鄭 敏，張世忠，王 劭，謝開春，江丹丹，肖世峰,2，陳少鶯,2*，鄧國(guó)華

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；3.福建省南平市延平區(qū)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，福建 南平 353000；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

嵌杯病毒科（Caliciviridae）病毒粒子一般呈球形或近球形，核衣殼呈二十面體對(duì)稱，直徑27 nm～40 nm。嵌杯病毒為單股、正鏈RNA 病毒，其基因組約為7.4 kb～8.4 kb[1]。禽類嵌杯病毒根據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白與衣殼蛋白氨基酸序列遺傳變異關(guān)系通?？蓜澐譃閮蓚€(gè)屬：Bavovirus 與Nacovirus[2-4]，基因組包含2 個(gè)開放閱讀框（ORFs），靠近基因組5'端的ORF1 具備編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）的功能，NS 蛋白裂解成N 末端蛋白（Nterm）、核苷三磷酸酶（NTPase）、3A 樣蛋白、VPg、蛋白酶（Pro）和RNA 聚合酶（Pol）。2016 年張大丙等借助宏基因組測(cè)序從腸炎患鵝的腸道病料樣品中檢測(cè)到一種新基因型水禽嵌杯病毒株H146，暫命名為Sanovirus 屬鵝嵌杯病毒（Goose calicivirus，GCV），與Nacovirus 屬成員NS 蛋白的同源性僅為31%～34%[5]，與Sanovirus 屬鉆水鴨源嵌杯病毒株MW20 的Nterm 蛋白相比，GCV H146 株的Nterm 蛋白存在170 個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失。水禽嵌杯病毒NTPase 氨基酸序列較為保守，具有NTP酶活性和解旋酶活性，可以促進(jìn)子代病毒復(fù)制[3-5]。2018 年至今，本實(shí)驗(yàn)室利用隨機(jī)擴(kuò)增的方法從福建各地區(qū)發(fā)生痛風(fēng)的鵝中相繼檢測(cè)出一種新的GCV 株，該病毒株與鵝腸炎型GCV H146 株同源性很高，因此被命名為H146-like GCV[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)H146-like GCV 在放牧鵝群中的發(fā)病特點(diǎn)、傳播途徑及流行趨勢(shì)等方面的研究工作還處于起步階段。因此，采用合適的檢測(cè)方法加強(qiáng)對(duì)H146-like GCV 的流行病學(xué)監(jiān)控，對(duì)鵝病毒性腸炎與痛風(fēng)的早期防治具有重要意義。

目前水禽嵌杯病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要通過常規(guī)PCR 與測(cè)序進(jìn)行[7-8]，這些常規(guī)方法與熒光定量PCR檢測(cè)方法相比，操作繁瑣且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。熒光定量PCR 具有靈敏度高、特異性好、可靠性強(qiáng)和實(shí)時(shí)準(zhǔn)確等特點(diǎn)，且PCR 結(jié)束后可以直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，降低了開蓋點(diǎn)樣造成污染的可能性[9-12]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了檢測(cè)多種嵌杯病毒的熒光定量PCR 方法[13-15]，在嵌杯病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面展示了良好的應(yīng)用前景。分子流行病學(xué)分析表明，Sanovirus 屬H146-like GCV 在自然宿主中的流行近年來(lái)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[2,6]，因此，本研究針對(duì)GCV NS 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立一種可以特異性檢測(cè)H146-like GCV 的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測(cè)方法，為監(jiān)測(cè)水禽嵌杯病毒的流行狀況以及GCV 的鑒別檢測(cè)、定量分析提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸及病料樣品鵝星狀病毒（GoAstV）、鵝副粘病毒（GPMV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、Ⅰ型鴨肝炎病毒（DHAV-1）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）等病毒基因組核酸樣品以及H146-like GCV 陽(yáng)性雛鵝腎組織樣品均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒室鑒定并保存。62份疑似感染H146-like GCV 雛鵝病料（包括肝、脾、腎和腸道等組織樣品）為本實(shí)驗(yàn)室2018 年～2019 年采集自福建不同地區(qū)鵝養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、Pre?mix Ex TaqTM、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp MinElute Virus Spin Kit 病毒DNA/RNA 共提取試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司；DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)粒快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)參照GenBank 中GCV H146 株基因序列（KY399947）進(jìn)行比對(duì)分析，選擇其NS 基因保守區(qū)域，利用Oligo 6.0 和Express 3.0 設(shè)計(jì)常規(guī)RT-PCR 特異性引物GCV-P1/GCV-P2 以及熒光定量RT-PCR 特異性引物GCV-QP3/GCV-QP4 與TaqMan-MGB 熒光探針（GCV-Probe）（表1），探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記MGBNFQ，預(yù)期擴(kuò)增目的片段分別為269 bp和134 bp。引物與探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequence used in this study

