陶 佩，王 聰，胡學超，繆文俊，黃 和

(1. 南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800；2. 南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京 211800)

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種新興的腫瘤治療手段，它已經在皮膚癌、鼻咽癌和乳腺癌等腫瘤治療中取得了良好的治療效果[1-2]。PDT具體是指一種特殊的化學物質——光敏劑(photosensitizer，PS)，它在組織部位有O2存在的條件下，會被特定波長的光照射后生成活性氧(ROS)，造成局部腫瘤細胞死亡的一種方法[3]。在沒有光照的條件下，光敏劑的毒性很低，因此可以降低PDT治療中的系統(tǒng)毒性，降低對健康組織的毒副作用。與傳統(tǒng)的手術治療、化療、放療相比，PDT具有時間空間雙重可控性，有望提高治療指數(shù)與病人的順應性[4-5]。PDT的治療效果高度依賴于ROS的產量，同時這還與光敏劑的類型、靶細胞內的氧濃度、光劑量、靶細胞中光敏劑的攝取量以及腫瘤細胞對PDT的抗性密切相關。

盡管PDT在腫瘤治療中有許多優(yōu)點，但是由于PDT本身的特性，導致它在臨床上應用仍受限制，如由于缺乏能夠在腫瘤部位富集、產生足夠的ROS并在發(fā)揮作用后完全從體內清除的光敏劑；缺乏能夠充分穿透組織達到腫瘤部位并對正常組織沒有損傷的光源；腫瘤細胞的快速增殖造成實體瘤缺氧微環(huán)境等。此外，目前大部分PDT的應用涉及O2的大量消耗，而缺氧不僅與腫瘤惡化、化療和放療抗性密切相關，還會導致不良的預后和腫瘤轉移可能性的增加。因此，開發(fā)安全有效的新策略來解決這些問題非常有必要。本篇綜述就PDT在腫瘤治療中存在的局限性，尤其是針對腫瘤缺氧環(huán)境，介紹了通過各種手段克服或者利用缺氧環(huán)境增強PDT治療并討論PDT在未來臨床應用中的一些挑戰(zhàn)。

1 光動力療法(PDT)

1.1 光動力療法的基本原理

PDT具體原理如圖1所示，處于基態(tài)(S0)的光敏劑被合適波長的光照射后，吸收能量變成單激發(fā)態(tài)(S1)。處于激發(fā)態(tài)的光敏劑可以通過系間跨越轉移到能級更低的長壽命激發(fā)三重態(tài)(T1)。激發(fā)三重態(tài)的光敏劑可以和周圍的分子反應，通過2種途徑產生活性氧(ROS)[6-7]。第1種途徑是處于激發(fā)態(tài)的光敏劑和底物之間轉移一個氫原子或者一個電子，生成游離的自由基，然后再和氧氣反應，產生ROS，如超氧化物自由基、羥基自由基等(Ⅰ型反應)。第2種途徑是被激發(fā)的光敏劑和基態(tài)中的分子氧(3O2)之間進行能量轉移，形成單線態(tài)氧(1O2)(Ⅱ型反應)。由這2種不同途徑產生的ROS都會對腫瘤細胞或者組織造成不可逆的損傷。但是由于ROS和單線態(tài)氧物質半衰期短，因此在PDT治療中，只有那些在產生細胞毒性物質附近的腫瘤區(qū)域組織或者細胞才會直接受到影響，健康組織則不會受到傷害。此外，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑除了系間跨越快速轉移能量外，還可以通過熱能或熒光發(fā)射的方式回到基態(tài)。這種轉換可以用來成像或者光檢測。

圖1 光動力療法(PDT)原理示意Fig.1 Schematic illustration of the mechanism of photodynamic therapy

