于夢(mèng)蕓 王海英 梁翠梅 胡慧

腹型肥胖(abdominal obesity)是指脂肪在腹部或腹腔內(nèi)臟部積聚過多，故又稱中心性肥胖。隨著世界腹型肥胖的發(fā)生率的增加，許多人生活在代謝綜合征的高風(fēng)險(xiǎn)中，而代謝綜合征會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病和2型糖尿病等并發(fā)癥的發(fā)展[1]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織分為白色脂肪組織(white adipose tissue， WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)，兩種脂肪組織通過WAT存儲(chǔ)能量、BAT消耗能量的方式共同調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝[2]。研究表明，在冷刺激或β腎上腺素能受體激動(dòng)劑的作用下，小鼠WAT中會(huì)出現(xiàn)散在的棕色樣脂肪細(xì)胞，且細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加，氧化磷酸化加快，這種分化過程稱為白色脂肪棕色化，多種轉(zhuǎn)錄因子與信號(hào)通路參與其中[3]。UCP1是BAT的特異性表達(dá)基因，參與產(chǎn)熱調(diào)節(jié)，是白色脂肪棕色化的主要體現(xiàn)[4]，PGC-1α在調(diào)動(dòng)UCP1活性過程中起重要作用[5]，PRDM16是促進(jìn)棕色脂肪分化的關(guān)鍵因子[6]。臨床療效已證明針刺具有改善患者的腹型肥胖的作用[7-8]，針灸可通過調(diào)節(jié)下丘腦中樞神經(jīng)抑制食欲[9]，調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)促進(jìn)脂肪分化[10]等多種途徑改善肥胖。因此本研究通過高脂飲食建立腹型肥胖小鼠，以WAT中的PGC-1α、UCP1、PRDM16基因和蛋白表達(dá)變化為切入點(diǎn)，從白色脂肪棕色化的角度探討針灸治療腹型肥胖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4周齡雄性C57BL/6J小鼠35只，體質(zhì)量(14±1)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(京)2012-0036， 飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：溫度為(22±2)℃，濕度為50%～60%左右。人工控制室內(nèi)照明，保持12小時(shí)晝夜交替循環(huán)。所有小鼠均可自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 試劑及儀器

一次性無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；PGC-1α、UCP1和PRDM16抗體(貨號(hào)：ab54481、ab10983、ab106410，美國(guó)Abcam)；β-Actin(貨號(hào)：AC001-M,美國(guó)Santa Cruz)；山羊抗兔igG、山羊抗鼠igG(貨號(hào)：SH-0031、SH-0011,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；igG TRIzol?Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：15596-018、AM2044、4385614，美國(guó)Invitrogen)；PVDF轉(zhuǎn)印膜(貨號(hào)：XLL092-2，美國(guó)Thermo Fisher)；AL204電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)； 石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA)；NIKON Eclipse ci顯微鏡、NIKON digital sight DS-FI2成像系統(tǒng)(日本NIKON公司)。CMNS6-1型脈沖針灸治療儀(無錫佳健醫(yī)療器械有限公司)；小鼠固定器(150 mm×65 mm×50 mm，上海華巖儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 造模與分組

隨機(jī)抽取6只小鼠為空白對(duì)照組，采用一般飼料喂養(yǎng)，其余29只造模小鼠采用高脂純合飼料(購(gòu)自Research DIETS公司，含20%蛋白、45%脂肪、35%碳水化合物，能量密度4.7 kcal/g)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)12周后，稱量體重、腹圍。造模組體重、腹圍大于空白組平均值20%的小鼠被認(rèn)定為腹型肥胖[11-12]。將造模成功的12只小鼠隨機(jī)分為模型組6只和針刺組6只，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。

1.4 干預(yù)方法

針刺組：按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位附圖中的取穴方法取雙側(cè)“帶脈”穴。將小鼠置于定制的小鼠固定器內(nèi)固定，充分暴露針刺部位，用0.30 mm×25 mm一次性無菌針灸針，直刺雙側(cè)“帶脈”穴，深度3～4 mm，連接電針儀的正負(fù)極，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流強(qiáng)度1.5 mA，隔日1次，15分鐘/次。模型組和空白組同步固定，不做任何其他處理。共干預(yù)8周。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 體質(zhì)量和腹圍的測(cè)定 干預(yù)前后測(cè)量體質(zhì)量、腹圍。在天平上放置一個(gè)小盆，計(jì)數(shù)調(diào)“0”，稱取小鼠體重；1人將小鼠抓起固定，使其仰臥位，另1人用卷尺測(cè)量小鼠腹部劍突與后肢間垂直距離中點(diǎn)的周徑。

