劉勝利，劉示杰，劉文龍，馬傳興，王克芬，陸利霞

(1.山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400；2.青島科技大學(xué) 高分子科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266042；3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

磷(phosphorus)是動(dòng)物體內(nèi)除鈣以外含量最豐富的礦物質(zhì)元素，具有重要的代謝功能[1]和生理功能[2]，在形成和維持骨骼組織、維持滲透壓和酸堿平衡[3]、能量利用和轉(zhuǎn)移、蛋白合成、生長(zhǎng)和細(xì)胞膜平衡[4]及細(xì)胞分化等機(jī)體活動(dòng)中起著重要作用，是動(dòng)物體必需的礦物元素。植物性飼料是豬雞日糧配制過(guò)程中的重要組成部分，植物性飼料中，磷主要以植酸磷的形式存在，谷類籽實(shí)原料中的植酸磷含量約占總磷(TP)的 59%～79%，小麥麩中約占 74%，而細(xì)米糠可高達(dá)93%，油渣餅類為58%～70%[5]。植酸磷只有被植酸酶水解后才能被家禽所利用，因家禽消化道中的植酸酶活性很低，植酸磷基本上不能被利用或者其利用率極低，最終未被消化利用的植酸磷隨糞便排出而導(dǎo)致環(huán)境污染[6]。飼料中添加植酸酶，可以使飼料原料中的磷獲得更深層的應(yīng)用，進(jìn)一步促進(jìn)生產(chǎn)性能，改善飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，從而緩解豬雞排泄物污染環(huán)境的壓力。

植酸酶可以降解植酸磷，釋放出供動(dòng)物吸收的磷[7]，還可釋放出其他對(duì)動(dòng)物有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其抗?fàn)I養(yǎng)作用消除，是現(xiàn)代飼料和養(yǎng)殖業(yè)不可缺少的一種安全、無(wú)污染的綠色飼料添加劑。植酸酶是一種胞外酶，本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，廣義上是指與植酸分解相關(guān)的一些酶類[8]，植酸酶包括植物源植酸酶、腸黏膜植酸酶、大腸微生物群植酸酶和外源微生物植酸酶[9]。植酸酶可以改善肉雞對(duì)植物性飼糧中植酸磷的利用率[10]。影響植酸酶應(yīng)用效果的因素有很多，包括植酸酶添加量[11]、磷水平[12]、植酸酶劑型[13]、飼料鈣水平[11]、鈣磷比[14]和其他因素(動(dòng)物種類、性別及年齡等)[15-16]。因此，在使用的過(guò)程中還要綜合全面考慮這些因素。另外植酸酶也可以改善其他營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，如機(jī)體的能量代謝[17]、氨基酸[18]、微量元素[19]等。

現(xiàn)代飼料企業(yè)的加工工藝對(duì)植酸酶的耐溫性能要求較高[20]，飼料企業(yè)制粒階段的溫度通常在85 ℃左右；不同動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶及內(nèi)環(huán)境(包括酸度)對(duì)植酸酶的酶活的影響也很顯著。邱梅平等[21]研究發(fā)現(xiàn)，添加植酸酶使內(nèi)源酶胰蛋白酶酶活提高了38.88%，淀粉酶的酶活提高了1.25%～18.81%，二糖酶酶活提高了0.37%～13.22%。反過(guò)來(lái)，內(nèi)源酶及消化液對(duì)植酸酶酶活的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。陳濤等[22]在體外評(píng)估植酸酶的耐酸穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低于pH 4.0酸性環(huán)境中，植酸酶的酶活損失最少的為最佳產(chǎn)品。苗華彪等[23]發(fā)現(xiàn)，在豬腸液中4種木聚糖酶耐受4 h后，剩余酶活分別為48%、60%、55%和54%；4種甘露聚糖酶耐受4 h后，剩余酶活分別為48%、65%、58%和11%。梁作理等[24]研究發(fā)現(xiàn)，從耐酸性看市場(chǎng)銷售的11種植酸酶的酶活穩(wěn)定性，pH自4.0降至2.5，10號(hào)樣品酶活自93.15%降至57.12%為最好，11號(hào)樣品酶活自75.58%降至49.20%為次之，其他樣品均很差。為了讓畜禽能高效利用飼料中植酸磷，需要選擇穩(wěn)定性好的植酸酶產(chǎn)品，以提高飼養(yǎng)效果?，F(xiàn)在市場(chǎng)上植酸酶種類多，對(duì)不同飼料原料中植酸磷酶解效率不同，對(duì)加工工藝的耐溫性能也千差萬(wàn)別，所以建立評(píng)估方法進(jìn)行科學(xué)評(píng)估顯得很迫切。本研究旨在通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)室評(píng)估耐熱植酸酶的方法，對(duì)耐熱植酸酶質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)評(píng)估，為飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)篩選使用耐熱植酸酶提供指導(dǎo)和方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