1.2 PDT在腫瘤治療中的局限性

1.2.1 缺乏理想的光敏劑

一個理想的光敏劑要求其能有效地聚集在腫瘤部位，并且在發(fā)揮作用后能夠在體內被降解，排出體外，同時具有較小的暗毒性[8]。由于實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR效應)，會促進大分子物質在腫瘤部位的聚集，同時增加藥效，減少全身的副作用[9]。光敏劑一般是大分子結構，所以它能夠優(yōu)先富集于腫瘤部位?，F(xiàn)在臨床上應用的光敏劑大部分是具有近紅外吸收、成分明確、簡單穩(wěn)定的物質。

應用于PDT治療的第一代商業(yè)用有機光敏劑是血卟啉衍生物(HpD)和它的提純活性物質光敏素(photofrin)[10]。第二代光敏劑包括卟啉類化合物和非卟啉類化合光敏劑物，比如血卟啉單甲醚、金屬酞菁、5-氨基乙酰丙酸(ALA)及其衍生物。為了克服上述光敏劑半衰期短、易自我聚集和在皮膚組織蓄積等缺點，研究人員在第二代光敏劑上引入具有生物活性或者分子識別功能的官能團，開發(fā)了第三代光敏劑，如氨基酸偶聯(lián)光敏劑、蛋白質或糖偶聯(lián)光敏劑等[11]，從而能夠被有效遞送到靶部位。除了上述有機光敏劑外，無機光敏劑由于穩(wěn)定性好，容易被化學修飾，也引起了廣泛關注，比如一些金屬氧化物和上轉換納米粒子(UCNPs)[12-14]。但是由于它們難以在體內降解，容易對正常組織產生毒性，因此也難以得到廣泛應用?，F(xiàn)在臨床上常用的光敏劑如表1所示。

表1 臨床應用的光敏劑Table 1 Photosensitizers applied in clinics

1.2.2 光源及其組織穿透度低

光源就像是控制PDT的開關一樣，當光源打開以后，要求光源能夠充分穿透正常組織達到病灶部位。理想的光給藥劑量是指能夠有效激活光敏劑、造成靶部位細胞死亡、但是對正常細胞沒有傷害的劑量。然而在現(xiàn)實應用上，這種光劑量的選擇效果基本上很難實現(xiàn)。對于有效的PDT，光源至少應滿足以下2個條件[15]：①適當?shù)墓庾V特性，即與所用的光敏劑最大吸收波長范圍一致；②足夠的穿透深度，即用最小的光散射，最大可能激活光敏劑。大部分的光敏劑在可見光區(qū)域具有強吸收，然而由于生物組織具有許多內源性發(fā)色團，如血紅蛋白、肌紅蛋白和細胞色素等，它們在很大程度上可以吸收可見光，導致光能迅速衰減[16]。而且這些具有內源性發(fā)色團的組織結構一般都不均勻，容易導致光在傳播中改變方向，不能到達深部組織以獲得有效的PDT。通常紫外和可見光的穿透深度僅為1～3 mm，不能滿足實體瘤或者深部腫瘤治療的要求[17]。被稱為生物組織的光學窗口的近紅外光(NIR，700～1 300 nm)可在一定程度上增強組織的穿透厚度[18]。此外，光的劑量、強度和照射時間都與PDT治療效果有關，選擇合適的光源和治療參數(shù)對有效的PDT至關重要。

1.2.3 腫瘤缺氧

PDT是一種氧依賴性的治療方式，通過消耗大量的組織O2來產生ROS，導致或加重腫瘤區(qū)域缺氧。產生的ROS會損傷血管內皮細胞，導致血管功能部分或者完全損傷，引起嚴重的缺氧環(huán)境[19]。此外，由于腫瘤新生血管結構功能的異常，導致實體瘤中心處于缺氧狀態(tài)。缺氧不僅與腫瘤惡化、化療和放療抗性密切相關，還會導致不良的預后和腫瘤轉移的增加。已經有研究發(fā)現(xiàn)這些副反應是由缺氧相關基因被激活介導的，例如，缺氧誘導因子(HIF)-1 被過度表達，氧調節(jié)相關的缺氧基因的主要轉錄因子被激活[20]。這些不足之處在一定程度上限制了PDT在臨床上的應用。

