張翰林,郭惠寶,白娜玲,張娟琴,鄭憲清,李雙喜,張海韻,呂衛(wèi)光*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所,上海201403;2 農(nóng)業(yè)部上海農(nóng)業(yè)環(huán)境與耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,上海201403;3 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201403;4 上海光明長(zhǎng)江現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司,上海202178)

我國(guó)西瓜種植面積居世界第一位,每年約在100 萬(wàn)—120 萬(wàn)hm2。 西瓜連作模式特別是大棚溫室連作栽培,破壞了土壤微生態(tài)環(huán)境,引起有益菌種群結(jié)構(gòu)的改變和數(shù)量降低,導(dǎo)致了嚴(yán)重的連作障礙[1-3],如何有效緩解連作西瓜土壤障礙已成為西瓜生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急,對(duì)保障食品安全、減少產(chǎn)地環(huán)境污染具有重大的理論和實(shí)際價(jià)值。 目前西瓜土壤連作障礙的防治與緩解措施主要有抗病品種培育,農(nóng)業(yè)管理措施,化學(xué)防治和微生物防治[4-6]。 以上措施均具有一定的效果,但也均有各自的局限性,如時(shí)耗較長(zhǎng)、投入品易造成二次污染等。 因此,開發(fā)生態(tài)高效的西瓜土壤連作障礙調(diào)控新方法,并對(duì)其調(diào)控效果進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

蚯蚓在改善土壤物理性狀,促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán),調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能等方面均已有所報(bào)道,這為其修復(fù)農(nóng)作物土壤連作障礙從理論上提供了可行性[7-8]。 目前利用蚯蚓開展連作障礙修復(fù)的研究主要是采用蚯蚓糞便或蚯蚓堆肥,Szczech[9]發(fā)現(xiàn)蚯蚓堆肥可有效抑制番茄病原體,其效果與蚯蚓堆肥添加量呈正相關(guān),且蚯蚓堆肥中微生物發(fā)揮了主要的抑制作用;蚯蚓堆肥也可以顯著降低西瓜與番茄枯萎病的發(fā)病率,改善果實(shí)品質(zhì)[10];此外,添加蚯蚓糞也可以顯著增加設(shè)施番茄、韭菜土壤三大菌的數(shù)量,提高土壤細(xì)菌多樣性以及土壤酶活性[11]。 直接采用蚯蚓活體對(duì)連作障礙土壤進(jìn)行修復(fù)目前尚處于試驗(yàn)性階段,相關(guān)研究還并不多見。

本研究在西瓜連作土壤中接種蚯蚓,1 個(gè)月后分析土壤理化性質(zhì)、土壤細(xì)菌群落多樣性與酶活性,探討接種蚯蚓對(duì)西瓜連作土壤障礙的修復(fù)改良作用,為修復(fù)連作西瓜土壤障礙開拓新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤來(lái)源:土壤來(lái)自于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)站西瓜種植大棚,在2017 年6 月西瓜收獲后取樣。種植西瓜品種為早春紅玉,障礙土壤取自3 年西瓜連作大棚內(nèi),大棚內(nèi)西瓜產(chǎn)量已大幅減少30%—50%,輪作土壤取自旁邊西瓜-蔬菜輪作大棚內(nèi),取樣深度均為0—20 cm。 供試土壤類型為潮土。 試驗(yàn)所用障礙土壤基本理化性狀:全氮3.1 g∕kg,全磷1.0 g∕kg,全鉀6.2 g∕kg,pH 7.89,EC 0.11 mS∕cm,有機(jī)質(zhì)18.7 g∕kg;試驗(yàn)所用輪作土壤基本性狀:全氮2.9 g∕kg,全磷2.1 g∕kg,全鉀11.8 g∕kg,pH 7.27,EC 0.66 mS∕cm,有機(jī)質(zhì)37.4 g∕kg。

