江錦秀，張靖鵬，林裕勝，毛坤明，游 偉，黃麗麗，胡奇林*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福清市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，福建 福州 350300；3.福建師范大學(xué)，福建 福州 350108）

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retrovirus，ER?Vs）廣泛存在于真核生物中，是在生物進(jìn)化過程中整合到宿主基因組DNA 中的，并在大多數(shù)真核生物種系中以孟德爾遺傳方式垂直遺傳給后代，與致病性外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒具有較高的相似性[1-2]。分子病毒學(xué)研究顯示ERVs 具有限制外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的作用，比如內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒（Endogenous jaagsiekte sheep retrovirus，enJSRV）可以通過受體競爭干擾外源性綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retro?virus，JSRV）的侵入，還可以通過干擾外源性JSRV的復(fù)制來抵御外源性病毒對宿主的侵襲[3-4]。在綿羊、山羊和大多數(shù)野生山羊?qū)倩蚪M中均存在15 拷貝～20 拷貝與外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸序列有很高相似性的ERVs[4]。典型的ERVs 是具有g(shù)ag、pro、pol、env 4 個相互重疊或分離的0RF。ERVs 在母羊生殖道高效表達(dá)，具有局部免疫調(diào)節(jié)和防御外源性病毒感染作用。山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科β 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬B/D 型逆轉(zhuǎn)錄病毒，是引起山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（Enzootic nasal tumor，ENT）的病原[5]。山羊體內(nèi)同樣具有與ENTV-2 型（ENTV-2）對應(yīng)的內(nèi)源性鼻內(nèi)腫瘤病毒[4]（Endogenous enzootic nasal tumor virus，enENTV）。Ortín A 等報道ENTV-2 在患ENT 的山羊體內(nèi)分布廣泛，在病羊的扁桃體、淋巴結(jié)、外周血單核細(xì)胞、脾臟、肺、骨髓中均有分布，但在其腎臟中卻無該病毒[6]，表明從患病山羊腎臟中提取enENTV DNA 可以免受外源ENTV-2 的干擾。本研究從患ENT 山羊腎組織中提取總DNA，經(jīng)PCR 鑒定獲得了一株enENTV，并對其進(jìn)行了全基因組及相關(guān)基因序列克隆、測序及序列分析，為鑒定內(nèi)外源山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒提供序列信息，為研究ENTV-2 的致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑1只患ENT病山羊（根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢病變和RT-PCR 檢測結(jié)果診斷為ENT ?。﹣碜杂诟Ｇ迨?，取其腎臟經(jīng)研磨后提取DNA，經(jīng)RT-PCR[7]檢測ENTV-2 為陰性；GoScript Enzyme Mix、OligodT（Promega）、pMD19-T 載 體、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DL5000 DNA Marker 均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒、IPTG、X-gal購自生工生物工程（上海）股份有限公司；

1.2 enENTV-FJ1 株基因組各片段的PCR 擴(kuò)增和測序參考enENTV-CHN1 株（KU258881.1）基因組序列，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計用于分段PCR 擴(kuò)增病毒全基因組序列的引物，由福州鉑尚生物技術(shù)有限公司合成（表1）。取病羊腎臟研磨后的上清利用Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒提取總DNA，以其為模板，PCR 分段擴(kuò)增enENTV 的4 個基因片段。PCR 體系模板上樣量為4 ng/μL，擴(kuò)增程序：98 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃30 s，共35 循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物回收純化后分別克隆至pMD19-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確后，由福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

表1 enENTV 全基因組擴(kuò)增引物序列Table 1 Whole genome amplification primer sequence of enENTV

1.3 enENTV-FJ1 株全基因組序列同源性及進(jìn)化關(guān)系分析利用DNAStar7.0 軟件中的SeqMan 軟件對分段擴(kuò)增的4 個片段的序列拼接得到全基因組序列，命名為enENTV-FJ1。利用MegAlign 軟件對enENTV-FJ1株、enENTV、ENTV-2、ENTV-1、enJSRV和JSRV等參考株相應(yīng)基因進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建enENTV-FJ1株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析en?ENTV-FJ1株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.4 enENTV-FJ1 株的5'LTR、gag、env 序列同源性及進(jìn)化關(guān)系分析利用MegAlign 軟件對enENTVFJ1株的5'LTR基因、gag和env基因及其編碼的氨基酸序列與enENTV、ENTV-2、ENTV-1、enJSRV和JSRV等相關(guān)病毒參考株的gag基因和env基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建5'LTR、gag 基因、env 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（enENTVCHN1～enENTV-CHN6 6 個參考株的env 基因均無完整的ORF），并分析該株病毒的進(jìn)化關(guān)系。

