王夢飛，朱 紅，焦宏亮,周 華，蔡 恒

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

ROS作為信號因子調(diào)控細(xì)胞多個代謝過程，同時(shí)它又是造成氧化損傷的“罪魁禍?zhǔn)住?。因此，?xì)胞內(nèi)ROS水平的穩(wěn)態(tài)受多種途徑嚴(yán)格控制。為維持ROS處于較低水平，細(xì)胞發(fā)展了酶系和非酶系兩大類抗氧化途徑：酶系包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶與硫氧還蛋白過氧化物酶(PRX)等[9]；非酶系如抗壞血酸(Vc)、還原型谷胱甘肽(GSH)以及一些微量元素(Se、Zn等)。哺乳動物和酵母抗氧化反應(yīng)是相似的，且酵母基因表達(dá)調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與高等生物具有高度同源性，被人們視為現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中的真核模式生物[10]。

隨著測序技術(shù)日益發(fā)展和研究的深入，更加方便科研工作者對具有優(yōu)良抗逆性的野生酵母進(jìn)行基因挖掘。本研究中，筆者以一株從自然界篩選獲取的具有較強(qiáng)抗氧化能力的酵母為研究基礎(chǔ)，對其進(jìn)行菌種鑒定及性狀檢測，隨后通過RNA-seq技術(shù)研究外源添加H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫對該酵母基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄的影響，以深入了解該酵母抗氧化能力優(yōu)良的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NCY33，一株具有較強(qiáng)抗氧化能力的野生酵母，以H2O2為篩選物從自然界獲取。釀酒酵母BY4741(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

酵母培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L；固體加入20 g/L瓊脂，如有需要加入不同濃度H2O2。121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酵母的分離

從含有2 mmol/L H2O2的YPD培養(yǎng)基內(nèi)獲取3株活力最強(qiáng)的酵母，測定抗脂質(zhì)過氧化能力[11]及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)降解率[12]，將抗氧化能力最強(qiáng)的一株命名為NCY33，以釀酒酵母BY4741為參照對象，在含不同濃度H2O2的YPD平板上30 ℃培養(yǎng)3 d，拍照記錄。

1.2.2 菌種鑒定

使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)序列對該菌株進(jìn)行菌種鑒定，引物使用 ITS-1與ITS-4[13]。以NCY33總DNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)純化后送至南京金斯瑞公司完成測序。使用BLASTN搜索識別物種(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用MEGA5.0構(gòu)建菌株進(jìn)化樹，完成菌種鑒定。

1.2.3 酵母氧化脅迫處理

NCY33單菌落接入10 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜，制備種子液。以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量，將種子液接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600為0.6～0.8)。加入H2O2，終濃度為4 mmol/L，為實(shí)驗(yàn)組(test)?？瞻捉M(blank)不加H2O2，培養(yǎng)30 min，離心收集菌體。

1.2.4 RNA的分離與檢測

使用Yeast RNAiso kit(TaKaRa公司)試劑盒提取總RNA。每組3個平行樣。使用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分離鑒定；使用NanoPhotometer?分光光度計(jì)(Implen公司)檢測RNA純度；利用QuIT?RNA檢測試劑盒通過Qube?2 Flurometer(Life Technologies公司)測量RNA濃度；使用安捷倫2100(Agilent Technologies公司)檢測RNA樣品的RNA 完整(RIN)值。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄譜測序

利用磁珠富集mRNA，片段化后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后，隨后使用Agilent 2100對文庫進(jìn)行測序。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為原始測序序列(raw reads)，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads,需要對其過濾，獲得clean reads。由于未找到合適的參考基因組，因此在獲得clean reads后，采用Trinity對clean reads進(jìn)行denove拼接獲取參考基因。采用RSEM軟件(默認(rèn)參數(shù))將clean reads與拼接得到的參考基因進(jìn)行比對，統(tǒng)計(jì)clean reads在參考基因組上的覆蓋度,得到每個樣品對應(yīng)到每個基因上的readcount數(shù)目并進(jìn)行RPKM(reads per kilobase transcriptome per million mapped reads)轉(zhuǎn)化，分析基因的表達(dá)水平(在本文中，RPKM>0.3的基因被認(rèn)為是表達(dá)的)。使用DESeq(篩選閾值padj<0.05)進(jìn)行分析，獲取表達(dá)差異基因并制備火山圖。使用R軟件中的聚類軟件包pheatmap進(jìn)行層次聚類分析。最后進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析，完成基因功能注釋及代謝途徑注釋。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對DPPH降解率及抗脂質(zhì)過氧化能力進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)，p<0.05認(rèn)為差異有顯著性。使用Origin 8.0完成作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株抗氧化能力的檢測

