān)系，仍不是很清楚。本研究通過生物信息學，及已公布的葡萄基因組序列信息，篩選VvMPT基因，分析其基因序列、染色體定位、理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、啟動子分析、保守基序和組織表達模式，為進一步研究VvMPT基因功能提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

葡萄全基因組數(shù)據(jù)來源于葡萄基因組CRIBI生物技術(shù)中心(CRIBI Genomics， http://genomes. cribi.unipd.it/grape/)，擬南芥MPT蛋白序列下載于擬南芥數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)，水稻MPT蛋白序列下載于 PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)。

1.2 葡萄MPT基因家族成員的鑒定及序列分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載MPT基因家族的HMM序列比對文件(PF00153)，然后從葡萄基因組CRIBI生物技術(shù)中心下載包含葡萄基因組蛋白質(zhì)序列注釋的自定義數(shù)據(jù)庫，并用HMMER檢索。同時將比對文件轉(zhuǎn)換格式后，以MPT的保守結(jié)構(gòu)域為探針，通過生物編輯器從葡萄基因組中鑒定葡萄MPT基因進行補漏。候選的HMMER序列進一步使用Pfam和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)篩選葡萄蛋白序列中含有MPT結(jié)構(gòu)域的序列(E-value≤10-10)。然后使用Pfam和SMART檢測其蛋白結(jié)構(gòu)域，除去不含MPT結(jié)構(gòu)域的序列獲得VvMPT家族的基因序列。

利用在線軟件ExPASy(http://www. expasy.org/tools/)預(yù)測葡萄MPT蛋白的氨基酸序列與理化性質(zhì)，包括相對分子質(zhì)量、等電位、親水性、不穩(wěn)定系數(shù)等。利用PSORTH進行亞細胞定位。并將葡萄MPT基因比對擬南芥數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥的同源基因，為葡萄MPT家族成員的基因功能預(yù)測提供參考。

1.3 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用ClustalX V.2.0將候選蛋白與擬南芥、水稻MPT基因家族蛋白進行多序列比對，使用MEGA 6.0軟件，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)(Bootstrap=1 000)進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。使用在線版網(wǎng)絡(luò)標識軟件生成MPT基因家族的序列標識 (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)。

1.4 葡萄MPT基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)所得葡萄MPT基因蛋白序列和基因序列，利用在線軟件 GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)進行基因結(jié)構(gòu)分析。

1.5 葡萄MPT保守基序motif分析染色體定位和共線性分析

利用MEME(http://meme-suite.org/)在線程序分析葡萄MPT轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序，預(yù)測基序的數(shù)量設(shè)置為20個；用TBtools分析得到葡萄MPT的motif模式圖，以此對葡萄MPT基因蛋白保守基序進行分析。利用MAP Inspector進行染色體定位作圖。使用軟件TBtools得到基因串聯(lián)重復(fù)圖。利用TBtools進行共線性作圖。

1.6 MPT家族基因表達分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載與葡萄生長發(fā)育有密切關(guān)系的組織器官RNA-Seq數(shù)據(jù)，包括根、新鮮葉片、成熟花、花芽、成熟果實、內(nèi)種皮、外種皮、根莖葉果混合樣、授粉后50 d的果皮、授粉后95 d的果皮和授粉后140 d的果皮，詳情見表1。利用Kallisto v0.43.1軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達差異進行分析，將所得的差異數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2(TPM+1)轉(zhuǎn)換，最后用R繪制葡萄MPT基因家族的表達熱圖。

從植物表達數(shù)據(jù)庫下載全部的多陣列平均歸一化微陣列表達數(shù)據(jù)(http://plexdb.org/)。分析四個試驗相關(guān)微陣列：PEG脅迫反應(yīng)、低溫脅迫反應(yīng)、熱脅迫反應(yīng)、病原體和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

使用Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)集(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gds/)分析54個不同的葡萄組織(GSE36128)中VvMPT基因的標準化轉(zhuǎn)錄物表達數(shù)據(jù)。用多實驗查看器(MeV)繪制葡萄MPT基因家族的表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄MPT基因家族成員的鑒定及序列分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載MPT基因家族的序列比對文件(PF00153)，用HMMER篩選葡萄蛋白序列中含有該結(jié)構(gòu)域的序列，進一步使用Pfam和SMART篩選葡萄蛋白序列中含有MPT結(jié)構(gòu)域的序列，基于E-value≤10-10[5]。將比對文件轉(zhuǎn)換格式后，以MPT的保守結(jié)構(gòu)域為探針，通過生物編輯器從葡萄基因組中鑒定出67個葡萄MPT基因，通過Hmmscan程序檢索Pfam-A數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)64個MPT基因都含有MPT蛋白結(jié)構(gòu)域，其中兩個基因(VIT_214s0068g00890.1、VIT_217s0000g00030.1)除了具有典型的MPT保守結(jié)構(gòu)域外，還有其他的結(jié)構(gòu)域EF-hand，還有1個基因(VIT_209s0002g01610.1 AAA_5)含有5個結(jié)構(gòu)域(AAA_5、MPT、AAA_3、AAA_lid_5和AAA_lid_7)，另外VIT_200s0827g00030.1、VIT_200s1209g00010.1、VIT_216s0039g00600.1無基因結(jié)構(gòu)域標識，因此從MPT家族基因中剔除。最終，本文從葡萄基因組中預(yù)測出64個MPT基因，根據(jù)這些基因所在的染色體位置1到19從上到下的順序分別命名為VvMPT1至VvMPT64。