1.5 enENTV-FJ1 株5'LTR、gag、env 區(qū)酶切位點(diǎn)及gag、env 序列差異性分析利用NEBcutter V2.0對enENTV-FJ1 株、enENTV-CHN1～enENTV-CHN6株及ENTV-2 的5'LTR 區(qū)基因序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析。利用MegAlign 軟件對enENTV-FJ1 株的5'LTR、gag 和env 基因及其編碼的氨基酸序列與enENTV、ENTV-2、ENTV-1、enJSRV 和JSRV 等相關(guān)病毒參考株的相應(yīng)基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 enENTV-FJ1 株基因組各片段的PCR 擴(kuò)增和測序結(jié)果以患ENT病羊的腎臟提取的DNA為模板，采用enENTV 分段擴(kuò)增引物經(jīng)RT-PCR 方法擴(kuò)增病毒全基因組的4 個片段。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的4個片斷目的條帶（圖1）。測序結(jié)果顯示，各目的基因片段分別為2 267 bp、2 137 bp、2 461 bp、1 806 bp。表明，正確擴(kuò)增了enENTV-FJ1株全基因組各基因片段。

圖1 enENTV-FJ1 株全基因組各片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Fragment amplification results of enENTV-FJ1 whole genome by PCR

2.2 enENTV-FJ1 株全基因組序列同源性及進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果enENTV-FJ1 株各片段基因測序結(jié)果利用SeqMan 軟件拼接出全基因組序列。將序列上傳至NCBI，獲得序列登錄號MN564749。enENTV-2FJ1基因組序列長度為7 923 bp，gag 基因位于569 bp～2 428 bp，編碼619 個氨基酸，pro 基因位于2 320 bp～3 189 bp，編碼289 個氨基酸，pol 基因位于3 435 bp～5 780 bp，編碼781 個氨基酸。env 基因位于5 656 bp～7 512 bp，編碼618 個氨基酸。全基因組序列的同源性分析結(jié)果顯示， enENTV- FJ1 株與enENTVCHN1～enENTV-CHN6 6 個參考株的同源性為95.7%～97.3%，親緣關(guān)系最近；與ENTV-2的同源性為87.0%～93.2%；與ENTV-1 的同源性為87.9%～88.0%；與en?JSRV 的同源性為90.5%～90.9%；與JSRV 的同源性為88.2%～88.7%；基于全基因組的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，en?ENTV-FJ1 株 與enENTV-CHN1～enENTV-CHN2、en?ENTV-CHN4～enENTV-CHN6等5株病毒處于同一進(jìn)化分支，與enENTV-CHN3株處于一個小的進(jìn)化分支（圖2）。上述結(jié)果表明，enENTV-FJ1株與enENTV屬于同種病毒。目前，enENTV 全基因組序列只有enENTVCHN1～enENTV-CHN6 等6 條，來 自 于 王 彬 等 從 患ENA 山羊腎臟中測得的enENTV 全基因組序列，該6株病毒的全基因組序列與從山羊分離的ENTV-2 等病毒株的親緣關(guān)系較近，而與來自綿羊的ERVs（enJS?RV）全基因組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與本研究結(jié)果相符[7]。

圖2 基于全基因組序列構(gòu)建的enENTV-FJ1 株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on whole genome sequences of enENTV-FJ1 strain

2.3 enENTV-FJ1 株的5'LTR、gag、env 序列同源性及進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果將enENTV-FJ1株與各參考株的5'LTR、gag 基因、env 基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，enENTV-FJ1的5'LTR基因序列、gag基因及其編碼氨基酸序列與enENTV參考株相應(yīng)序列的同源性比其它參考株高，分別為92.8%～99.1%、92.6%～97.5%、92.2%～97.7%；enENTV-FJ1株env 基因及其編碼氨基酸序列與enJSRV 參考株相應(yīng)序列的同源性比其它參考株高（enENTV 參考株的env 基因無完整的ORF），分別為93.3%～93.8%、94.3%～94.8%。構(gòu)建的5'LTR 進(jìn)化樹結(jié)果顯示，en?ENTV-FJ1 株與enENTV-CHN2 株處于同一進(jìn)化分支（圖3A）；gag 基因的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，enENTV-FJ1株與ENTV-2CHN9 株處于一個小的進(jìn)化分支，與en?ENTV-CHN6 株同處于一個較大的進(jìn)化分支（圖3B）；env基因的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，enENTV-FJ1株與ENTV-2/Spain株處于同一進(jìn)化分支（圖3C）。表明，enENTVFJ1的5'LTR、gag基因、env基因與來自山羊的ENTV-2病毒株親緣關(guān)系更近。

2.4 enENTV-FJ1 株的5'LTR 區(qū)酶切位點(diǎn)及gag、env 序列差異性分析結(jié)果對enENTV-FJ1 株、en?ENTV-CHN1～enENTV-CHN6 株5'LTR 區(qū)以及ENTV-2參考株的5'LTR 區(qū)進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，所有ENTV-2 參考株的5'LTR 區(qū)均有Hpy188Ⅰ、NlaIV、MowⅠ這3 個酶切位點(diǎn)，而7 個enENTV 株的5'LTR 區(qū)均無這3 個酶切位點(diǎn)，這是否為內(nèi)源enENTV 與外源ENTV-2的區(qū)別，需要今后分析更多內(nèi)源enENTV全基因組序列來驗(yàn)證。

