高力揚(yáng)，張 穎，陳方正，李小杰，馬金成，馬小明，趙琰龍，李 敏*

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起綿羊傳染性胸膜肺炎的主要致病菌，從1963 年首次發(fā)現(xiàn)該病原菌至今[1]，這種支原體在各大洲養(yǎng)殖羊及野生羊中均有檢出[2]，MO 對(duì)全球綿羊養(yǎng)殖業(yè)危害極大。大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示：肺炎支原體能夠引起宿主呼吸道損傷并造成免疫缺陷，但與其他支原體相比，MO 的致病機(jī)理的研究非常有限[3]。有報(bào)道顯示在正常羊呼吸道中也能夠檢測(cè)出MO[4]，提示MO廣泛存在于飼養(yǎng)環(huán)境中。因此，養(yǎng)殖戶(hù)在處理支原體肺炎病羊時(shí)會(huì)直接接觸到MO，雖然目前未見(jiàn)MO 引起人的病例報(bào)道，但MO 對(duì)人體是否存在潛在影響尚不能確定，近年來(lái)關(guān)于致病菌跨種屬感染的病例報(bào)道越來(lái)越多，因此有必要研究MO 對(duì)人體是否存在潛在危害。肺泡上皮細(xì)胞與病原體直接接觸，一旦激活后會(huì)釋放細(xì)胞因子參與肺部炎癥反應(yīng)，而且肺泡上皮細(xì)胞的損傷是肺炎發(fā)展的關(guān)鍵步驟[5]。因此，本研究以MO 感染后的人肺泡II 型上皮細(xì)胞為細(xì)胞模型，為MO 感染對(duì)人呼吸系統(tǒng)可能存在的潛在影響進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及MO株肺泡II型上皮細(xì)胞系HPAEpiC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；MO 標(biāo)準(zhǔn)株Y98 由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑lncRNA RP11-29G8.3-001 過(guò)表達(dá)病毒由漢恒生物合成并構(gòu)建；腺病毒表達(dá)載體pH?BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用引物均由Sangon Biotech 公司合成。胎牛血清和DMEM 均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑和Premix Ex TaqTMII 購(gòu)自Ta?KaRa 公 司；TRIzol 裂 解 液、CellTiter-LumiTM發(fā) 光 法檢測(cè)試劑盒、CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、DIO 細(xì)胞膜綠色熒光染色試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。lncRNA 芯片購(gòu)自博奧晶典生物技術(shù)公司。

1.3 MO Y98 株感染細(xì)胞模型的建立選取MO 標(biāo)準(zhǔn)株Y98，采用改良Hayflick 支原體培養(yǎng)基（20%馬血清）[6]，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基由紅變黃，MO濃度為1×106ccu/mL。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肺泡II型上皮細(xì)胞HPAEpiC以1×105個(gè)/mL接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞融合度達(dá)75%左右時(shí)，利用MO Y98 株感染細(xì)胞24 h，感染復(fù)數(shù)（MOI）為10。利用DIO 對(duì)MO 細(xì)胞膜進(jìn)行熒光染色，然后利用免疫熒光技術(shù)鑒定人肺泡II 型上皮細(xì)胞的感染狀況。

1.4 細(xì)胞增殖及活力影響的檢測(cè)將人肺泡II型上皮細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)加入MO Y98 株感染24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h 后，測(cè)定其OD450nm值，確定MO Y98 感染對(duì)細(xì)胞增殖的影響；取出細(xì)胞培養(yǎng)板室溫平衡10 min，每孔加入100 μL Cell Titer-LumiTM發(fā)光法檢測(cè)試劑，室溫下振蕩2 min 后室溫孵育10 min，利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，確定MO Y98 感染對(duì)HPAEpiC 細(xì)胞ATP 生成量的影響。