通過ExPASy在線工具，對葡萄MPT基因家族進行理化性質(zhì)分析。分析結(jié)果顯示，VvMPT33的氨基酸長度為4 800，相對分子質(zhì)量(MW)為542 048.11 u，VvMPT48和VvMPT64的氨基酸長度最小為64，剩余VvMPT的長度范圍為105～829個氨基酸，相對分子質(zhì)量(MW)為6 618.57～91 222.66 u。其等電位范圍從5.34到10.11不等，親疏水性均值(GRAVY)范圍為-0.253～0.403(表1)。亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，VvMPT6主要定位于細胞外，包括細胞壁；VvMPT2、VvMPT10、VvMPT38、VvMPT57和VvMPT64，5個主要定位于線粒體；VvMPT3、VvMPT7、VvMPT22、VvMPT24、VvMPT28、VvMPT2、VvMPT36、VvMPT49、VvMPT56，9個主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；其余基因主要定位于細胞質(zhì)。

2.2 VvMPT染色體定位分析及基因的串聯(lián)重復(fù)

染色體定位分析顯示，葡萄的64個MPT基因定位于19條染色體中，4個MPT基因定位于未組裝的基因組序列支架，因此，未定位于任何特定染色體。在圖1中，發(fā)現(xiàn)染色體6和19中具有單個MPT基因，染色體1、3、11、12和15中各自具有2個MPT基因，染色體2、5、7、9和10具有3個MPT基因，染色體6、13和染色體17具有4條MPT基因。染色體4、14、18各有5條MPT基因。

本研究分析了64個VvMPT基因在19條葡萄染色體上的串聯(lián)重復(fù)事件，其中200 kb內(nèi)包含兩個或更多基因的染色體區(qū)域被定義為串聯(lián)重復(fù)事件。目前VIT_214s0068g01250.1和VIT_214s0068g01260.1存在串聯(lián)重復(fù)。

2.3 葡萄MPT基因家族基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了研究VvMPT基因的系統(tǒng)進化關(guān)系，利用VvMPT蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。據(jù)分析，通過ClustalX V.2.0對葡萄64個VvMPT基因，擬南芥(雙子葉)58個AtMPT基因，水稻(單子葉)25個OsMPT基因進行多序列比對，使用MEGA 6.0軟件，采用最大似然法進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建(圖2)。

表1 葡萄MPT家族基本信息

紅色方框為串聯(lián)重復(fù)。The red box is a series repetition.圖1 VvMPT基因家族染色體定位Fig.1 Chromosome location of VvMPT family members

依據(jù)擬南芥AtMPT的分類標準，稍作改動后將MPT分為7組并用GroupⅠ-GroupⅦ 表示(圖2)[6]。由圖可將MPT基因分為7類，分別為Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ。其中Group Ⅰ 有5個VvMPT基因，Group Ⅱ有10個VvMPT基因，GroupⅢ有7個VvMPT基因，Group Ⅳ有22個VvMPT基因，Group Ⅴ有3個VvMPT基因，Group Ⅵ有5個VvMPT基因，Group Ⅶ有11個VvMPT基因。在Group Ⅵ中只有擬南芥和葡萄家族基因，且包含兩對同源基因。

Vv，葡萄；At，擬南芥；Os，水稻。Vv， Vitis vinifera L.; At， Arabidopsis thaliana; Os， Oryza sativa L.圖2 MPT基因家族的進化分析Fig.2 Phylogenic tree of MPT family members