10 000 U/g耐熱植酸酶L1和L2由山東隆科特酶制劑有限公司提供，其他10 000 U/g耐熱植酸酶樣品A、B、C、D、E，市場(chǎng)采購(gòu)。底物：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)43%粗蛋白質(zhì)豆粕，臨沂邦基三維油脂有限公司。胃蛋白酶、淀粉酶，Sigma公司；胰蛋白酶、糜蛋白酶，Amresco公司。其他試劑除特殊說(shuō)明外，均為市售分析純；水均為符合規(guī)定的二級(jí)水。清洗試驗(yàn)用器皿不用含磷清洗劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

SDS-Ⅲ型單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)，湖南中本智能科技發(fā)展有限公司；6400型氧彈量熱儀，美國(guó)Parr公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

仿生消化操作過(guò)程中透析袋的型號(hào)和前處理、胃緩沖液和小腸緩沖液的配制及儀器運(yùn)行參數(shù)等試驗(yàn)操作參照文獻(xiàn)[25]。仿生消化采用雞模擬消化設(shè)置參數(shù)；每種樣品處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)使用1根消化器。

1.3.1 體外仿生消化對(duì)消化液中耐熱植酸酶的酶活留存率影響

1)模擬胃消化液配制。用36.5%濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0并定容至500 mL，取250 mL將胃蛋白酶387.5 kU溶解其中，得模擬胃消化液。

2)待測(cè)酶液配制。稱取酶制劑樣品并溶解于pH 2.0 鹽酸液，作為待測(cè)對(duì)照酶液；另用模擬胃消化液溶解各酶制劑樣品，作為待測(cè)試驗(yàn)酶液。

3)胃緩沖液配制(2 000 mL)。稱取NaCl 2.17 g，KCl 1.57 g，溶解于pH 2.0 的鹽酸溶液中并定容至2 000 mL。

4)模擬小腸液的配制(22 mL)。將胰蛋白酶(Amresco 0785)11.926 kU、糜蛋白酶(Amresco 0164)2.737 kU、淀粉酶(Sigma A3306)97.153 kU溶解定容至22 mL。

5)小腸前段緩沖液的配制(2 000 mL)。稱取無(wú)水Na2HPO49.35 g，無(wú)水NaH2PO440.99 g，NaCl 11.13 g，KCl 3.09 g，青霉素160萬(wàn)U。溶解后調(diào)節(jié)pH至6.50，并定容至2 000 mL。

6)小腸后段緩沖液的配制(2 000 mL)。稱取無(wú)水Na2HPO448.77 g，無(wú)水NaH2PO46.77 g，NaCl 10.03 g，KCl 2.79 g，青霉素160萬(wàn)U。溶解后調(diào)節(jié)pH至6.50，并定容至2 000 mL。

7)模擬胃消化過(guò)程。透析袋中加入20 mL模擬胃液。將模擬消化器置于仿生消化系統(tǒng)中，接好管路。對(duì)照組和試驗(yàn)組各5根消化器，每組5根模擬消化器間串聯(lián)連接。參數(shù)為溫度41 ℃，胃緩沖液流速120 mL/min，消化4 h，去離子水1 500 mL/次清洗，每次清洗40 min，共清洗3次。