蚯蚓來(lái)源:試驗(yàn)品種為威廉環(huán)毛蚓(Pheretima guillelmi),取自于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院崇明試驗(yàn)基地。 選取個(gè)體大小一致,質(zhì)量在2 g 左右的成年蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)容器:選用底部直徑為20 cm、高為25 cm 的圓柱形鐵桶作為試驗(yàn)容器。 底部打4 個(gè)孔,四周打8個(gè)孔,底部和四周打孔處內(nèi)附50 目(篩孔孔徑270 μm,下同)細(xì)紗網(wǎng),容器上口同樣采用50 目細(xì)紗網(wǎng)覆蓋防止蚯蚓逃逸。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了研究蚯蚓接種密度對(duì)修復(fù)效果的影響,試驗(yàn)共設(shè)置6 個(gè)處理,分別為輪作土壤對(duì)照(NCK)、輪作土壤+500 條∕m2蚯蚓(N1)、輪作土壤+1 000 條∕m2蚯蚓(N2)和障礙土壤對(duì)照(DCK)、障礙土壤+500 條∕m2蚯蚓(D1)、障礙土壤+1 000 條∕m2蚯蚓(D2),每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。 其中對(duì)照處理不接種蚯蚓,500 條∕m2蚯蚓處理每個(gè)試驗(yàn)容器接種15 條蚯蚓,1 000 條∕m2蚯蚓處理每個(gè)試驗(yàn)容器接種30 條蚯蚓。 保持試驗(yàn)溫度在25 ℃,維持土壤表面濕度在65%—70%。

1.3 樣品采集

在土壤培育1 個(gè)月后對(duì)將容器內(nèi)土壤混勻后取樣。 土壤一部分進(jìn)行風(fēng)干,測(cè)定土壤理化性質(zhì),另一部分土壤保存在-20 ℃,進(jìn)行土壤DNA 提取及后續(xù)變性梯度凝膠電泳分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性測(cè)定

土壤總氮和速效氮均采用2 mol∕L 氯化鉀溶液浸提,按照凱氏定氮法測(cè)定;總磷采用酸溶-鉬銻抗比色法(5 mol∕L 硫酸浸提),速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測(cè)定(0.5 mol∕L 碳酸氫鈉溶液浸提);全鉀采用氫氧化鈉熔融法-火焰光度計(jì)法,速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度計(jì)法測(cè)定(1 mol∕L 乙酸銨溶液浸提);土壤微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測(cè)定[12];pH 采用電位法測(cè)定(水土體積比2.5∶1),有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定。

土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定,蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定,過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[8]。

1.4.2 變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析

取0.5 g 土壤樣品,使用Soil DNA Kit(50)(OMEGA)提取土壤DNA。 DNA 提取及純化后采用0.7%瓊脂 糖 凝 膠 檢 驗(yàn)。 土 壤 DNA 采 用 細(xì) 菌 16 S rDNA 的 V3 區(qū) 通 用 引 物 F341GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和R517(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 采用25 μL 體系:10 ×PCR buffer 5 μL(with MgCl2),dNTP 0.5 μL,引物各0.5 μL,Tap 酶0.25 μL(250 U),模板1 μL。 采用降落PCR 策略[13]:96 ℃預(yù)變性5 min,之后94 ℃1 min,55—65 ℃1 min,72 ℃3 min,20 個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0.5 ℃,后接94 ℃1 min,55 ℃1 min,72 ℃3 min,10 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。 DGGE 電泳采用8%濃度的聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度為40%—60%,在60 ℃條件下,60 V 電泳12 h。 電泳結(jié)束后進(jìn)行SYBR Green I 染色,用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

DGGE 圖譜通過Quantity One 軟件進(jìn)行分析,采用其中的UPGAMA 程序進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析。 微生物群落多樣性通過Shannon-Weaver 指數(shù)(H′)來(lái)表示,計(jì)算公式為:

式中,Pi為第i 個(gè)條帶出現(xiàn)的概率,Ni為第i 個(gè)條帶的序列擴(kuò)增量,N 為所有條帶的擴(kuò)增總量(N =ΣNi),S 為DNA 序列豐富度指數(shù),即單條泳道的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種蚯蚓對(duì)連作西瓜土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

由表1 可知,接種蚯蚓處理均顯著提升了連作土壤EC 和降低速效磷(P ＜0.05),其中1 000 條∕m2蚯蚓處理還可以顯著提升連作土壤速效氮和速效鉀(P ＜0.05)。 在輪作土壤中,接種蚯蚓均顯著提升了土壤速效磷,降低了輪作土壤EC、有機(jī)質(zhì)、全氮(P ＜0.05),1 000 條∕m2蚯蚓處理則還顯著降低了土壤全磷,提升了土壤速效氮和速效鉀(P ＜0.05)。

