彭志豪，韓蕎憶，崔明江，范葶莉，劉 瑩，王夢佳，馬玉忠，左玉柱*，任玉紅*，范京惠*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧總站，河北 石家莊 050035；3.滄州職業(yè)技術學院，河北 滄州 061000）

牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）和牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCV）是引起犢牛腹瀉的主要病原，感染犢牛后引起的疾病具有發(fā)病率高、流行性廣、危害性大等特點，嚴重影響我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。BRV 臨床上常導致30 日齡內(nèi)犢牛水樣腹瀉、嚴重脫水和酸中毒，7 日齡犢牛感染BRV 時病死率較高，部分表現(xiàn)為溫和性自限性腹瀉和隱性感染[1-2]。BCV 主要引起犢牛出血性腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染，該病嚴重影響病畜的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能的發(fā)揮[1,3]。由于二者臨床上難以僅憑癥狀鑒別，且常發(fā)生混合感染，加重腹瀉的嚴重程度，導致死亡率升高[2]，因此建立一種快速、靈敏、特異性強的檢測方法對準確診斷BRV 和BCV 的感染具有重要意義。

隨著分子生物學的發(fā)展，PCR 方法在檢測中的應用越來越廣，而TaqMan 熒光定量PCR 是近些年來新一代的檢測方法，該方法用來檢測樣品的同時還可以對病毒拷貝數(shù)準確定量，在病原診斷和分析方面具有更廣闊的應用前景[4]。目前，尚無針對BRV 和BCV 的雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法的報道。基于此，本研究根據(jù)BRV VP6 基因保守序列和BCV N 基因保守序列分別設計1 對特異性引物和探針，建立了能夠同時檢測BRV 和BCV 的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法，為BRV 和BCV 的臨床檢測提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛細小病毒（BPV）、牛腸道病毒（BEV）、牛傳染性鼻氣管炎（IBRV）均由河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院保存。72 份牛腹瀉糞便樣品于2019 年3 月～9 月采自河北省不同規(guī)?；觯４嬗?80 ℃。

1.2 主要試劑DNA/RNA 提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、Fast TaqMan Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細胞均購自寶生物工程（大連）有限公司、Super GelRed?核酸染料購自蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.3 引物和探針的設計與合成根據(jù)GenBank 登錄 的BRV VP6 基 因（MN047454）和BCV N 基 因（MN517908）序列，利用Beacon designer 7 分別設計2對特異性引物和探針（表1）。引物和探針均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 探針及引物Table 1 Primers and probes for the real-time PCR

1.4 重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建和鑒定利用DNA/RNA 提取試劑盒提取BRV、BCV 病毒核酸，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，分別作為模板，以BRV-F/BRV-R 和BCV-F/BCV-R 引物分別經(jīng)PCR 擴增相應病毒目的基因。BRV 的反應條件：94 ℃5 min；94℃30 s、53 ℃30 s、72 ℃15 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。BCV的反應條件：94 ℃3 min；94℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃15 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后連接到pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，PCR 鑒定為陽性后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序鑒定，并利用Nanodrop 2000 測定質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)，作為相應病毒的質(zhì)粒標準品。

1.5 雙重熒光定量PCR 條件優(yōu)化及標準曲線的建立

采用方陣法優(yōu)化引物探針濃度，體系為20 μL，其中2×Fast TaqMan Mixture 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.1 μL、0.2 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL，探針（10 μmo1/L）各0.1 μL、0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL，BRV 和BCV 重組 質(zhì) 粒 標 準品 各1 μL 混勻后作為模版，ddH2O 補充至20 μL。使用優(yōu)化好的引物和探針體系經(jīng)PCR 擴增，優(yōu)化退火溫度（56 ℃～62 ℃）。

將BRV 和BCV 的重組質(zhì)粒標準品按1:1 混勻后10 倍倍比稀釋，選取6 個濃度（1.0×107拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL）作為模板，按照優(yōu)化好的反應體系和條件進行雙重熒光定量PCR 擴增，以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct 值為縱坐標建立標準曲線。