DPPH·是一種穩(wěn)定有機(jī)自由基，在517 nm處有一強(qiáng)吸收峰，可用來檢測某種物質(zhì)的抗氧化能力。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物，其含量在一定程度上可間接反映物質(zhì)的抗氧化能力。測定菌體密度為108cfu/mL時(shí)，菌液的DPPH·降解率和抗脂質(zhì)過氧化率，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：初篩獲得的3株菌，DPPH降解率分別為38.60%±1.91%、30.88%±1.54%和26.40%±1.32%，抗脂質(zhì)過氧化率分別為67.15%±3.22%、53.34%±2.66%和40.78%±2.02%。其中，菌1抗氧化能力最強(qiáng)(p<0.05)，將其命名為NCY33。

圖1 3株菌對DPPH·降解率及抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ratio and anti-lipid peroxidation ability of three strains

NCY33與BY4741在不同濃度H2O2下的生長情況見圖2。

圖2 BY4741、NCY33在不同濃度H2O2下的生長情況Fig.2 Growth of BY4741 and NCY33 with H2O2

由圖2可知：與正常情況相比，2 mmol/L H2O2對兩株菌基本無影響；在4 mmol/L H2O2處理?xiàng)l件下，兩者生長明顯受到抑制，但與BY4741相比，NCY33受到影響較?。辉? mmol/L H2O2處理?xiàng)l件下，BY4741完全無法生長，而NCY33仍能少量生長。因此NCY33抗氧化能力要高于BY4741。

2.2 NCY33的菌種鑒定

ITS序列經(jīng)南京金斯瑞公司測序后，使用BLASTN及MEGA 5.0構(gòu)建出菌種進(jìn)化樹(標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)尺為0.02)，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，該酵母為漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

圖3 菌株NCY33基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial ITS sequences of NCY33

2.3 RNA樣品質(zhì)量檢測

使用1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，18S rRNA與25S rRNA條帶清晰明亮，無拖尾。RNA樣品的純度、濃度以及完整性(RIN值)詳情見表1。由表1可知，OD260/OD280均為2.0～2.2，RIN值為6.9～8.9。這6個RNA樣品質(zhì)量合格，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄譜測序。

圖4 NCY33總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA from NCY33

表1 RNA樣品整體質(zhì)量Table 1 RNA sample overall quality

2.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為raw reads，需對其進(jìn)行過濾，獲得clean reads，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過濾后，每個樣品獲得超過4G數(shù)據(jù)，其中Q30的clean reads占總體的91%以上。樣品GC含量基本相同，基本維持在39.5%左右。數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sample sequencing data

2.5 參考序列的拼接及比對

由于該菌株測序結(jié)果與已公布的多個酵母的基因組配對率較低，僅為10%左右，因此本研究將對測序結(jié)果進(jìn)行無參分析。將clear datas與拼接得到的參考基因進(jìn)行比對，結(jié)果見表3。由表3可知，這6個樣品的比對率均超過87%，數(shù)據(jù)符合要求(比對率(mapping rate)>80%)，可進(jìn)行下一步分析。

表3 Reads與參考序列比對情況一覽表Table 3 Reads and reference sequence comparison list

2.6 差異表達(dá)基因的篩選

使用DESeq(閾值padj<0.05)篩選差異表達(dá)基因，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在4 mmol/L H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫環(huán)境中，NCY33共有2 387個基因出現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，其中有1 286個上調(diào)(紅色)，1 101個下調(diào)(綠色)。

注：橫坐標(biāo)代表表達(dá)倍數(shù)變化；縱坐標(biāo)代表差異顯著程度圖5 實(shí)驗(yàn)組與空白組之間的差異表達(dá)基因Fig.5 Differential expressed genes between test and blank

2.7 差異表達(dá)基因GO富集分析

為獲得基因的功能信息，使用GO數(shù)據(jù)庫完成基因注釋，包括同源蛋白注釋，結(jié)果見圖6?；谛蛄型葱裕凶R別到的基因可以通過一些共同的生物學(xué)特性而被歸類。根據(jù)GO功能大致可分為生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大類29分支。由圖6可知，生物過程中，主要是細(xì)胞代謝過程、有機(jī)物代謝過程、單細(xì)胞生物過程和初級代謝的基因發(fā)生變化。細(xì)胞組分中，差異基因主要集中于細(xì)胞質(zhì)以及膜結(jié)構(gòu)方面，另外，所有參與蛋白酶體的基因全部上調(diào)。分子功能中，參與有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、離子結(jié)合的基因大多差異表達(dá)。