2 克服腫瘤缺氧環(huán)境提高PDT療效

由于PDT具有非入侵性和高選擇性等優(yōu)點，成為治療多種良性、惡性疾病的一種新興治療方式。但是由于PDT會造成組織局部缺氧，進而導致PDT在常規(guī)的放療及化療中效果較差。為了提高PDT的抗腫瘤效果，利用納米粒子來改善腫瘤缺氧環(huán)境得到了廣泛關注。比如，通過改善腫瘤部位的血液灌注[21]、開發(fā)供氧納米粒子[22]和增強原位腫瘤區(qū)域氧濃度[23]等(圖2)。

圖2 克服PDT造成的缺氧微環(huán)境的方法Fig.2 Strategies for overcoming hypoxia microenvironment for enhanced PDT

2.1 改善瘤內血液灌注

改善血液流動被認為是提高瘤內氧濃度，增強PDT療效的有效方法。近年來，通過增加腫瘤局部溫度提高腫瘤內的血流量來緩解腫瘤缺氧的方法已經得到充分的證明[24]。光熱療法[25](PTT)是一種已經被廣泛研究的腫瘤消融方法，通常利用具有光熱性質的納米粒子將近紅外光能轉換為熱能。因此，利用輕度PTT手段提高腫瘤部位血流，增加瘤內O2水平，將有利于緩解腫瘤缺氧。Feng等[26]制備了含有光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)和光熱劑DiR的脂質體DiR-hCe6-liposome，在785 nm激光照射下激活DiR產生光熱效應，促進腫瘤內血流，減輕腫瘤缺氧；在660 nm發(fā)光二極管照射下激發(fā)活Ce6觸發(fā)PDT效應。體內實驗發(fā)現(xiàn)，與hCe6-liposome相比，DiR-hCe6-liposome在光照后，明顯改善瘤內血流，緩解腫瘤缺氧，增強PDT治療效果(圖3)。

圖3 通過改善瘤內血液灌注克服腫瘤缺氧[26]Fig.3 Overcoming tumor hypoxia via improving blood flow into tumors[26]

除了利用高溫來暫時改善腫瘤血流量外，利用具有抗血管生成功能的化藥(如紫杉烷、吉西他濱、環(huán)磷酰胺和順鉑等)能夠使結構功能異常的腫瘤血管正?；瑥亩欣诹鰞妊汉脱鯕獾墓嘧27]。例如，Wang等[28]最近開發(fā)了一種光敏劑四羥基苯基卟啉(THPP)和前藥(順鉑)交聯(lián)的聚合物用于腫瘤治療，由于腫瘤區(qū)域谷胱甘肽水平降低，可以使順鉑在此環(huán)境中釋放，降低血管內皮生長因子的表達，使血管正?；瑥亩鴾p輕腫瘤缺氧程度并增加PDT療效。

2.2 腫瘤遞氧

利用能夠運輸O2的納米載體，將O2輸送到腫瘤區(qū)域是另一種克服腫瘤缺氧的方法。已經發(fā)現(xiàn)被修飾過的紅細胞(RBCs)、血紅蛋白(Hb)以及全氟化碳(PFC)等可以有效遞送O2。游離的Hb由于它本身穩(wěn)定性差以及半衰期短等缺點，一般通過物理包封或化學綴合可以增加游離Hb在體內的循環(huán)時間以及其遞氧能力。在Wang等[29]的工作中，利用聚合物包封Hb與光敏劑酞菁鋅(ZnPc)復合物，在光照條件下，可以有效緩解腫瘤缺氧區(qū)域，提高PDT治療效果。然而，由于Hb的O2負載率較小(每個Hb負載4個O2分子)，具有更高氧親和力的PFC被更多用于O2輸送。比如，Cheng等[30]開發(fā)了一種負載IR780近紅外染料的PFC納米滴，不僅可以增加NIR染料的單線態(tài)氧產率，還可以增加腫瘤部位的O2，在動物體內研究表明這種PFC/ IR780納米藥物完全抑制腫瘤生長，增強PDT治療，為腫瘤患者提供一種簡單有效的治療選擇(圖4)。