8)模擬小腸液消化過(guò)程。模擬胃消化后，將2 mL模擬小腸液移入單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)試驗(yàn)組儲(chǔ)備室中，對(duì)照組儲(chǔ)備室中移入2 mL去離子水。參數(shù)為溫度41 ℃，小腸緩沖液流速120 mL/min，小腸前段消化時(shí)間為7.5 h，后段消化時(shí)間為7.5 h，去離子水1 500 mL/次清洗，每次清洗40 min，共清洗6次。消化結(jié)束后，試驗(yàn)組和對(duì)照組的每根消化器各取 1 mL酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，計(jì)算消化液中酶活留存率，見(jiàn)式(1)。

(1)

1.3.2 體外仿生消化評(píng)估耐熱植酸酶對(duì)植酸磷的酶解率

用沉淀消解法[26]測(cè)定43%豆粕中的植酸磷含量，以不同濃度的耐熱植酸酶(0.5、1、2、4和8 U/g)采用體外仿生消化[25]酶解43%豆粕中植酸磷(參見(jiàn)1.3.1節(jié))，沉淀消解法測(cè)定剩余殘?jiān)兄菜崃缀?，差量法?jì)算酶解豆粕釋放磷的量，見(jiàn)式(2)。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)。

酶解豆粕釋放磷的量=起始豆粕植酸磷值-豆粕殘?jiān)菜崃字?/p>

(2)

1.3.3 水浴法模擬高溫制粒對(duì)耐熱植酸酶酶活的影響

以水浴法模擬飼料的85 ℃高溫制粒過(guò)程，評(píng)估對(duì)耐熱植酸酶酶活的影響。用pH 5.5緩沖溶液稀釋耐熱植酸酶的酶活至100 U/mL，在不同溫度(85 ℃、90 ℃)水浴中保溫3 min后，取出冷卻至室溫，按照國(guó)標(biāo)GB/T 18634—2009測(cè)定酶活，具體計(jì)算見(jiàn)式(3)。

存留植酸酶酶活=耐熱植酸酶添加量×消化液中酶活留存率

(3)

1.3.4 仿生消化條件下耐熱植酸酶L1對(duì)豆粕酶解的影響

飼料試樣的采集按照GB/T 14699.1—2005進(jìn)行。將樣品粉碎至250 μm，稱取1.000 0 g試樣于模擬消化器中，同步測(cè)定試樣干物質(zhì)含量，運(yùn)行模擬消化過(guò)程[25]，耐熱植酸酶添加濃度參照1.3.2節(jié)，根據(jù)式(3)和表1中耐熱植酸酶消化液中留存率，計(jì)算存留酶活，并做消化液中存留酶活釋放磷的回歸分析；通過(guò)偏導(dǎo)數(shù)法計(jì)算出耐熱植酸酶存留酶活最佳添加量和釋放磷最大值，得出單位耐熱植酸酶釋放磷量、耐熱植酸酶L1的酶活最佳添加量和干物質(zhì)消化率提高值及酶水解物能值提高值。具體計(jì)算見(jiàn)式(4)～(9)。

(4)

式中：DMD為豆粕體外干物質(zhì)消化率，%；M1為上樣豆粕干物質(zhì)質(zhì)量，g；M2為未消化殘?jiān)晌镔|(zhì)質(zhì)量，g。

(5)

式中：EHGE為豆粕體外酶水解物能值，MJ/kg；GE1為上樣豆粕總能，J；GE2為未消化殘?jiān)偰?，J。

豆粕干物質(zhì)消化率提高值=試驗(yàn)組豆粕干物質(zhì)消化率-對(duì)照組豆粕干物質(zhì)消化率

(6)

A=EHGE′-EHGE0

(7)

式中：A為豆粕酶水解物能值提高值，MJ/kg；EHGE′為試驗(yàn)組豆粕酶水解物能值，MJ/kg；EHGE0為對(duì)照組豆粕酶水解物能值，MJ/kg。

(8)

式中:PAP為單位耐熱酶釋放磷量，g/t；Pmax為釋放磷最大值，g/t；Mopt為存留酶活最佳添加量，U/g；Ewater為90 ℃水浴3 min植酸酶存留率，%；Edigest為消化液中酶活存留率，%。

(9)

式中，M為最佳酶活添加量，U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬胃腸消化液對(duì)耐熱植酸酶留存率的影響