圖6 NCY33在氧化脅迫下的差異表達(dá)基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of the differential expressed genes of NCY33 under oxidation condition

2.8 氧化應(yīng)激耐受的代謝途徑

H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫導(dǎo)致胞內(nèi)多種代謝途徑發(fā)生明顯改變，圖7展示了富集途徑中變化最明顯的20條代謝途徑。在此基礎(chǔ)上，為詳細(xì)了解該酵母的抗氧化機(jī)制，筆者將從多個方向進(jìn)行深入解析。

圖7 KEGG pathway富集散點(diǎn)Fig.7 KEGG pathway enrichment scatter plot

2.8.1 抗氧化系統(tǒng)

圖8 抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄變化Fig.8 Transcriptic changes of antioxidant enzymes under H2O2

2.8.2 DNA修復(fù)途徑

ROS會對基因造成多種損傷，包括堿基氧化、堿基位點(diǎn)脫落和DNA鏈斷裂[18]。ROS造成的損傷主要是通過堿基切除途徑進(jìn)行修復(fù)，且該途徑分為短片段和長片段兩種[19]。圖9為堿基切除修復(fù)途徑中基因轉(zhuǎn)錄的變化情況。由圖9可知，涉及長片段修復(fù)途徑的差異基因全部上調(diào)，ALKA編碼的3-甲基腺嘌呤糖基化酶Ⅱ識別受損堿基，將其切除形成AP位點(diǎn)，該位點(diǎn)被AP核酸內(nèi)切酶(未檢測到變化)處理，形成核苷酸缺口[20]，在POLE1、POLE2和POLD1、POLD2編碼的4個亞基構(gòu)成的DNA聚合酶作用下完成修補(bǔ)。但是多個核苷酸的連接導(dǎo)致原DNA 鏈以單鏈懸臂或者帽子結(jié)構(gòu)暴露出來，這就需要FEN1編碼的皮瓣內(nèi)切酶將其切除。最后在Lig1編碼的DNA連接酶的作用下連接DNA片段，完成修復(fù)。PCNA編碼的增殖細(xì)胞核抗原起到調(diào)控DNA聚合酶的作用。而在短鏈BER途徑中，編碼DNA-甲氨基嘧啶糖基化酶的FPG和編碼內(nèi)切酶3的NTH轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，這一結(jié)果將限制短鏈BER途徑的效率，其原因可能在氧化脅迫下，DNA發(fā)生大規(guī)模損傷，而短鏈修復(fù)途徑效率過低，細(xì)胞此時(shí)主要依賴于長鏈途徑對受損DNA進(jìn)行高效修復(fù)。

圖9 堿基切除修復(fù)途徑中基因轉(zhuǎn)錄變化情況Fig.9 Transcriptic changes of genes in base excision repair

2.8.3 錯誤蛋白的降解途徑

ROS直接對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，可造成DNA突變和MDA(丙二醛)的產(chǎn)生，間接引起蛋白質(zhì)錯誤折疊并聚集。細(xì)胞通過泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)(UPP)和自噬途徑清除錯誤蛋白。泛素化-蛋白酶體途徑需要Ube1(泛素活化酶E1)激活泛素(Ub)，在其甘氨酸殘基和半胱氨酸殘基的活性位點(diǎn)處形成一個硫脂鍵，Ube2(泛素結(jié)合酶)通過硫脂鍵反應(yīng)獲得激活的Ub，隨后Ube3(泛素連接酶)引導(dǎo)激活的Ub從E2轉(zhuǎn)移到蛋白底物，這些被泛素標(biāo)記的蛋白底物在26S蛋白酶體中降解[21]。圖10為涉及蛋白質(zhì)降解途徑的多基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。由圖10可以看到，UBE1、UBE2和3種UBE3轉(zhuǎn)錄水平均升高，蛋白酶體內(nèi)的多個RPN與RPT調(diào)節(jié)亞基以及PSM組成亞基轉(zhuǎn)錄水平均升高了1倍以上，泛素化-蛋白酶體途徑整體增強(qiáng)。細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)都是由泛素化-蛋白酶體途徑完成降解[22]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)聚集體過大時(shí)，蛋白酶體無法將其降解，細(xì)胞啟動自噬途徑進(jìn)行清除[23]。本實(shí)驗(yàn)中ATG1、ATG11、LC3轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)。ATG1是自噬途徑的調(diào)控基因，控制著自噬的啟動。Atg11作為選擇性自噬中的適配蛋白,協(xié)助受體蛋白將目標(biāo)蛋白運(yùn)送至降解位點(diǎn)[24]。LC3編碼γ-氨基丁酸(A)受體相關(guān)蛋白，其活性直接影響形成自噬體的數(shù)量[25]。自噬的適度增強(qiáng)不僅可清除受損蛋白質(zhì)與細(xì)胞器，還可為細(xì)胞的生命活動提供能量與原料。在人體中，迄今已發(fā)現(xiàn)20多種蛋白質(zhì)的錯誤折疊與諸多神經(jīng)退性疾病有關(guān)，如AD、PD、亨廷頓病(HD)和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等[26]。如何增強(qiáng)人體清除錯誤蛋白的能力，是治療多種神經(jīng)退性疾病的一大方向。以酵母作為生物模型，通過研究氧化脅迫下，該酵母參與降解錯誤蛋白的主要途徑及關(guān)鍵基因，進(jìn)一步了解降解機(jī)制，為治療神經(jīng)退性疾病提供新靶點(diǎn)。