1.4 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成將經(jīng)隨機(jī)引物PCR 方法鑒定為GCV 感染的鵝痛風(fēng)腎臟組織樣品進(jìn)行研磨，與滅菌PBS 充分混勻，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。利用病毒DNA/RNA 共提取試劑盒提取病毒總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR 方法的建立

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以H146-like GCV cDNA 為模板，按照Premix TaqTM說明書，以GCV-P1/GCV-P2引物進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增。常規(guī)PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆于pMD18-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-GCV，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白分析儀測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒的OD260nm值，并根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)計(jì)算單位體積中質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.07×1010拷貝/μL，-20 ℃保存陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照熒光定量試劑盒說明書配制20 μL 的反應(yīng)體系，通過溫度梯度PCR 以不同退火溫度（52 ℃～65 ℃）進(jìn)行TaqMan-MGB 熒光定量PCR 反應(yīng)確定引物的最適退火溫度，采用矩陣法對(duì)引物濃度（5 μmol/L～20 μmol/L）和 探 針 濃 度（1.25 μmol/L～20 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得最適合的探針與引物的濃度配比以及反應(yīng)條件。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋至濃度為5.07×109拷貝/μL～5.07×101拷貝/μL，以其為模板，采用優(yōu)化后的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，繪制動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)以GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等病毒的cDNA 或DNA 為模板，采用本實(shí)驗(yàn)建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的特異性，同時(shí)以滅菌ddH2O 為陰性對(duì)照，H146-like GCV cDNA 為陽(yáng)性對(duì)照。

1.7 敏感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10 倍倍比稀釋，以10個(gè)不同稀釋度（5.07×109拷貝/μL～5.07×100拷貝/μL）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別為模板進(jìn)行TaqMan-MGB 熒光定量PCR 擴(kuò)增，以滅菌ddH2O 為陰性對(duì)照，分別利用本研究建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 和1.5.1 中常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)分別以同一批次和不同批次制備的不同拷貝數(shù)（5.07×108拷貝/μL、5.07×107拷貝/μL、5.07×106拷貝/μL）標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用優(yōu)化后的條件分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)模板分別做3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的62 份疑似H146-like GCV 感染雛鵝的肝臟、脾臟、腎臟、腸道等樣品，以滅菌PBS 研磨，反復(fù)凍融3 次后取上清，提取樣品總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，同時(shí)利用本研究建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法和1.5.1 中常規(guī)PCR 方法對(duì)62 份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)，比較二者檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果優(yōu)化后的熒光定量TaqMan-MGB PCR 最佳反應(yīng)體系（20 μL）如 下：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）混合液10 μL、上、下游引物GCV-QP3/GCV-QP4（10 μmol/L）各0.5 μL、探針（GCV-Probe）（5 μmol/L）1 μL、模板1 μL、無(wú)RNase 水補(bǔ)足至終體積20 μL。優(yōu)化的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將pMD-GCV 標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板經(jīng)建立的熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，該標(biāo)準(zhǔn)曲線在5.07×109拷貝/μL～5.07×102拷貝/μL 8 個(gè)不同濃度范圍內(nèi)與Ct 值具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.995（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.5579，截距為33.75，直線方程為：y=-3.5579x+33.75。

圖1 H146-like GCV 熒光定量PCR 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線（單位：拷貝/μL）Fig.1 Amplified kinetic curve and standard curve of H146-like GCV real-time PCR (Unit: copies/μL)