1.5.2 脂肪組織HE 染色 將WAT、BAT經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片(4 μm厚)，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述，對(duì)應(yīng)主要描述部位進(jìn)行拍照。

1.5.3 Western Blot法檢測(cè)WAT中PGC-1α、UCP1、PRDM16蛋白的表達(dá)水平 取100 mg的WAT，加入1 mL RIPA裂解液，勻漿充分至無塊狀；冰浴中超聲粉碎組織，4℃ 12000 rpm離心10 分鐘；輕取上清液進(jìn)行BCA法蛋白定量，制備樣品；制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉30 分鐘。UCP1和PGC-1α一抗以1∶1000稀釋，β-Actin一抗以1∶5000稀釋，4℃過夜孵育。次日用洗膜后二抗，室溫孵育2小時(shí)，再次洗膜。將混勻后的ECL發(fā)光液加于PVDF膜，在成像系統(tǒng)中成像，imageJ軟件進(jìn)行灰度值處理分析，以β-Actin為內(nèi)參，分別以UCP1、PGC-1α、PRDM16與內(nèi)參比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 熒光定量PCR法檢測(cè)WAT中PGC-1α、UCP1、PRDM16的mRNA的表達(dá) 將50 mg的WAT充分研磨后加入1 mL Trizol震蕩混勻裂解，離心，取上清加入200 μL氯仿，漩渦震蕩混勻，再離心取上清液加入等體積的異丙醇，離心，加入1 mL75%乙醇后離心，棄上清，將沉淀真空干燥10分鐘加入30 μL DEPC水中。進(jìn)行RNA鑒定及反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。擴(kuò)增按照以下條件反應(yīng)：95℃預(yù)變性2分鐘，95℃變性15秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束以后，PCR儀給出各個(gè)反應(yīng)孔的Ct值，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，根據(jù)公式2計(jì)算各個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重、腹圍的變化

針刺治療前，與空白組相比，模型組的體重和腹圍明顯增加(P<0.05，P<0.05)，說明造模成功。針刺治療后，與空白組比較，模型組體重和腹圍顯著增加(P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組的體重和腹圍明顯下降(P<0.05，P<0.05)。見表2。

2.2 各組小鼠雙側(cè)腎周白色脂肪及肩胛間棕色脂肪病理形態(tài)變化

在白色脂肪中，空白組脂肪細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列緊密，呈蜂窩狀；模型組與空白組相比細(xì)胞體積明顯增大，呈現(xiàn)出大空泡的脂肪室，且形狀不規(guī)則，白色脂肪特征明顯；針刺組白色脂肪細(xì)胞出現(xiàn)多室，細(xì)胞變小、變圓，組織更加致密；在棕色脂肪中，空白組小鼠呈現(xiàn)近圓形的小的脂肪室，脂肪細(xì)胞旁邊具有豐富的毛細(xì)血管；模型組小鼠呈現(xiàn)出較大的、單個(gè)空泡脂肪室；與模型組相比，針刺組細(xì)胞較小，細(xì)胞數(shù)目增多呈片狀，細(xì)胞間的毛細(xì)血管更加豐富，表明針刺后小鼠肩胛間的棕色脂肪細(xì)胞出現(xiàn)了增殖與分化。見圖1。

注：A:空白組白色脂肪；B:模型組白色脂肪；C:針刺組白色脂肪；D:空白組棕色脂肪；E:模型組棕色脂肪；F：針刺組棕色脂肪。

表2 各組小鼠體重、腹圍治療前后的比較

2.3 針刺對(duì)WAT中UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白水平的影響

與空白組相比，模型組的WAT中的UCP1、PGC-1α和PRDM16蛋白水平明顯下降(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組的UCP1和PRDM16蛋白水平明顯升高(P<0.05，P<0.05), PGC-1α呈上升趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3、圖2。

表3 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16蛋白表達(dá)的比較

圖2 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16蛋白表達(dá)的比較

2.4 針刺對(duì)WAT中UCP1、PGC-1α和PRDM16 mRNA表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組WAT中UCP1、PGC-1α和PRDM16 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組WAT中UCP1和PRDM16 mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.05，P<0.05)，PGC-1αmRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表4。