2.2 接種蚯蚓對(duì)連作西瓜土壤微生物量和酶活性的影響

經(jīng)蚯蚓處理后,土壤微生物量碳氮在不同土壤中變化趨勢(shì)相反(表2)。 在輪作土壤中,蚯蚓處理后微生物量碳氮與微生物碳氮比均有顯著降低(P＜0.05)。 與NCK 相比,微生物量碳氮分別降低了18.0%—19.3%和15.7%—16.7%。 而在連作障礙土壤中,蚯蚓處理后微生物量碳氮均有顯著提升,微生物碳氮比則同樣顯著降低(P＜0.05)。 與DCK 相比,微生物量碳氮分別提高了8.2%—11.4% 和68.9%—75.1%。 不同蚯蚓接種數(shù)量對(duì)土壤微生物量碳氮含量則沒有顯著影響。

表1 蚯蚓處理后土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Soil chemical properties after earthworm treatments

表2 蚯蚓處理后土壤微生物量碳氮Table 2 Soil microbial biomass carbon and nitrogen contents after earthworm treatments

蚯蚓處理后的土壤酶活性見表3。 蚯蚓處理后蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶酶活性均顯著提高,與連作障礙土壤和輪作對(duì)照相比,蔗糖酶分別提高了69.4%—108.3%和26.0%—38.4%,脲酶分別提高了46.0%—71.8%和21.5%—42.6%,過氧化氫酶則分別提高了41.0%—59.0%和22.6%—46.1%。 且隨蚯蚓接種數(shù)量的增加,三種酶活性也均顯著提升(P＜0.05)。

表3 蚯蚓處理后土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities after earthworm treatments

2.3 接種蚯蚓對(duì)連作西瓜土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

基于DGGE 圖譜,采用Quantity One 對(duì)其進(jìn)行分析計(jì)算,得到土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)H′(圖1)。 與連作土壤和輪作土壤對(duì)照相比,蚯蚓處理提高了多樣性指數(shù)H′,且1 000 條∕m2蚯蚓處理均高于500 條∕m2蚯蚓處理,但連作土壤經(jīng)蚯蚓修復(fù)后,其細(xì)菌群落多樣性依然低于輪作土壤對(duì)照處理。

對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行UPGMA 聚類分析的結(jié)果如圖2 所示。 接種蚯蚓對(duì)西瓜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。 N1 和N2 受蚯蚓的影響相似度最高,為78%,而在連作障礙土壤中接種蚯蚓使得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)逐步趨近于輪作對(duì)照處理,D1 和D2 與NCK 的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度分別為58%和64%,DCK 則與其他處理差異最大,群落結(jié)構(gòu)相似度僅為54%。

土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)H′、酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析見表4。 細(xì)菌多樣性指數(shù)H′與土壤速效氮(P＜0.01)、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷(P＜0.05)呈顯著正相關(guān),過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶和尿酶的相關(guān)性分析結(jié)果一致,均與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01),與速效氮呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

表4 土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)、酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 4 The correlation between H′,soil enzyme activities and soil chemical properties

3 結(jié)論與討論

蚯蚓對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響顯著,有研究顯示,蚯蚓可顯著降低鹽漬化土壤EC,改良濱海農(nóng)田土壤[14],促進(jìn)土壤中磷素的分散化分布,增加土壤速效磷含量[15],這與本研究中蚯蚓對(duì)輪作土壤的影響相符。 作物連作易造成土壤養(yǎng)分不均衡,如氮素或磷素的過量積累[16],導(dǎo)致作物減產(chǎn)、抗逆性降低。 本研究中,與NCK 相比,DCK 速效磷含量提高了16.0%,出現(xiàn)了過度積累,而在EC、有機(jī)質(zhì)、全量氮磷鉀和速效氮鉀則均顯著降低。 在障礙土壤中接種蚯蚓,顯著提升了EC、速效鉀,并降低了由于連作而導(dǎo)致的過量速效磷含量,有效的平衡了土壤養(yǎng)分狀況。 D2 與D1 相比,顯著提升了速效氮含量,但整體土壤養(yǎng)分水平依然低于NCK。 土壤EC 代表了土壤水溶性鹽的含量水平,與土壤養(yǎng)分礦化關(guān)系緊密。 一般來(lái)說,EC 在0.4—1 時(shí)最適宜作物生長(zhǎng)。 接種蚯蚓后,由于其吞食過程,消耗了部分輪作土壤的水溶性鹽,使其降低;但在連作土壤中,已經(jīng)出現(xiàn)EC 過低的障礙情況(0.16),蚯蚓可能通過其吞食與挖掘活動(dòng),促進(jìn)部分不溶性鹽轉(zhuǎn)化為可溶性鹽,改善了土壤理化環(huán)境[14]。

