陳 健，王建斌，郝曉燕，孫海瑞，何怡華

結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex，TSC)是一種常染色體顯性遺傳疾病，其在正常人群中的發(fā)病率為1/6 000～1/10 000[1-2]。TSC病人的臨床表型和癥狀往往差別較大，最常見的臨床表現(xiàn)包括智力障礙、孤獨(dú)癥或癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其主要由皮質(zhì)及室管膜下病變引起，少數(shù)由未分化的巨細(xì)胞瘤引起[3-5]。累及多系統(tǒng)的錯(cuò)構(gòu)瘤形成則是另一種主要表現(xiàn)，可見于皮膚、肝臟、腎臟、肺部[6]。大多數(shù)情況下，病人都是因?yàn)槊黠@的皮膚癥狀或癲癇前來就診。傳統(tǒng)的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)主要以臨床表型為基礎(chǔ)，對于臨床表型不典型的病人診斷常較困難。2012年修訂的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)將TSC1和TSC2基因的致病突變作為一項(xiàng)單獨(dú)的TSC基因診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，上述兩個(gè)基因分別位于9q34和16p13.3，9q34包含23個(gè)外顯子，16p13.3包含41個(gè)外顯子[8]。這兩個(gè)基因均為腫瘤抑制基因，分別編碼形成錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白和馬鈴薯蛋白，并形成一個(gè)主要的雷帕霉素受體復(fù)合體1(the mammalian target of rapamycin，mTORC1)，控制細(xì)胞的增殖、分化、黏附生長和遷移，對于mTORC1的靶向治療成為目前研究的熱點(diǎn)[9]。除此之外，兩個(gè)基因還在大腦皮質(zhì)分化和生長控制方面起著重要作用。在新近研究報(bào)道的TSC突變中，TSC新發(fā)突變的比例超過2/3[10]。

雖然越來越多的TSC基因突變被報(bào)道，但特定突變與特定表型之間的對應(yīng)關(guān)系尚不清楚，?？梢娤嗤蚁低蛔冊谟H代和子代病人中的表型存在較大的差異[11]。本研究對42例臨床確診為TSC的病人進(jìn)行家系臨床表型和遺傳學(xué)分析，探討不同突變與臨床表型之間可能的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究系一項(xiàng)前瞻性研究，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。通過與TSC中國協(xié)會合作，于2015年9月—2017年12月入組42例獨(dú)立的TSC病人及其家系，所有病人都被臨床確診為TSC。對所有病人及直系親屬進(jìn)行了TSC1和TSC2目標(biāo)基因檢測。經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有接受基因檢測病人家系均需簽署知情同意，表示知曉本研究情況并同意接受基因檢測。

1.2 臨床表型采集 主要采集臨床表型包括面部血管纖維瘤或前額斑塊、非外傷性指(趾)甲或甲周纖維瘤、色素減退斑(≥3)、鯊革樣皮疹(結(jié)締組織痣)、多發(fā)性視網(wǎng)膜錯(cuò)構(gòu)瘤結(jié)節(jié)、皮質(zhì)結(jié)節(jié)、室管膜下結(jié)節(jié)、室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、單個(gè)或多發(fā)的心臟橫紋肌瘤、肺淋巴管性肌瘤病、腎血管平滑肌瘤。所有病人的診斷均由一位有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生獨(dú)立完成。

本研究中所有病人臨床診斷依據(jù)2012年國際TSC大會修訂的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)先證者都有典型的皮膚和腦部病變[7，10]。所有病人都接受了高分辨率的腦部核磁(MRI)或電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)。所有病人癥狀及體征采集均由一位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生完成，且不知曉其基因突變結(jié)果。

1.3 DNA樣本采集 對家系先證者及其相關(guān)家系成員采集外周血樣，采集部位為外周靜脈，使用4 mL EDTA抗凝管，每人2管，冷藏保存運(yùn)輸。所有樣本若不能立即送檢，則置于-20 ℃冰箱或-80 ℃液氮罐中保存。

1.4 TSC目標(biāo)基因檢測 使用標(biāo)準(zhǔn)程序分別在組織、羊水及全血中提取DNA樣本。通過多重PCR和Illunina模塊順序擴(kuò)增TSC1和TSC2外顯子。使用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)檢測TSC目標(biāo)基因大片段的重復(fù)或缺失。

DNA提取：使用BloodGen Midi Kit (CWBIO， China)提取病人DNA并進(jìn)行質(zhì)控，具體要求為：DNA濃度要求至少達(dá)到30～50 ng/μL，不能有降解，不能有RNA污染。