梁作理等[24]以不同pH處理11種植酸酶對(duì)其酶活的影響，以pH 5.5為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH降至3.0和2.5時(shí)，10號(hào)和11號(hào)樣相對(duì)酶活均最高，分別超過(guò)70%和50%，其他樣相對(duì)酶活均低于50%。本研究中，耐熱植酸酶模擬胃腸消化液中酶活留存率如表1所示。由表1可知：在試驗(yàn)條件下模擬胃腸消化液對(duì)耐熱植酸酶酶活留存率的影響顯著，酶活留存率最高的是樣品A(73.08%)；樣品L2酶活留存率71.64%，屬次之；其他樣品均較差，差異顯著(P<0.05)，酶活留存率最低的為樣品L1(51.06%)；在模擬胃腸消化液中按照酶活留存率由高到低的排序是A、L2、C、D、E、B、L1，與梁作理等[24]研究的結(jié)果一致。

表1耐熱植酸酶模擬胃腸消化液中酶活留存率(n=5)

Table 1 Retention rate of enzyme activity in the simulated gastric digestive juice by different thermostable phytase(n=5)

樣品樣品比酶活/(U·g-1)消化液存留比酶活/(U·g-1)酶活留存率/%L111 578.95 912.2±93.32f51.06fL211 236.28 049.6±131.77d71.64bA15 281.311 167.6±431.05a73.08aB16 367.59 026.7±85.26b55.15eC13 466.09 050.5±96.66b67.21cD12 126.27 611.6±136.03e62.77dE14 538.08 733.0±190.15c60.07d

2.2 體外消化法評(píng)估耐熱植酸酶對(duì)植酸磷的酶解影響

參照文獻(xiàn)[26-27]的相關(guān)方法，添加有耐熱植酸酶的豆粕，在體外仿生消化結(jié)束前后測(cè)出植酸磷含量，以差量法計(jì)算植酸酶酶解植酸磷的磷釋放量，結(jié)果如表2所示。

表2 豆粕中添加不同耐熱植酸酶體外仿生法測(cè)定磷釋放量(n=5)Table 2 Phosphorus release amount of adding different thermostable phytase to soybean meal by Bionics method in vitro(n=5)

由表2可知：在含有43%蛋白質(zhì)豆粕中添加植酸酶0.5 U/g時(shí)，磷釋放量最高的是樣品D和E，分別為935.2和970.3 g/t，樣品A的最低(564.6 g/t)，樣品間磷釋放量差異顯著(P<0.05)；在含有43%蛋白質(zhì)豆粕中添加植酸酶1.0 U/g時(shí)，樣品A的磷釋放量最高(1 180.1 g/t)，樣品C的磷釋放量最低(707 g/t)，樣品間磷釋放量差異顯著(P<0.05)；在含有43%蛋白質(zhì)豆粕中的添加植酸酶2.0 U/g時(shí)，樣品A和B的磷釋放量最高，分別為2 013.5 g/t和2 079.4 g/t，樣品B的磷釋放量最低(1 300.8 g/t)，樣品間磷釋放量差異顯著(P<0.05)；在含有43%蛋白質(zhì)豆粕中添加植酸酶4.0 U/g時(shí)，樣品A的磷釋放量最高(4 122.2 g/t)，樣品C和D的釋放量最低，分別為2 136.6 g/t和2 136.1 g/t，樣品間磷釋放量差異顯著(P<0.05)；在含有43%蛋白質(zhì)豆粕中添加植酸酶8.0 U/g時(shí)，樣品A的磷釋放量最高(4 142.8 g/t)，樣品L2、A、B的釋放量最低，分別為2 339.3 g/t、2 412 g/t、2 335 g/t，樣品間磷釋放量差異顯著(P<0.05)。由此可見(jiàn)，隨耐熱植酸酶在豆粕中的添加量逐漸升高時(shí)，磷釋放量也逐漸升高，這和Dersjant-Li等[28]的研究結(jié)果一致。