土壤微生物量碳氮是反映土壤微生物數(shù)量與活性的重要指標(biāo)[7]。 有研究顯示蚯蚓由于吞噬作用和分泌黏液對(duì)部分微生物的抑制作用,導(dǎo)致微生物總量減少,降低了微生物量碳氮[17-18],這與本研究輪作土壤中結(jié)論一致。 也有研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過4 年田間小區(qū)定位實(shí)驗(yàn)后,蚯蚓會(huì)顯著提升稻麥輪作系統(tǒng)土壤微生物量碳氮的水平[19],這可能是由于有作物根系參與其中,且實(shí)驗(yàn)的區(qū)域范圍與時(shí)間長(zhǎng)度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過本研究。 在連作障礙土壤中,則可能是因?yàn)榻臃N蚯蚓改善了土壤理化性質(zhì),平衡了由于西瓜連作造成的土壤養(yǎng)分失調(diào)(表1),改善了土壤理化條件,有效促進(jìn)了土壤微生物生長(zhǎng),進(jìn)而提高了土壤微生物量碳氮含量[20]。

土壤酶活性是衡量土壤養(yǎng)分循環(huán)能力的重要指標(biāo)[7]。 陶軍等[21]發(fā)現(xiàn),秸稈還田條件下,接種蚯蚓顯著提高了稻麥輪作土壤中的蛋白酶和蔗糖酶活性;鄭憲清等[22]通過對(duì)利用蚯蚓進(jìn)行生物耕作的菜田進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),土壤過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性均顯著提高,且生物耕作的時(shí)間越長(zhǎng)影響越大。 蚯蚓一方面通過改變土壤養(yǎng)分水平,如有機(jī)質(zhì)、速效養(yǎng)分等,促進(jìn)微生物活性提高,從而提升土壤酶活性。 在本研究中土壤酶活性與土壤速效氮含量顯著正相關(guān)(表4),蚯蚓在提升土壤速效養(yǎng)分的同時(shí),也增加了酶活性;另一方面,大量蚓糞的產(chǎn)生也帶來(lái)了豐富的養(yǎng)分與微生物,這也是促進(jìn)土壤酶活性提高的一個(gè)重要因素[11]。 本研究還發(fā)現(xiàn),接種蚯蚓對(duì)連作障礙土壤酶活性的提升程度均高于輪作土壤,且D2 修復(fù)后土壤酶活性水平已經(jīng)達(dá)到甚至超過NCK,表明接種蚯蚓可以有效緩解連作障礙造成的酶活性低下的情況。

連作西瓜土壤障礙的一個(gè)主要表現(xiàn)就是微生物群落多樣性下降,細(xì)菌數(shù)量下降而真菌數(shù)量上升,導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)與功能失調(diào)[23],因此,改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有助于緩解土壤連作障礙。 本研究中,蚯蚓處理后,輪作土壤和連作障礙土壤中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)H′均有所提升,表明無(wú)論是障礙土壤還是健康土壤,蚯蚓均可以顯著改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),與前人研究結(jié)果相似。 于建光等[24]發(fā)現(xiàn),在紅壤當(dāng)中接種蚯蚓,微生物基質(zhì)利用豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著增大;Aira 等[25]在72 h 短期基質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)中也得到了相同的結(jié)論。 但連作障礙土壤經(jīng)蚯蚓處理后,其多樣性指數(shù)H’接近但還依然低于NCK,聚類分析也展示了類似結(jié)果,D1 和D2 處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)向NCK 趨近,尤其是1 000 條∕m2蚯蚓數(shù)量修復(fù)連作障礙土壤效果明顯,但與輪作健康土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)尚有一定差別。 本研究中,蚯蚓接種密度越大,其改善土壤理化及微生物狀況的效果就越好,提升土壤速效養(yǎng)分,并正向的改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。 但過高的蚯蚓接種密度可能會(huì)降低土壤全量養(yǎng)分,礦化速度過快,造成養(yǎng)分流失[26]。 在未來(lái)的研究中,一方面還需要應(yīng)用宏基因組等手段,明確具體微生物群落結(jié)構(gòu)差異種屬及其生態(tài)功能,另一方面還需要在蚯蚓密度方面開展細(xì)化研究,探索改善障礙土壤的最佳接種密度,進(jìn)一步為接種蚯蚓緩解西瓜連作土壤障礙提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述,在西瓜連作土壤中接種蚯蚓可以顯著改善由于連作造成的土壤養(yǎng)分失調(diào)、微生物數(shù)量降低、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到破壞等障礙問題,蚯蚓接種密度為1 000 條∕m2時(shí)改善效果優(yōu)于500 條∕m2。