圖3 enENTV-FJ1 株5'LTR（A）、gag（B）、env（C）基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 5'LTR(A), gag(B) and env(C) gene sequences of enENTV-FJ1 strain

enENTV 及enJSRV 的gag 基因與外源ENTV-2 以及JSRV 的gag 基因比較最主要的差異位于366 bp～401 bp（有12個核苷酸的插入），與外源ENTV-1的gag基因比較最主要的差異位于366 bp～401 bp（有8個核苷酸的插入）。與enJSRV、外源ENTV-2、ENTV-1 及JSRV 的gag 基因比較，enENTV-FJ1 株的gag 基因在697 bp～705bp 有9 個核苷酸的插入。2019 年測序的ENTV-2CQ 株在gag 基因有2 處多個核苷酸插入，這一序列特征與山羊源ERVs（XM018046415）的gag基因相同而區(qū)別于其它ENTV-2 病毒株，表明ENTV-2CQ 株可能是一株古老病毒，ENTV-2 與ERVs 有著復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系[8]，本研究結(jié)果顯示，enENTV-FJ1株的gag 基因在這兩處也存在多個核苷酸插入。王小玉等研究顯示，與外源性ENTV gag 基因最顯著的區(qū)別在于，內(nèi)源性ERVs gag 基因的783 bp～803 bp，編碼7 個多聚脯氨酸“PPPPPPP”，而在ENTV 的對應(yīng)區(qū)域則發(fā)生了缺失突變和點(diǎn)突變，未編碼連續(xù)的7 個脯氨酸，這可能是影響gag 功能的主要區(qū)域[9]。本研究結(jié)果顯示，enENTV 及enJSRV 等內(nèi)源性病毒株與ENTV-2、ENTV-1、JSRV 等外源性病毒株的gag 基因編碼的氨基酸序列最主要區(qū)別在aa117～aa135（脯氨酸富集區(qū)，有2～4 個不連續(xù)氨基酸插入）和aa174～aa239（存在不連續(xù)的氨基酸位點(diǎn)變異）；與enJSRV、外源JSRV 和ENTV 相比，enENTVFJ1 株的gag 基因編碼的氨基酸序列在aa229～aa232處插入3 個脯氨酸（aa229～aa236 為7 個連續(xù)的脯氨酸），與王小玉等研究結(jié)果相符；這2 個區(qū)間的多肽序列是否可以作為區(qū)別內(nèi)外源性ENTV 和JSRV 的多肽序列從而建立免疫學(xué)檢測方法，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

enENTV及enJSRV的env基因末端與外源ENTV-2以及ENTV-1 的env 基因相比有12 個核苷酸的的缺失，是這些內(nèi)源病毒與外源ENTV 的區(qū)別位點(diǎn)，這為建立ENTV-2特異性檢測方法提供了靶點(diǎn)。

與相應(yīng)病毒參考株的env 基因編碼的氨基酸序列相比，enENTV-FJ1 株和ENTV-2 株的氨基酸序列在aa1～aa7 處插入了7 個氨基酸（MFVFFRR）。與外源性病毒株相比，enENTV-FJ1 株的跨膜蛋白（Transmembrane protein，TM）胞質(zhì)尾區(qū)無YXXM 基序。有報道稱外源JSRV 在env 基因編碼蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)存在YXXM 基序，而內(nèi)源性enJSRV 則無此基序，YXXM 基序是區(qū)別內(nèi)外源病毒的可靠分子標(biāo)記，是外源性JSRV env基因引起成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的因素[10-11]。外源性ENTV-2SC、ENTV-2Shaanxi、ENTV-1NA1、ENTV-1NA3、ENTV-2CQ1 等參考株env 基因編碼蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)均存在YXXM 基序[12-14]，表明YXXM 基序也可能是區(qū)別內(nèi)外源ENTV 的分子標(biāo)記。enENTV 與外源性ENTV 全基因組序列的差別主要在5'LTR區(qū)、gag基因和env基因，enJSRV和JSRV的全基因組序列高變區(qū)也集中在5'LTR 區(qū)、gag 基因和env 基因[15]，本研究結(jié)果與之相似。

enENTV-FJ1 株在aa510～aa515 存在LDLLQL 保守基序，而這在許多反轉(zhuǎn)錄病毒中已經(jīng)證實(shí)與引起宿主的免疫抑制有關(guān)，表明LDLLQL 基序也可能是ENTV-2 引起宿主免疫抑制的原因之一[6,16]。

本研究從1 只患ENT 山羊的腎臟中獲得1 株全長為7 923 bp 的enENTV 全基因組序列，補(bǔ)充了山羊enENTV 全基因組序列資源。但由于RT-PCR 技術(shù)的局限性，所測得的enENTV-FJ1 株的5'LTR 和3'LTR基因序列可能不完整，后續(xù)將利用5'RACE 和3'RACE等技術(shù)對enENTV-FJ1 株基因組末端序列擴(kuò)增并測序，以保證其序列的完整性。本研究為研究ENTV-2的致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。