多重PCR方法構(gòu)建文庫：定制羅氏NimbleGen捕獲探針進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲。使用同一PCR體系加上二對以上引物，產(chǎn)生多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，完成DNA 文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建完成后，取1 μL捕獲文庫用于Qubit定量，然后適當(dāng)稀釋文庫用Q-PCR檢測文庫濃度，以保證文庫質(zhì)量并達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥10 nm(qPCR定量濃度)；文庫檢測后剩余體積≥10 μL。

測序：將所取標(biāo)準(zhǔn)文庫樣本在Illumina hiseq2500平臺使用標(biāo)準(zhǔn)操作流程上機(jī)測序：選擇高通量模式——PE100 測序。測序得到圖像原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行原始數(shù)據(jù)去接頭質(zhì)量過濾。數(shù)據(jù)分析：原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)、比對、SNP檢測及注釋、Indel檢測及注釋、突變假陽性過濾、突變注釋等生物信息學(xué)分析。有疑似位點(diǎn)的樣本需要進(jìn)行一代測序(Sanger法)驗(yàn)證。

1.5 報(bào)告解讀 臨床醫(yī)生與生物信息專員共同對病人家系基因結(jié)果生物學(xué)信息、臨床表型、臨床癥狀及治療情況等進(jìn)行匹配、個(gè)體化綜合分析，最終做出基于臨床基礎(chǔ)的基因診斷報(bào)告。

2 結(jié) 果

42例病人及家系都成功接受了家系基因檢測，其中39個(gè)家系中每個(gè)先證者中均檢測出單個(gè)TSC突變，其中2個(gè)突變分別在不同的病人中檢出2次和3次，合計(jì)共36個(gè)不同的致病或疑似致病性突變，包括14例無義突變，12例移碼突變，4例錯(cuò)義突變， 2例剪接突變，4例大片段缺失；另外3個(gè)家系TSC目標(biāo)基因檢測均為陰性(見表1)。在檢測出突變的39個(gè)家系中，新發(fā)突變?yōu)?4個(gè)，家系遺傳突變?yōu)?個(gè)。

表1 42例病人TSC基因突變特征

2.1 TSC1突變情況 在本研究42個(gè)家系中，檢測出TSC1突變6例(14%)，其中5例為新發(fā)突變，1例家系遺傳突變。分別是3例無義突變，2例移碼突變，1例大片段缺失，均為致病性或疑似致病性突變，突變位置集中于8、9、11、14、18號外顯子(見表1、表2)。

表2 TSC1和TSC2基因突變情況 單位：例

2.2 TSC2突變情況 共有33個(gè)家系先證者檢測出TSC2突變(79%)，其中29例為新發(fā)突變，4例家系遺傳突變見表 1。包括11例無義突變，10例移碼突變，4例錯(cuò)義突變，3例大片段缺失，2例剪接突變，所有突變均為致病性或疑似致病性突變。這些突變中所有點(diǎn)突變的位置集中于16個(gè)外顯子及1個(gè)內(nèi)含子，其中累及次數(shù)最多的位置為41號外顯子，共有5個(gè)不同的先證者均被檢測出該位置致病突變；2個(gè)大片段缺失突變累及1～16號外顯子。

2.3 TSC表型特征 所有TSC癥狀及體征數(shù)目分布及其在不同基因型中的占比顯示，男性占多數(shù)，共31例(74%)。詳見表1。42例病人不同TSC表型特征與基因型分析見表3。在所有病人相關(guān)的TSC表型中，最常見的體征為腦部室管膜下結(jié)節(jié)(見圖1)，在39例病人中出現(xiàn)，占比93%，其次是皮膚色素減退斑(見圖2)，為38例(90%)；最常見癥狀為癲癇，出現(xiàn)病人38例(90%)，這也是大多數(shù)病人就醫(yī)的原因。皮膚癥狀和腦部組織是所有病人中最常見的表現(xiàn)，均在超過一半的病人中出現(xiàn)。

表3 42例病人不同TSC表型與基因型分析 單位：例(%)

圖1 腦部CT顯示患兒多發(fā)室管膜下結(jié)節(jié)(箭頭所示)

圖2 病人右側(cè)腰部皮膚多發(fā)白斑(箭頭所示)