1.5 細(xì)胞形態(tài)變化檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)采取掃描電鏡檢測(cè)感染MO 后的人肺泡II 型上皮細(xì)胞形態(tài)變化。具體操作步驟為：檢測(cè)前按1.3 中的方法制作被MO 感染的細(xì)胞爬片，采用預(yù)冷的2.5%戊二醛/PBS 溶液過(guò)夜固定，利用50%、70%、85%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水，然后用叔丁醇置換3次，每次10 min，最后冷凍干燥后經(jīng)掃描電鏡觀察感染后人肺泡II 型上皮細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.6 MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞后相關(guān)基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)利用TRIzol 裂解后提取無(wú)感染組及MO 感染組細(xì)胞總RNA，委托博奧晶典生物技術(shù)公司利用lncRNA 芯片對(duì)細(xì)胞mRNA 長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行篩查檢測(cè)。利用RT-qPCR 方法對(duì)芯片篩選到的基因進(jìn)行初步驗(yàn)證，篩選出表達(dá)顯著上調(diào)的基因。并利用qPCR 對(duì)炎癥因子相關(guān)基因IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7 的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)（引物序列見(jiàn)表1）。

1.7 lncRNA RP11-29G8.3-001 過(guò)表達(dá)對(duì)MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞的影響分析進(jìn)一步選擇與MO感染相關(guān)且表達(dá)上調(diào)的基因lncRNA RP11-29G8.3-001開(kāi)展基因過(guò)表達(dá)及免疫相關(guān)基因的檢測(cè)。具體方法為：合成lncRNA RP11-29G8.3-001 的cDNA 序列（En?sembl GRCh37.p13 獲得），插入腺病毒表達(dá)載體pH?BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 中，重組病毒的構(gòu)建及純化由漢恒生物科技（上海）有限公司完成；將含有l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)質(zhì)粒的腺病毒加入細(xì)胞融合度達(dá)到70%的人肺泡II 型上皮細(xì)胞，病毒最佳MOI 為100。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h～8 h 后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中GFP 的表達(dá)情況，然后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至90%以上融合后，收集細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。qPCR 檢測(cè)lncRNA RP11-29G8.3-001的轉(zhuǎn)錄水平，及l(fā)ncRNA RP11-29G8.3-001過(guò)表達(dá)后細(xì)胞中免疫相關(guān)基因HLA-B、HLA-F、HLA-C、IF16、IF127、IF135、IFITM1、IFITM3、OAS1、OAS3的轉(zhuǎn)錄水平（表1）。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR

1.8 生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7 軟件進(jìn)行分析，采用T 檢驗(yàn)，p<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞模型的建立為了證實(shí)MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞模型的建立，本研究采用熒光法檢驗(yàn)MO 在細(xì)胞中的分布情況。激光共聚焦顯示，DIO 熒光染色的MO 在感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞12 h 內(nèi)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，并圍繞細(xì)胞核分布（圖1）。這一現(xiàn)象表明建立的MO 感染模型可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 MO 對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖及活力的影響為了研究MO 在體外對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力的影響，本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8 及CellTiter-LumiTM發(fā)光法對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示MO 感染的細(xì)胞與對(duì)照兩種細(xì)胞的數(shù)量及ATP 產(chǎn)生量無(wú)顯著影響（圖2），結(jié)果提示MO感染對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性，且不會(huì)降低該細(xì)胞的活性。

圖2 MO 對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞增殖及活性的影響Fig.2 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on cellproliferation activity of human alveolar type II epithelial cells

2.3 MO對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響為了觀察MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞后的形態(tài)變化，本實(shí)驗(yàn)采用掃描電鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示：人肺泡II 型上皮細(xì)胞在感染MO 后會(huì)伸出很多偽足（圖3），推測(cè)MO 刺激細(xì)胞后伸出的偽足可能是MO 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的原因。

圖3 MO 對(duì)肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 The morphology of infected human alveolar epithelial cells