2.4 葡萄MPT蛋白結(jié)構(gòu)及保守基序分析

為研究VvMPT基因結(jié)構(gòu)的特征，用在線軟件GSDS2.0分析其基因結(jié)構(gòu)(圖3)。結(jié)構(gòu)分析表明，VvMPT基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不同的VvMPT基因所含外顯子和內(nèi)含子數(shù)量差異不大，外顯子數(shù)為1～55，內(nèi)含子數(shù)為1～54。絕大多數(shù)的VvMPT外顯子數(shù)都在5個以上，其中有8個VvMPT有14個外顯子，外顯子數(shù)隨著系統(tǒng)進化樹由外端分支到內(nèi)部分支逐漸增多。同時除了VvMPT17、VvMPT38、VvMPT19以外，其余基因5′上游比3′下游序列長，VvMPT基因家族外顯子長度保守性差，沒有顯著規(guī)律[7-9]。

2.5 葡萄MPT基因啟動子上游2 kb順式作用元件分析

在64個VvMPT的啟動子區(qū)域中，對順式調(diào)控元件進行分析，研究非生物脅迫響應(yīng)機制。在64個VvMPT的啟動子區(qū)域中，脅迫相關(guān)順式元件包括ABA響應(yīng)元件ABRE(response to ABA)、厭氧誘導響應(yīng)元件ARE (anaerobic induction)、茉莉酸反應(yīng)CGTCA-motif(MeJA-responsive)、赤霉素反應(yīng)P-box(gibberellin responsive)、水楊酸反應(yīng)TCA-element(salicylic acid responsive)、分生組織表達CAT-box(meristem expression)、干旱誘導MBS(rought-inducibility)、生長素應(yīng)答AuxRR-core(auxin responsive)、防御和脅迫反應(yīng)TC-rich repeats(defense and stress responsive)、低溫響應(yīng)元件LTR (response to low temperature)[10]。為了確定VvMPT基因家族啟動子上游2 kb區(qū)域的順式作用元件，在該基因家族起始密碼子上游2 kb堿基序列中進行搜索，結(jié)果表明，VvMPT基因家族成員中ABRE(ABA響應(yīng)原件)最多有125個，MBS(干旱誘導響應(yīng)元件)32個，LTRE(低溫響應(yīng)元件)22個最少。在VvMPT基因家族中，除VvMPT1、VvMPT13、VvMPT14、VvMPT25、VvMPT26、VvMPT29、VvMPT31、VvMPT33、VvMPT36、VvMPT37、VvMPT40、VvMPT45、VvMPT49、VvMPT55、VvMPT58、VvMPT61、VvMPT62、VvMPT63、VvMPT64以外，其余均含有ABRE響應(yīng)元件；VvMPT10在ABRE上的響應(yīng)均最高。VvMPT62不含其中任何一種順式作用元件(表2)。

2.6 葡萄MPT基因家族的表達分析

為進一步分析葡萄MPT基因的特性和功能，對MPT基因組織特異表達情況進行分析，獲得了各組織中VvMPT的表達量構(gòu)建表達熱圖(圖4)。結(jié)果顯示，VvMPT1在莖、卷須中低表達，VvMPT11、VvMPT37在葉片、漿果中相比其他器官中等表達，VvMPT48、VvMPT58在各器官中低表達，VvMPT12、VvMPT21、VvMPT22、VvMPT27、VvMPT29、VvMPT56在各器官中高表達無明顯差異。VvMPT31在芽、卷須、花粉中低表達，在漿果、花粉、葉片、葉軸上中高度表達。

2.7 葡萄MPT家族基因與擬南芥MPT家族基因共線性分析

利用基因組比較方法，將經(jīng)過大量研究的物種的基因組結(jié)構(gòu)和功能的知識轉(zhuǎn)移到研究較少的物種通常是一種方便且高效的方法。因此，將葡萄中MPT家族基因與模式植物擬南芥中的同源基因進行比較，以預(yù)測它們的功能。根據(jù)比較基因組分析(圖5)，共鑒定出31對同線關(guān)系，包括29個AtMPT基因和26個VvMPT基因。發(fā)現(xiàn)了10個AtMPT基因(AT1G07025.1、AT2G30160.1和AT2G37890.1、AT3G53940.1，AT3G54110.1、AT5G58970.1，AT3G05290.1、AT5G27520.1，AT5G61810.1、AT5G51050.1)和5個VvMPT基因(VIT_206s0004g07350.1、VIT_208s0007g01280.1、VIT_208s0007g01700.1、VIT_214s0128g00390.1、VIT_217s0000g00030.1)參與到至少3對共線性關(guān)系中。根據(jù)該分析，配對的VvMPT-AtMPT基因位于葡萄和擬南芥基因組之間具有同線性的基因組區(qū)域。

表2 葡萄VvMPT 基因家族啟動子序列主要順式元件分析

圖4 葡萄MPT基因在不同組織部位的表達熱圖Fig.4 Heat map of MPT gene expression in different tissues of grape