圖10 涉及蛋白質(zhì)降解途徑的多個基因變化情況Fig.10 Transcriptic changes of genes relating to protein degradation

2.8.4 能量合成途徑

能量是生物進(jìn)行生命活動的基本要求，真核需氧生物利用葡萄糖通過糖酵解、三羧酸循環(huán)(TCA)、氧化磷酸化以及脂肪酸氧化途徑產(chǎn)生能量，在氧化脅迫環(huán)境中，這些途徑均發(fā)生變化。圖11為能量合成途徑中多個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。由圖11可知，在氧化脅迫下，該酵母糖酵解上游多個基因發(fā)生下調(diào)，如HK(己糖激酶)、GPI(6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)基因，而磷酸戊糖途徑中2個限速酶G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、PGD(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)明顯上調(diào)，其結(jié)果是葡萄糖將主要進(jìn)入磷酸戊糖途徑進(jìn)行初步代謝，最終生成3-磷酸甘油醛重新進(jìn)入糖酵解，隨后在PGAM(磷酸甘油酸變位酶)、ENO(烯醇化酶)和PK(丙酮酸激酶)等酶的作用下生成丙酮酸。這一變化既減少了ATP的消耗又產(chǎn)生了大量NADPH用于抗氧化過程。在脂肪酸β氧化過程中，除編碼?；o酶A脫氫酶的ACADM外都發(fā)生明顯下調(diào)。ACOX編碼脂酰輔酶A氧化酶催化脂酰輔酶A脫氫后，與O2結(jié)合生成H2O2而不是H2O[27]。細(xì)胞可能為避免更多H2O2的生成主動減弱該過程的進(jìn)行。在三羧酸循環(huán)中，基因表達(dá)變化的結(jié)果將導(dǎo)致α-酮戊二酸積累，α-酮戊二酸可直接參與H2O2的清除，同時(shí)也能增強(qiáng)谷胱甘肽的合成增加抗氧化能力[28]。另外，在電子傳遞鏈中幾乎所有差異基因均發(fā)生下調(diào)，尤其是編碼復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ亞基的基因(數(shù)據(jù)未顯示)。二者均是ROS的主要產(chǎn)生位點(diǎn)[29]，這可能與ACOX下調(diào)的原因一致。在氧化脅迫下，該細(xì)胞通過對代謝的整體調(diào)控，維持胞內(nèi)代謝的基本運(yùn)行，避免ROS大量產(chǎn)生的同時(shí)，保證ATP的基本供應(yīng)，產(chǎn)生大量的[H]用于清除ROS，保證細(xì)胞能夠在氧化脅迫下繼續(xù)存活。

圖11 能量合成途徑多個關(guān)鍵基因變化情況Fig.11 Transcriptic changes of genes participating in energy synthesis

3 結(jié)論

從自然界中篩選得到1株DPPH降解能力及抗脂質(zhì)過氧化能力分別為38.60%±1.91%、 67.15%±3.22%且可耐受6 mmol/L H2O2的德巴利漢遜酵母，命名為NCY33。該酵母在H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫下，共有1 286個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，1 101個下調(diào)。通過對可能會影響細(xì)胞抗氧化能力的途徑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該酵母處于氧化脅迫下，調(diào)整能量代謝方式，在維持能量供應(yīng)的同時(shí)避免ROS的產(chǎn)生；增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，用于清除ROS；增強(qiáng)自噬及泛素化途徑，清除錯誤蛋白；提高堿基切除修復(fù)系統(tǒng)對受損DNA進(jìn)行修復(fù)。