表4 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16 mRNA表達(dá)的比較

3 討論

脂肪組織是機(jī)體主要的代謝器官，在能量穩(wěn)態(tài)中具有關(guān)鍵作用[13]。UCP1的過度表達(dá)是白色脂肪棕色化的一個(gè)重要標(biāo)志，在BAT中尤為明顯。與其他細(xì)胞相比，棕色脂肪細(xì)胞主要通過UCP1以熱能(非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱)的形式，將線粒體膜間質(zhì)子滲透內(nèi)膜至線粒體基質(zhì)中，從而更大程度地解偶聯(lián)三磷酸腺苷合成過程中線粒體的電子傳遞。PGC-1α是脂肪棕色化過程中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是線粒體產(chǎn)熱和氧化磷酸化的主要調(diào)節(jié)基因，它能夠結(jié)合UCP1的啟動(dòng)子區(qū)，高表達(dá)的PGC-1α可上調(diào)UCP1的表達(dá)水平，加速機(jī)體產(chǎn)熱[14]。PRDM16既可促進(jìn)棕色脂肪的產(chǎn)生，也能抑制白色脂肪的分化。WAT中PRDM16的表達(dá)代表白色脂肪棕色化的程度[15]，同時(shí)PRDM16過度表達(dá)可以誘導(dǎo)UCP1和PGC-1α的高表達(dá)[16]。本研究針刺干預(yù)后腹型肥胖小鼠的體重和腹圍均明顯下降；其病理圖片WAT和BAT細(xì)胞變小，更致密，表明針刺可以促進(jìn)棕色樣脂肪和BAT的增殖和分化。同時(shí)針刺組的WAT中棕色脂肪的標(biāo)志物的UCP1、PGC-1α和PRDM16的mRNA表達(dá)和蛋白水平均上調(diào)，更是驗(yàn)證針刺可能通過調(diào)節(jié)脂肪棕色化，增加機(jī)體能量消耗，減少脂肪累積，進(jìn)一步改善肥胖。

腹型肥胖的起因多與帶脈約束功能失調(diào)有關(guān)，帶脈“起于季肋，環(huán)身一周”，經(jīng)帶脈、五樞、維道三穴與足少陽(yáng)膽經(jīng)交會(huì)。以橫行腹部為特點(diǎn)，起到約束縱行上下的諸條足經(jīng)和奇經(jīng)的作用。帶脈失約，則脾不升清、胃不降濁如“腹?jié)M腰溶溶若坐水中”，腹部脂肪堆積則“縱腹垂腴”，腹型肥胖的病變部位正處于帶脈循行的范圍內(nèi)。因此，本研究以通調(diào)帶脈為治則，選用帶脈與足少陽(yáng)膽經(jīng)的交會(huì)穴帶脈穴，《針灸大成》記載，帶脈穴可主治“腰腹縱，溶溶如囊水之狀”，因此針刺帶脈穴可以激發(fā)帶脈經(jīng)氣，提高約束能力，改善腹型肥胖。李敏等[17]以帶脈穴位埋線法治療腹型肥胖中風(fēng)患者療效顯著，優(yōu)于二甲雙胍組和空白對(duì)照組。沈凌宇等[18]選用帶脈、天樞、大橫等穴位對(duì)腹型肥胖多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者針刺治療12周后發(fā)現(xiàn)，通調(diào)帶脈針刺法可顯著降低腹型肥胖PCOS患者的腰圍、血清空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)。李媛媛等[19]針刺治療代謝綜合征大鼠帶脈穴4周后，針刺組大鼠體重、空腹血糖值、胰島素抵抗值(HOMA insulin-resistance，HOMA-IR)以及血脂三項(xiàng)包括甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)較模型組明顯下降(P<0.05)，表明針刺帶脈穴可以改善代謝綜合征大鼠胰島素抵抗，具有減重調(diào)脂降血糖的作用。王海英等[12]以電針腹型肥胖大鼠雙側(cè)“帶脈穴”干預(yù)8周后，可有效減少腹型肥胖大鼠體重和腹圍，降低血清中TC、TG、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平，改善腹型肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)代謝。本研究在中醫(yī)整體觀和經(jīng)絡(luò)辨證的基礎(chǔ)上，擬通調(diào)帶脈法治療腹型肥胖取得良好的效果，與上述結(jié)論相符合。

綜上所述，針刺帶脈穴可明顯抑制高脂飲食誘導(dǎo)的腹型肥胖小鼠體重和腹圍的增長(zhǎng)，改善WAT和BAT細(xì)胞形態(tài)，增加WAT中棕色脂肪的標(biāo)記物UCP1、PGC-1α和PRDM16基因和蛋白的表達(dá)，激活棕色脂肪組織活性的同時(shí)誘導(dǎo)白色脂肪棕色化，增加產(chǎn)能，減少白色脂肪在腹部的堆積，在研究肥胖等相關(guān)代謝性疾病中具有重要意義。