1.6 特異性試驗利用DNA/RNA 提取試劑盒提取BRV、BCV、BVDV、BEV、IBRV、BPV 病毒核酸后，將各病毒DNA 和反轉(zhuǎn)錄得到的各病毒cDNA 作為模板，同時以ddH2O 作為陰性對照，利用優(yōu)化好的反應體系和條件進行雙重熒光定量PCR 擴增，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL 的BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品，利用優(yōu)化后的雙重熒光定量PCR 進行擴增，確定其敏感性，同時利用本實驗室建立的常規(guī)PCR 進行檢測，比較兩種方法的敏感性。

1.8 重復性試驗組內(nèi)重復性試驗：將濃度為1.0×106拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL 的BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品作為模板，利用優(yōu)化后的雙重熒光定量PCR方法進行組內(nèi)重復試驗，每個濃度重復3 次；選取3 個不同時間，對上述5 個不同濃度的質(zhì)粒標準品進行組間重復性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果得到的Ct 值來計算組內(nèi)組間變異系數(shù)，評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品的檢測從河北省不同地區(qū)的規(guī)?；鲋胁杉?2 份腹瀉糞便樣品，PBS 稀釋后提取核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后作為模板，利用本實驗建立的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法進行檢測，同時利用本實驗室建立的常規(guī)PCR 對樣品進行檢測，比較二者的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品的鑒定結(jié)果將BRV 和BCV 病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRVR 和BCV-F/BCV-R PCR 擴增后，分別在116 bp 和139 bp 出現(xiàn)和預期相符的目的條帶（圖1）。PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆至pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-BRV和pMD-BCV，測序結(jié)果顯示插入片段與預期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒標準品。經(jīng)計算pMDBRV和pMD-BCV的拷貝數(shù)分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。

圖1 目的基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 雙重熒光定量PCR 反應條件的優(yōu)化結(jié)果及標準曲線的建立通過優(yōu)化后，雙重TaqMan 熒光定量PCR 的最佳反應體系為20 μL：Fast TaqMan Mixture 10 μL；BRV-F/BRV-R（20 μmoL/L）各0.3 μL，BRV 探針（10 μmoL/L）0.2 μL；BCV-F/BCV-R（20 μmoL/L）0.2 μL，BCV 探針（10 μmoL/L）0.2 μL；模板2 μL；ddH2O 補齊至20 μL。反應條件確定為：95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

將BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品10 倍倍比稀釋后作為模板，經(jīng)雙重TaqMan 熒光定量PCR 擴增。結(jié)果顯示，當兩種質(zhì)粒標準品在1.0×107拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL 時與Ct 值呈現(xiàn)良好的線性關系，回歸方程式分別為BRV：y=-3.3064x+38.76 E=107%；BCV：y=-3.1551x+41.81，E=102%，R2均大于99%（圖2）。因此可以根據(jù)檢測樣品的Ct 值，對樣品進行定量分析。

圖2 BRV 和BCV 雙重熒光定量PCR 標準曲線Fig.2 Standard curves of BRV and BCV duplex real-time PCR

2.3 特異性試驗結(jié)果分別以BRV、BCV、BVDV、BEV、IBRV、BPV 的核酸作為模板，同時以ddH2O作為陰性對照，利用優(yōu)化好的反應體系和條件進行雙重TaqMan 熒光定量PCR 擴增。結(jié)果顯示，除BRV 和BCV 的核酸擴增結(jié)果為陽性外，其他均為陰性結(jié)果（圖3），表明該檢測方法具有較強的特異性。

圖3 熒光定量PCR 的特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity test result of the real-time PCR

2.4 敏感性試驗結(jié)果將BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL 后，經(jīng)雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測其敏感性。結(jié)果顯示，BRV 和BCV 的重組質(zhì)粒標準品最低檢測限分別為4.18×101拷貝/μL 和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR 對BRV 重組質(zhì)粒標準品最低檢測限為4.18×104拷貝/μL，對BCV重組質(zhì)粒標準品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。