3 討 論

本研究中被檢出攜帶TSC2基因突變的病人占大多數(shù)，但無論是TSC1和TSC2突變，經(jīng)臨床確診的病人在表型上差別不大，如決定病人癥狀嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)——智力狀況，在TSC1突變病人中，僅有4例(4/6)出現(xiàn)了智力減退表現(xiàn)，而在TSC2病人中，有23例(70%)出現(xiàn)智力減低，這與既往報(bào)道并不一致[12-13]。本研究中TSC1病人較少可能是原因之一。在新發(fā)和家系遺傳突變比例上，TSC1基因和TSC2基因差別也不大，前者家系遺傳1例(1/6)，后者家系遺傳4例(12%)。

一些致病位點(diǎn)的較高頻率突變值得關(guān)注。TSC2基因41號外顯子被檢出5個(gè)致病或疑似致病突變，其中3個(gè)為已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)致病的錯(cuò)義突變，另外2個(gè)為移碼突變，雖未見報(bào)道，但生物信息分析結(jié)果為多個(gè)核苷酸的缺失會導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的改變，從而影響功能，高度疑似致病突變。5例病人均有較嚴(yán)重的TSC癥狀，所有病人都出現(xiàn)了癲癇發(fā)作，4例病人出現(xiàn)智力減低，并且出現(xiàn)癥狀相對較晚，平均診斷年齡為3歲。

兩個(gè)點(diǎn)突變在不同病人身上被重復(fù)檢出。其中點(diǎn)突變TSC2：c.3412C>T (Exon30)在3例不同病人身上被檢出，該突變可造成編碼蛋白的1 138位氨基酸由精氨酸(R，Arg)變異為終止密碼子(X)，且相對原來縮短670個(gè)氨基酸，因此，考慮為致病突變。除此之外，該突變也已經(jīng)有相關(guān)疾病報(bào)道[14]。3例病人均在0～1歲出現(xiàn)首發(fā)癥狀癲癇，3例患兒均出現(xiàn)室管膜下結(jié)節(jié)和多發(fā)色素減退斑，其中2例出現(xiàn)智力減退表現(xiàn)。TSC2：c.5228C>T(exon41)則是另一個(gè)在2例不同病人身上被檢出的致病點(diǎn)突變，該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致1 743位的氨基酸由精氨酸(R)變?yōu)楣劝滨０?Q)，可以造成編碼蛋白序列的改變，對其結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重影響，已有文獻(xiàn)報(bào)道該致病位點(diǎn)上的相同類型氨基酸變異[15]。攜帶上述突變的兩例病人均出現(xiàn)較嚴(yán)重癥狀，包括癲癇、智力減低、室管膜下結(jié)節(jié)和皮質(zhì)發(fā)育不良、皮膚多發(fā)色素減退斑，同時(shí)多發(fā)牙釉質(zhì)改變和多發(fā)心臟橫紋肌瘤也分別見于其中1例病人。

本研究中共有3例病人及其家系TSC目標(biāo)基因檢測結(jié)果為陰性，3例臨床癥狀及體征均相對較輕，其中2例患兒出現(xiàn)癲癇癥狀，但用藥后均明顯好轉(zhuǎn)；除1例患兒智力可疑減退外，另外2例患兒均無明顯智力減退表現(xiàn)。但由于此次檢測基因采樣位置為外周血，未排除嵌合體的可能[16]，目前正在進(jìn)行下一步的多位置樣本采集，特別是病變部位。家系突變的比例在本研究中較少，僅有5例(12%)，其共同的特點(diǎn)是親代臨床表型較子代輕，特別是神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，親代都沒有明顯神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，智力也無明顯減退，而在子代中有4例先證者患兒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和智力減退表現(xiàn)。同一位點(diǎn)突變在親代和子代之間的差別機(jī)制尚不明確。本研究是一項(xiàng)單中心的前瞻性研究，在42例臨床確診的TSC病人中檢測出36個(gè)不同的TSC1/2致病突變。無義突變和移碼突變是最常見的TSC致病突變。TSC2的致病突變在所有檢出突變中占大多數(shù)，但本研究中TSC1和TSC2基因突變的TSC病人在臨床表型上差異不明顯。3例(7%)病人常規(guī)外周血基因檢測陰性，這與既往報(bào)道相符，不能除外部分病人為體細(xì)胞或生殖細(xì)胞嵌合體的可能[16-17]。

本研究入組樣本量較少，部分TSC的癥狀和體征在本研究中并未發(fā)現(xiàn)。對于連續(xù)檢出的高頻突變，需要進(jìn)一步的功能驗(yàn)證明確證實(shí)其致病性。