2.3 仿生消化條件下耐熱植酸酶酶解豆粕釋放磷的分析

據(jù)1.3.2節(jié)耐熱植酸酶的添加梯度和表1中耐熱植酸酶消化液中留存率，對(duì)消化液中存留酶活釋放磷作回歸分析，求出回歸方程，并通過(guò)偏導(dǎo)數(shù)法計(jì)算出耐熱植酸酶存留酶活最佳添加量和釋放磷最大值，結(jié)果如表3和表4所示。

表4 不同耐熱植酸酶釋放磷Table 4 Release phosphorus of different thermostable phytase

由表3可知，耐熱植酸酶樣品L1釋放磷的最大值為4 497.8 g/t，存留酶活最佳添加量為3.239 U/g；樣品B釋放磷最低為2 329.8 g/t，存留酶活最佳添加量為3.990 U/g。

表3 消化液中存留酶活和釋放磷回歸分析表Table 3 Regression analysis of phosphorus release amount and retention enzyme activity in digestive juice

由表4可知，單位酶活釋放磷值最高的植酸酶樣品是L1，為465.51 g/t，單位酶活釋放磷最低的植酸酶樣品是E，為29.56 g/t，按照單位酶活釋放磷由高到低的排序是L1、L2、A、B、C、D、E。

2.4 水浴法模擬高溫85 ℃制粒過(guò)程對(duì)耐熱植酸酶酶活的影響

水浴法模擬飼料生產(chǎn)的高溫制粒過(guò)程對(duì)酶活的影響，參照趙春等[20]研究結(jié)果及依據(jù)調(diào)查，飼料企業(yè)通常以85 ℃調(diào)制制粒。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)以實(shí)際制粒溫度為85 ℃調(diào)制制粒，以88%干物質(zhì)為基礎(chǔ)，比較各植酸酶樣品的耐溫制粒后的酶活留存率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：水浴法3 min 85 ℃的酶活留存率最高的是樣品L2(99.5%)，酶活留存率最低的是樣品E(7.78%)，差異顯著(P<0.05)；同時(shí)與各樣品生產(chǎn)實(shí)際的85 ℃調(diào)制制粒的酶活留存率相比，差異顯著(P<0.05)；各耐熱植酸酶樣品水浴法3 min 90 ℃的酶活留存率和實(shí)際85 ℃調(diào)制制粒的酶活留存率接近，差異不顯著(P>0.05)；實(shí)際生產(chǎn)85 ℃調(diào)制制粒的酶活留存率最高的是樣品L2(69.82%)，最低的是樣品E(6.99%)。按照實(shí)際生產(chǎn)85 ℃調(diào)制制粒酶活留存率由高到低的排序是L2、A、L1、B、C、D、E，與水浴法3 min 90 ℃的酶活留存率排序一致，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室水浴法3 min 90 ℃更適于評(píng)估實(shí)際生產(chǎn)中的植酸酶酶活。

表5 實(shí)際制粒和水浴法模擬制粒對(duì)耐熱植酸酶酶活的影響(n=5)Table 5 Effects of granulation on different thermostable phytase activity by actual granulation and water bath method(n=5)

2.5 仿生消化條件下L1耐熱植酸酶酶解豆粕的效果分析

仿生消化條件下L1耐熱植酸酶酶解豆粕的效果見(jiàn)表6。

表6 耐熱植酸酶L1酶解豆粕效果(n=5)Table 6 Effects of thermostable phytase L1 on soybean meal(n=5)

由表6可知，在43%豆粕中，隨著植酸酶添加量的增加，植酸酶酶解植酸磷釋放磷的量逐步提高，用EXCEL求出回歸方程，并通過(guò)偏導(dǎo)數(shù)法計(jì)算出耐熱植酸酶最佳添加量，結(jié)果表明存留酶活最佳添加量為3.239 U/g。建立釋放磷(y)和存留酶活添加量(x)之間的二次回歸方程：y=-438.64x2+2 841.9x-105.27(R2=0.987 8)，得到最佳酶活添加量為9.663 U/g。隨著植酸酶的添加量增加，豆粕中的干物質(zhì)消化率逐步提高，當(dāng)耐熱植酸酶在豆粕中存留酶活最佳添加量為1.651 U/g時(shí)，干物質(zhì)消化率提高為0.238 1%，此時(shí)提升幅度達(dá)到最大，得出最佳酶活添加量為4.926 U/g。建立干物質(zhì)消化率提高值(y)和存留酶活添加量(x)之間的二次回歸方程：y=-0.073x2+0.241 1x+0.039(R2=0.965 0)。隨著植酸酶的添加水平增加，豆粕中的酶水解物能值逐步提高，存留酶活添加量最佳為1.850 U/g時(shí)，酶水解物能值提高值最大為(0.093 4 MJ/kg)，得出本試驗(yàn)條件下最佳酶活添加量為5.518 U/g。建立酶水解物能值提高值(y)和存留酶活添加量(x)之間的二次回歸方程：y=-0.023 3x2+0.086 2x+0.013 7(R2=0.932 3)。這與Wealleans等[29]和Moss等[30]研究的結(jié)果有一致性。