2.5 重復性試驗結(jié)果采用本研究建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 進行組內(nèi)和組間重復性試驗，結(jié)果顯示組內(nèi)組間的變異系數(shù)均小于2%（表2），表明該方法具有良好的重復性。

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果利用建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 方法對來自河北省的72 份腹瀉樣品進行檢測。結(jié)果顯示， BRV 陽性率為50.0%（36/72），BCV 陽性率為75.0%（54/72），共感染率為33.3%（24/72）；常 規(guī)PCR 檢 測 的BRV 陽 性 率 為47.2%（34/72），BCV 陽性率為70.8%（51/72），共感染率為29.1%（22/72）。二者檢測BRV、BCV 的陽性符合率分別為97.2%，BCV 96.8%（表3）。表明本實驗建立的方法優(yōu)于常規(guī)PCR 檢測方法，可以應用于臨床檢測。

表2 TaqMan 熒光定量PCR 的重復性試驗結(jié)果Table 2 The repeatability test of the TaqMan real-time PCR

表3 臨床樣品的檢測結(jié)果Table 3 Detection of clinical samples with the duplex TaqMan real-time PCR

3 討 論

BRV 和BCV 是犢牛腹瀉的主要病原，嚴重損害世界各國畜牧業(yè)的經(jīng)濟利益。1968 年BRV 首次被Mebus 等分離鑒定，并證明了其對犢牛的致病性[5]；1972 年Mebus 等再次從牛腹瀉糞便樣品中分離出BCV[6]；1980 年和1985 年在我國分別確認了BRV 和BCV 的存在[7-8]。這兩個病毒自報道以來，其引發(fā)的疫病在我國各省市均有發(fā)生和流行。有研究表明，在我國新疆地區(qū)，BRV 陽性率為92.86%～100%，BCV 陽性率為86.67%～100%，混合感染率為86.67%～100%[9-10]。因此，建立兩種病毒的快速、靈敏、特異的檢測方法非常重要。

當前用于BRV 和BCV 的檢測方法主要有PCR、環(huán)介導等溫核酸擴增（LAMP）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、SYBR Green 熒光定量PCR 法等[11-15]，但常規(guī)PCR 耗時長，特異性相對較低；而LAMP 因其對環(huán)境要求嚴格，假陽性率較高；ELISA 相較于Taq?Man 熒光定量PCR 則具有靈敏度較低、耗時長、成本高等缺點；另外，有研究報道，相較于SYBR Green 熒光定量PCR，TaqMan 熒光定量PCR 的檢測結(jié)果更佳[16]。TaqMan 熒光定量PCR 具有耗時短、操作簡易、靈敏性高、特異性強等優(yōu)點，對樣品檢測的同時還可以對其定量分析，因此廣泛應用于國內(nèi)外的臨床檢測。

目前同時檢測BRV 和BCV 方法較少，林初文、沈志強建立了可以同時檢測BRV 和BCV 的多重PCR方法[1]；曹禹建立了檢測BRV 和BCV 的單一SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，但無法同時檢測BRV 和BCV[13]。目前，尚無同時檢測BRV 和BCV 的多重TaqMan 熒光定量PCR 方法，本研究建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 方法較林初文、沈志強建立的多重PCR 相比具有更高的靈敏度和特異性；與曹禹建立的方法相比，該方法更敏感、準確，且可以同時檢測BRV 和BCV。本研究建立的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法對BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標準品的最低檢測限分別為41.8 拷貝/μL 和3.55 拷貝/μL，組內(nèi)組間變異系數(shù)均小于2%，與BVDV、BEV、IBRV、BPV 均無交叉反應，臨床樣品檢測結(jié)果優(yōu)于常規(guī)PCR，表明本實驗建立的方法特異性強，敏感性高，具有較好的重復性和準確性，可以用于BRV 和BCV 的臨床檢測，為犢牛腹瀉病診斷和流行病學調(diào)查提供了有效的檢測方法，對我國犢牛腹瀉病早期診斷和防控具有重要意義。