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法對(duì)GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等 病 毒 的cDNA 或DNA 進(jìn) 行 檢測(cè)，以H146-like GCV cDNA 為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測(cè)方法僅對(duì)H146-like GCV 呈現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，而滅菌ddH2O 對(duì)照和其它病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖2），表明本研究建立的檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 H146-like GCV 熒光定量PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specificity for H146-like GCV real-time PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板，分別采用TaqMan-MGB熒光定量PCR和常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法能檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為5.07×102拷貝/μL，而常規(guī)PCR 方法最低檢測(cè)濃度為5.07×104拷貝/μL（圖3），滅菌ddH2O陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，TaqMan-MGB 熒光定量檢測(cè)方法比常規(guī)PCR 方法敏感100 倍，表明本研究建立的方法具有更高的敏感性。

圖3 GCV 熒光定量PCR(A)和常規(guī)PCR 方法(B)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of the GCV real-time PCR (A) and the conventional PCR (B)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用3 種濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（5.07×106拷貝/μL～5.07×108拷貝/μL）分別進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.6%（表2），表明建立的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測(cè)利用建立的GCV TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法對(duì)62 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR 測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品58 份，檢出率為93.5%，常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品45 份，檢出率僅為72.6%；常規(guī)PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的45 份樣品經(jīng)TaqMan-MBG 熒光定量PCR 方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，二者的符合率為77.59%（表3），表明建立的Taq?Man-MGB 熒光定量PCR 方法可用于臨床樣品中GCV的檢測(cè)，且比常規(guī)PCR 方法敏感。

3 討 論

近年來(lái)，中國(guó)、美國(guó)、加拿大、巴西等多個(gè)國(guó)家均報(bào)道稱通過宏基因組等技術(shù)發(fā)現(xiàn)健康候鳥與涉禽個(gè)體可以攜帶Nacovirus 屬和Sanovirus 屬的水禽嵌杯病毒[2-3,6-8]。國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病防控研究室于2014 年報(bào)道了我國(guó)健康鵝群中存在Nacovirus 屬GCV，2014 年至今國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)水禽嵌杯病毒分子流行病學(xué)調(diào)查以及病毒株基因序列分析表明，Sanovirus 屬GCV 是引起我國(guó)鵝病毒性腸炎與傳染性生長(zhǎng)阻滯綜合征的重要病原之一[3,6,16-17]。目前H146-like GCV 與其它腸道病毒的共感特性及其染機(jī)制尚不清楚，為了解GCV 在我國(guó)鵝群中的感染情況，建立一種便捷、準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法具有重要意義。

表2 H146-like GCV 熒光定量PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility assay of H146-like GCV real-time PCR

表3 TaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法與常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果及符合率Table 3 Detection results and coincidence rate of TaqMan-MGB real-time PCR and conventional PCR

TaqMan-MGB 探針特異性好，敏感性更高，張秀娥等用MGB 探針和普通探針熒光定量PCR 方法檢測(cè)兔病毒性出血癥病毒，發(fā)現(xiàn)MGB 探針定量范圍更寬[18]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針為MGB 探針，MGB 可以顯著增強(qiáng)探針與模板的結(jié)合能力，提高探針的Tm值，使探針的長(zhǎng)度縮短，結(jié)合效率提高，尤其對(duì)于GCV NS 基因中AT 含量較高的序列，MGB 探針的設(shè)計(jì)更具有優(yōu)勢(shì)。MGB 探針的3'端的淬滅基團(tuán)標(biāo)記不發(fā)光的NFQ 熒光基團(tuán)，可極大消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，使反應(yīng)的背景值更低，增加了反應(yīng)的特異性，提高了擴(kuò)增效率[19-20]。

本研究根據(jù)H146-like GCV 基因組的保守基因NS 設(shè)計(jì)特異性的引物和MGB 探針，建立了檢測(cè)GCV 的TaqMan-MGB 熒光定量PCR 檢測(cè)方法，該方法對(duì)于GCV 的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)GoAstV、GP?MV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 核酸樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。經(jīng)測(cè)序分析表明，TaqMan-MGB 熒光定量檢測(cè)方法擴(kuò)增的GCV NS 基因PCR 目標(biāo)序列與參考序列同源性為93.3%～100%；批間、批內(nèi)各組變異系數(shù)均低于1.6%，顯示了該方法良好的特異性、穩(wěn)定性與可靠性。采用本研究建立的Taq?Man-MGB 熒光定量PCR 方法對(duì)臨床疑似GCV 感染的病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR 符合率為77.59%，表明針對(duì)NS 基因建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR 方法可為H146-like GCV 的快速檢測(cè)及其流行病學(xué)調(diào)查提供有力的技術(shù)支持。