圖4 遞送O2到腫瘤部位克服腫瘤缺氧[30]Fig.4 Overcoming tumor hypoxia via delivering oxygen into tumors[30]

2.3 腫瘤原位產氧

與正常的組織相比，腫瘤區(qū)域中內源性的H2O2的水平更高，因此可以通過催化瘤內H2O2分解產生O2緩解瘤內缺氧情況。此外，腫瘤細胞內H2O2水平的高低與DNA損傷、細胞增殖、轉移和血管生成等息息相關[31]。因此，利用可以有效包封過氧化氫酶或類酶的納米粒子，催化腫瘤部位H2O2生成O2，提高光動力治療效果。比如，Cheng等[32]將過氧化氫酶和光敏劑同時包封在多孔沸石咪唑酯骨架(ZIF-8)中，利用癌細胞膜形成CAT-PS-ZIF@Mem納米粒。由于腫瘤內H2O2濃度高，會被過氧化氫酶催化產生O2，用于有效的PDT治療。除了過氧化氫酶之外，其他可以催化H2O2生成O2的MnO2、KMnO4、金納米簇、鉑納米酶、介孔氧化鈰納米粒等物質也被廣泛研究用于腫瘤的缺氧治療。

除了利用H2O2生成O2外，Zheng等[33]利用水作為O2來源用于增強PDT治療，他們將量子點附著在C3N4上，再與PpIX復合物和靶向癌細胞的RGD結合，紅光照射后在水中能夠有效產生O2，克服由PDT引起的缺氧，最終提高治療效果。

3 利用腫瘤缺氧提高PDT療效

除了利用各種手段克服腫瘤缺氧以提高PDT治療療效外，還可以利用這種缺氧環(huán)境提高PDT的療效。PDT治療后加重的缺氧環(huán)境可以作為高度特異性的觸發(fā)條件，允許藥物在腫瘤區(qū)域被選擇性遞送或活化，從而產生更好的抗癌效果，同時具有最小的全身毒性。

生物還原性藥物是一類在生物體內還原生成具有細胞毒性的物質[34]，特別是在缺氧環(huán)境中能夠高度殺傷腫瘤細胞，為腫瘤缺氧治療提供了一種新手段。

3.1 生物還原性藥物的分類

在缺氧條件下，可以被酶還原活化的化合物分為五類，分別是硝基咪唑類、芳香族氮氧化物、脂肪族氮氧化物、醌和金屬絡合物(圖5)。這些生物還原性藥物大部分經由單電子或雙電子還原反應生成超氧化合物、前藥自由基，產生細胞毒性藥物。

圖5 生物還原性藥物的結構Fig.5 Structures of the bioreductive drugs

3.1.1 硝基咪唑類

硝基咪唑類化合物，如米索硝唑、依他硝唑和尼莫唑等藥物最初主要作為放射增敏劑而被設計，后來逐漸被用于選擇性缺氧細胞[35]。PR-104是一種水溶性磷酸酯前藥前體，可在體內迅速被水解為前藥PR-104A[36]。PR-104A是一種二硝基苯甲酰胺氮芥，可以被各種氧化還原酶還原為PR-104H和PR-104M。這些代謝產物會引起DNA鏈斷裂，誘導產生DNA自由基，殺死腫瘤細胞[37]。