3 討論

3.1 基于飼料實(shí)際調(diào)制制粒條件下的水浴法對(duì)耐熱植酸酶有效性的評(píng)估

飼料加工過(guò)程對(duì)植酸酶產(chǎn)生的失活作用是限制植酸酶進(jìn)一步推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。目前，市場(chǎng)上已有多種耐熱植酸酶產(chǎn)品推出，但產(chǎn)品對(duì)飼料制粒過(guò)程的耐受性能仍然是最受關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，如何對(duì)不同的耐熱植酸酶產(chǎn)品進(jìn)行耐熱性能的評(píng)價(jià)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，比較常見(jiàn)的評(píng)價(jià)植酸酶耐熱性能的方法有水浴法[31]、干熱法[32]、濕熱法[32]和調(diào)制制粒評(píng)估[20]。無(wú)論水浴法、干熱法還是濕熱法來(lái)評(píng)估耐熱植酸酶的熱穩(wěn)定性都只能作為參考，植酸酶能否耐受制粒的條件、制粒后酶活留存率能達(dá)到多少，最具有說(shuō)服力的就是實(shí)際調(diào)制制粒后檢測(cè)得到濕熱擠壓條件變化后的酶活數(shù)據(jù)。水浴法是通過(guò)高溫處理液體酶制劑，評(píng)估酶蛋白本身的耐熱性能，不適合于評(píng)估包被型植酸酶的耐熱性，因?yàn)闊崽幚頃r(shí)酶液濃度對(duì)酶活留存率也有影響。通過(guò)大量研究和數(shù)據(jù)分析，本研究進(jìn)行了水浴法(3 min 85 ℃和3 min 90 ℃)、85 ℃實(shí)際調(diào)制制粒對(duì)耐熱植酸酶酶活留存率的比較分析，建立了基于85 ℃實(shí)際調(diào)制制粒的水浴法(3 min 90 ℃)來(lái)評(píng)估耐熱植酸酶的有效性，結(jié)果表明，水浴法是一種簡(jiǎn)單快速并易于重現(xiàn)的方法，水浴法3 min 90 ℃更接近85 ℃調(diào)制制粒酶活損失情況，該評(píng)價(jià)方法與馬俊孝等[33]報(bào)道的不一致，與王海燕等[31]報(bào)道的一致。以飼料企業(yè)實(shí)際調(diào)制和制粒后酶活留存率為指標(biāo)來(lái)評(píng)估植酸酶耐熱性，由于不同廠家設(shè)備比如環(huán)?？讖?、飼料配方類型及配比、飼料制粒過(guò)程中的調(diào)制溫度、調(diào)制時(shí)間、蒸汽壓力等參數(shù)有較大的差異，因此需要對(duì)水浴法評(píng)估的時(shí)間和溫度及酶液濃度等做出適當(dāng)調(diào)整，使該評(píng)估方法更接近于特定飼料廠生產(chǎn)的實(shí)際。本研究提供一種調(diào)制制粒評(píng)估方法和水浴評(píng)估方法相結(jié)合的評(píng)估方法，以實(shí)際調(diào)制制粒評(píng)估的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，具有可靠性和可行性，與水浴法結(jié)合后易于在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行和重演，適用性好。