圖5 葡萄和擬南芥的MPT基因家族同源性分析Fig.5 Synteny analysis of MPT genes from Vitis vinifera L. and Arabidopsis thaliana

3 結(jié)論與討論

MPT類家族是位于線粒體內(nèi)膜上的一種重要的功能蛋白，在細胞維持正常功能中起到了關(guān)鍵的生理作用。在人類和牛的基因組中，只有一個基因編碼線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體，隨后經(jīng)過可變剪切，產(chǎn)生兩種形式的MPT，A型和B型。A型只是為需能高的組織例如肌肉等提供能量，而B 型可對所有的組織提供基本的能量需求[11-12]。植物MPT的研究滯后，Kiiskinen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在樺樹的基因組中只存在一個線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體，而隨后Takabatake等[3]說明在植物中存在多個拷貝的線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體，這一點與動物和酵母的MPT存在差別。本研究利用生物信息學方法，通過鑒定分析一共篩選出64個可能的葡萄MPT基因家族成員。64個VvMPT分布于19條染色體上，亞細胞定位分析表明，64個VvMPT主要定位于線粒體中。

將鑒定的64個VvMPT基因與來源于擬南芥、水稻的83個MPT基因構(gòu)建進化樹，并結(jié)合擬南芥基因家族的分類標準將其分為7組。進化樹分析表明，大部分葡萄MPT基因與擬南芥MPT基因親緣關(guān)系更近，這與葡萄、擬南芥都是雙子葉植物這一事實相符。

外界環(huán)境尤其是一些非生物逆境如干旱、低溫等條件的作用下，具有脅迫響應(yīng)元件的基因表達水平也會升高，順式作用元件分析表明，在64個葡萄MPT家族基因中檢測到125個ABRE(ABA響應(yīng)元件)、32個MBS(干旱誘導響應(yīng)元件)、22個LTRE(低溫響應(yīng)元件)，推測大多數(shù)VvMPT基因在生長素信號下被轉(zhuǎn)錄表達，在成熟和衰老過程中會產(chǎn)生更多的脫落酸、赤霉素、水楊酸和茉莉酸等內(nèi)源激素，葡萄中VvMPT在不同的非生物脅迫下能被誘導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些推測在一些試驗中得到了驗證[13-19]。這些研究均表明，植物可以通過植物激素傳遞的信號來調(diào)節(jié)自身的生長來適應(yīng)不斷變化的外界環(huán)境[20-21]。我們后續(xù)的分析將集中于有關(guān)環(huán)境脅迫和植物激素相互關(guān)系的研究。

擬南芥作為一種模式植物，各類基因的研究都比較深入，根據(jù)共線性分析結(jié)果結(jié)合已有擬南芥相關(guān)研究來預(yù)測葡萄同源基因的功能，可以快速有效地縮短研究進度。本研究根據(jù)比較基因組分析，共鑒定出31對VvMPT-AtMPT基因，包括26個VvMPT基因和30個AtMPT基因，配對的VvMPT-AtMPT基因位于葡萄和擬南芥基因組之間具有同線性的基因組區(qū)域。這些基因可能來源于一個共同的祖先，具有潛在的相似功能，且在物種分化前就已完成基因復(fù)制現(xiàn)象。已有研究表明，AtMPT1(AT2G17270)、AtMPT2(AT3G48850)和AtMPT3(AT5G14040)受到高鹽脅迫、滲透脅迫的不同程度的誘導[1]，而VvMPT11(共線性于AtMPT1)、VvMPT55、VvMPT56(共線性于AtMPT2)是否有類似功能將是我們的一個重要研究內(nèi)容。

本研究組織特異性表達表明，VvMPT12、VvMPT21、VvMPT22、VvMPT27、VvMPT29、VvMPT56在各器官中高表達。VvMPT31 在芽、卷須、花粉中低表達，在漿果、花粉、葉片、葉軸上中高表達。研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果中VvMPT基因在果皮、花、葉中高表達[4]基本一致，表明VvMPT基因家族成員在花器官的發(fā)育中起到了重要作用。然而，具體功能仍需要進一步的實驗分析來證實。

通過對葡萄MPT基因的研究分析，為進一步了解葡萄MPT基因家族成員的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、揭示MPT基因在參與葡萄花器官生長發(fā)育的調(diào)控機制與維持細胞離子平衡等方面奠定了一定的理論基礎(chǔ)。今后研究的重點是葡萄MPT基因家族成員的功能驗證、MPT基因響應(yīng)各種脅迫及生長素信號的調(diào)控機制，有助于了解MPT基因功能的特異性，推動植物花器官發(fā)育過程中及環(huán)境脅迫下轉(zhuǎn)錄因子信號傳導網(wǎng)絡(luò)的研究與發(fā)展。