3.1.2 芳香族N-氧化物

迄今為止，氮氧化物替拉扎明[38](TPZ)是臨床上使用最廣泛的生物還原性藥物。TPZ于1986年首次被報道，并在體外研究中發(fā)現(xiàn)它在缺氧條件下比在正常氧分壓條件下顯示出高200倍的細胞毒性。在缺氧環(huán)境中，TPZ由細胞色素P450經由單電子還原生成TPZ自由基，再自發(fā)轉換生成苯并三嗪自由基，最終導致DNA鏈斷裂，造成細胞死亡[39]。而當有氧氣存在時，TPZ經歷無效循環(huán)回到母體化合物，同時生成超氧化物。TPZ的雙電子還原反應是對機體的一種保護過程，因為在此過程中不產生TPZ自由基，而只產生單一無毒性的代謝物N-氧化物。在一部分臨床III期試驗中，TPZ沒有顯示出比傳統(tǒng)治療更高的療效。III期試驗中的非預期結果可能反映了TPZ需要在具有高水平腫瘤缺氧的患者群體中才能得到更好的治療效果。SN30000是TPZ的類似物，相比較于TPZ，它到達缺氧腫瘤細胞區(qū)域的濃度更高。

3.1.3 脂肪族N-氧化物

AQ4N(banoxantrone)是一種蒽醌類化合物，在缺氧條件下被代謝為AQ4[40]。AQ4是一種具有高親和力的DNA嵌入劑，能抑制拓撲異構酶Ⅱ的作用[41]。與芳香族N-氧化物不同，AQ4N被細胞色素P450同工酶或氧化氮合酶進行雙電子還原[42]。由于這些酶在氧氣存在條件下會被抑制，因此它們具有缺氧選擇性。體外實驗證明，AQ4N與放療或化療聯(lián)合展現(xiàn)出良好的前景，這為AQ4N能夠進入臨床試驗提供依據(jù)[43]。

3.1.4 醌類化合物

醌類化合物絲裂霉素C(MMC)早在1980年就發(fā)現(xiàn)在缺氧腫瘤細胞中會被激活[44]。但是MMC在缺氧條件下被激活的效率是有限的，后來又有研究發(fā)現(xiàn)對缺氧細胞具有更高選擇性的醌類化合物，比如甲基絲裂霉素和EO9(apaziquone)等。在缺氧條件下，這類醌類化合物是通過單電子還原酶被還原成半醌自由基，再進一步被還原酶被激活產生氫醌[45]，最終導致DNA分子內和分子間鏈的交聯(lián)[46]，達到腫瘤治療的目的。其中，吲哚醌EO9[47]對缺氧細胞的選擇性最高，但是由于它半衰期短，限制了其在臨床上的應用。

3.1.5 金屬絡合物

過渡金屬的復合物有可能為缺氧靶向劑使用，盡管至今尚未用于臨床研究。從1993年開始，一系列氮芥絡合物首先作為缺氧選擇劑使用[48]。這類化合物的細胞毒性取決于氮芥的電子密度。氮孤對電子與鈷(Co，III)的配位抑制了烷基化反應。在低氧條件下，Co(III)可以被單電子還原為Co(II)，解離生成細胞毒性配體。目前金屬絡合物作為缺氧細胞殺傷劑只處于體外研究階段。

3.2 生物還原性藥物增效PDT療法

最近，缺氧特異性的生物還原性藥物聯(lián)合PDT在腫瘤治療中引起了極大的關注。Liu等[49]設計了硅-殼上轉換納米粒子(UCNPs)共同遞送光敏劑和生物還原前藥TPZ(圖6(a))，在正常O2環(huán)境下首先通過基于UC-PDT實現(xiàn)了光動力作用，隨后立即激活TPZ，生成具有細胞殺傷作用的自由基，最終產生協(xié)同腫瘤治療效果。與單獨使用UC-PDT相比，TPZ-UC/PS在NIR激光治療后可有效抑制腫瘤生長，這意味著UC-PDT和TPZ的聯(lián)合使用在深部腫瘤治療中顯示出巨大的潛力。

(a)基于上轉換的光動力療法誘導的缺氧[49] (b)包裹缺氧激活前藥脂質體用于腫瘤治療[50]圖6 利用腫瘤缺氧環(huán)境提高PDT療效Fig.6 Utilizingtumor hypoxia for improving the efficacy of PDT