3.2 耐熱植酸酶有效性的傳統(tǒng)體外法評(píng)價(jià)和體外仿生評(píng)價(jià)的比較

飼用酶制劑的有效性實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)已經(jīng)成為飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)的迫切需要，因?yàn)椴捎脛?dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)飼用酶的有效性耗時(shí)、費(fèi)力、變異大，試驗(yàn)結(jié)果誤差較大[34]等缺點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外試圖探索快捷、易標(biāo)準(zhǔn)化的體外法評(píng)價(jià)飼用酶的有效性。Alabi等[35]采用胃蛋白酶-胰液素體外兩步法評(píng)價(jià)Roxazyme G、木聚糖酶和植酸酶有效性，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外評(píng)價(jià)法可用于動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)。Kong等[36]分別用胃蛋白酶-胰液素兩步法和胃蛋白酶-胰液素-微生物三步法研究了木聚糖酶、蛋白酶和植酸酶組成的混合酶對(duì)9種不同來(lái)源的飼料原料體外回腸和全消化道干物質(zhì)消化率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源酶對(duì)體外干物質(zhì)消化率和作用受飼料原料和研究方法的影響。Malathi等[37]利用兩步法評(píng)價(jià)木聚糖酶混合酶對(duì)常見(jiàn)雞飼料原料非淀粉多糖消化率的影響，并提出體外法是快速評(píng)價(jià)外源酶有效性和穩(wěn)定性的方法。傳統(tǒng)體外法的廣泛應(yīng)用常常受到模擬消化酶來(lái)源和濃度變異大、體外參數(shù)設(shè)置缺乏理論解釋等因素的制約[38]。

基于單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)的仿生法在“標(biāo)準(zhǔn)化、儀器化、自動(dòng)化”等方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，保證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確性[39-41]。動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立了豬禽飼料生物學(xué)效價(jià)的仿生學(xué)評(píng)價(jià)方法[39-42]，該仿生法與動(dòng)物試驗(yàn)法測(cè)定的干物質(zhì)消化率、能量消化率、代謝能等之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性[43-46]，并且精度高，可預(yù)判外源酶的有效性[47]，為飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)獲得外源酶最適添加量，并可利用仿生法篩選豬禽飼料的最佳酶譜[48-49]。本研究采用單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)的仿生評(píng)價(jià)方法開(kāi)展了評(píng)判耐熱植酸酶效率的指標(biāo)：在體外仿生模擬胃腸消化液中酶活留存率、體外仿生消化法中植酸磷的磷釋放量，并建立基于飼料實(shí)際調(diào)制制粒條件下的水浴法，對(duì)耐熱植酸酶的有效性進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)植酸酶酶活留存率，得出單位酶活磷釋放量，為飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)在實(shí)驗(yàn)室中評(píng)判及篩選使用耐熱植酸酶提供了方案和數(shù)據(jù)支撐點(diǎn)；體外仿生條件下，依據(jù)耐熱植酸酶酶解豆粕植酸磷釋放磷量(g/t)、干物質(zhì)消化率提高值(%)、酶水解物能值提高值(MJ/Kg)得出最佳酶活添加量，指導(dǎo)飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)確定最適添加量。該仿生法的靈敏度與排空強(qiáng)飼法相比靈敏度高、檢測(cè)項(xiàng)更低，其高精度和低變異度可用于評(píng)定外源酶制劑的作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，各耐熱植酸酶用水浴法(3 min 90 ℃)后測(cè)得留存酶活和生產(chǎn)實(shí)際85 ℃調(diào)制制粒的留存酶活基本一致，差異不顯著(P>0.05)，故用水浴法(3 min 90 ℃)評(píng)估生產(chǎn)實(shí)際調(diào)制制粒后的耐熱植酸酶酶活留存率是可行的。根據(jù)耐熱植酸酶在體外仿生系統(tǒng)模擬胃腸消化液中的酶活留存率、體外仿生消化法中植酸磷的酶解磷釋放量、水浴法模擬高溫制粒過(guò)程中的酶活留存率等指標(biāo)，得出單位酶活釋放磷量是評(píng)判耐熱植酸酶適宜指標(biāo)。本試驗(yàn)采用的單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)各指標(biāo)確定耐熱植酸酶的最適添加量，可為實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)飼用耐熱植酸酶的有效性提供方法參考。