然而，UCNPs中金屬物質在體內難以降解，限制了它的進一步使用。Feng等[50]利用脂質體包裹二氫卟吩和生物還原前藥AQ4N(圖6(b))，所制備得到的AQ4N-hCe6脂質體具有明顯的缺氧依賴性細胞毒性和有效的光動力細胞殺傷能力。該研究為生物還原性藥物增強PDT治療在未來臨床上的應用提供依據(jù)。

4 其他手段調整腫瘤缺氧微環(huán)境提高PDT治療療效

除了上述提到的一些改善腫瘤缺氧環(huán)境提高PDT治療外，腫瘤缺氧微環(huán)境還與缺氧誘導因子(HIFs)的過表達和透明質酸等相關[51-52]。缺氧誘導因子(HIFs)由HIF-1α(氧調節(jié)亞基)和HIF-1β(穩(wěn)定亞基)組成，其中HIF-1α的表達被認為是缺氧的主要轉錄調節(jié)因子。HIF-1在腫瘤血管生成、葡萄糖代謝、腫瘤干細胞的發(fā)育、腫瘤細胞的侵襲與轉移、多藥耐藥性(MDR)等起到重要作用[53-56]。Broekgaarden等[57]利用陽離子脂質體負載HIF-1抑制劑(acriflavine)和光敏劑(ZnPC)，在體外研究時發(fā)現(xiàn)，經該脂質體處理可有效降低HIF-1表達，導致在低氧條件下PDT誘導的表皮樣癌細胞死亡程度增加。

透明質酸是一種陰離子糖胺聚糖，是腫瘤細胞外基質的主要成分之一，被認為與惡性腫瘤的進展和不良預后相關。在乳腺癌和前列腺癌中都已經發(fā)現(xiàn)透明質酸的表達比較高[58-59]。透明質酸酶是能使透明質酸產生低分子化作用酶的總稱，是一種能夠降低體內透明質酸的活性、從而提高組織中液體滲透能力的酶。Gong等[52]利用透明質酸酶增加微血管密度改善腫瘤內的灌注，在4T1荷瘤小鼠模型中有效緩解腫瘤的缺氧狀態(tài)，提高PDT療效。

5 結論與展望

在過去的30多年里，由于具有精確控制治療區(qū)域、重復治療等優(yōu)點，PDT在腫瘤治療中取得了重要進展。但是當前應用的大部分光敏劑在體內溶解度較低、生物利用度不高；激光本身對組織穿透力差，難以達到深層區(qū)域的腫瘤；腫瘤部位乏氧情況降低了PDT療效，因此需要進一步開發(fā)安全有效的PDT治療方式，減少治療后的復發(fā)及轉移。針對這些不足之處，已經有更多的近紅外光光敏劑用于提高組織穿透力，改善PDT療效。筆者主要介紹了通過不同的方法可以有效緩解或者利用腫瘤缺氧微環(huán)境，增強PDT治療療效，最終達到改善腫瘤治療的目標。包括通過光熱效應增加血流量，或者抗血管生成功能的藥物，使腫瘤血管正常化；利用紅細胞、血紅蛋白以及全氟化碳等作為載體有效遞送O2到腫瘤部位；通過H2O2催化酶、MnO2和KMnO4等導致H2O2的分解，在腫瘤原位區(qū)域生成氧氣；利用生物還原藥物聯(lián)合PDT治療以及一些新的策略調整腫瘤缺氧微環(huán)境提高PDT治療療效等。這些不同的治療手段為PDT擴大治療范圍提供了基礎。

然而，盡管以上策略在增效PDT的有效性方面得到了驗證，但其在體內的生物相容性、安全性和藥代動力學特征仍有待進一步研究。因此，仍需探索新的治療手段和方法以有效精確地利用PDT，為其在臨床研究中提供新方向。