2.4 MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)為了進(jìn)一步檢測(cè)MO 感染后的細(xì)胞基因表達(dá)的變化，利用基因芯片對(duì)細(xì)胞中mRNA 及l(fā)ncRNA 進(jìn)行篩查，并采用熒光定量PCR 進(jìn)行驗(yàn)證。 RT-qPCR 結(jié)果顯示MO 感染會(huì)引起人肺泡II 型上皮細(xì)胞中SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及l(fā)n?cRNA RP11-29G8.3-001 轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)（p<0.05，圖4A），但是MO 感染不會(huì)上調(diào)人肺泡II 型上皮細(xì)胞中炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，如IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7（圖4C）。結(jié)果表明MO 感染雖然會(huì)上調(diào)人肺泡II 型上皮細(xì)胞內(nèi)極少數(shù)蛋白編碼基因的表達(dá)（SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1），但這些基因均與細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)；且MO 感染不會(huì)直接誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

2.5 lncRNA RP11-29G8.3-001 過(guò)表達(dá)對(duì)MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞的影響分析MO 感染會(huì)引起lncRNA RP11-29G8.3-001 轉(zhuǎn)錄水平升高（p<0.05，圖4B），但lncRNA RP11-29G8.3-001 的作用目前未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步探索lncRNA RP11-29G8.3-001在人肺泡II 型上皮細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用攜帶lncRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)質(zhì)粒的腺病毒感染HPAEpic 細(xì)胞。qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示lncRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)上調(diào)超過(guò)6 倍以上（圖5），本研究將肺泡II 型上皮細(xì)胞分為兩組，lncRNA RP11-29G8.3-001 基因過(guò)表達(dá)和MO 感染組。人RP11-29G8.3-001過(guò)表達(dá)會(huì)引起HLA-B、HLA-F、HLA-C 的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（圖6Ai），且抗感染相關(guān)基因IFITM1、IF?ITM3、OAS1、OAS3 等轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低（圖6Aii）。然而體外MO 感染（MOI 10）感染僅能上調(diào)ln?cRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)1.5 倍，不足以引起上述免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化（圖6B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然lncRNA RP11-29G8.3-001 過(guò)表達(dá)可引起人肺泡II 型上皮細(xì)胞的免疫抑制，但本實(shí)驗(yàn)中MO 感染（MOI 10）引起的少量lncRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)并沒(méi)有造成免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，推測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平可能與lncRNA RP11-29G8.3-001 的表達(dá)水平有關(guān)。

3 討 論

以往研究顯示，肺炎支原體可以通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、膜融合、營(yíng)養(yǎng)剝奪、侵入、毒力因子等作用直接損傷宿主細(xì)胞[7]。但本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8 及細(xì)胞ATP 水平檢測(cè)等手段，發(fā)現(xiàn)MO 感染人肺泡II型上皮細(xì)胞48 h 后，感染組及對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活性并無(wú)明顯改變，推測(cè)MO 感染可能不會(huì)引起人肺泡II 型上皮細(xì)胞增殖能力降低甚至死亡。利用DIO 熒光染色的MO 感染人肺泡II 型上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MO 可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，而且掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)MO 感染會(huì)促進(jìn)人肺泡II 型上皮細(xì)胞伸出偽足，推測(cè)MO 可能利用胞飲進(jìn)入細(xì)胞。而支原體和細(xì)胞膜成分相似，這可能也是MO 進(jìn)入細(xì)胞的一個(gè)途徑。

圖4 MO 感染對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞中基因表達(dá)的影響Fig.4 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on gene expression of human alveolar type IIepithelial cells

圖5 lncRNA RP11-29G8.3-001 在人肺泡II 型上皮細(xì)胞中的表達(dá)量變化Fig.5 Expression of lncRNA RP11-29G8.3-001 in human alveolar type II epithelial cells

有研究顯示雞毒支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白會(huì)上調(diào)雞氣管上皮細(xì)胞中IL-1β 的表達(dá)，而肺炎支原體感染可上調(diào)人肺泡II 型上皮細(xì)胞中IL-1、TNF 的表達(dá)[8]，并且ROS 可通過(guò)上調(diào)TNF-α 增加對(duì)腸上皮細(xì)胞的損傷[9]。有研究發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白1、2 可以誘導(dǎo)小鼠氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，提示IFN-γ 與氣管上皮細(xì)胞免疫有關(guān)[10]。而IRF7 則參與支氣管上皮細(xì)胞抗病毒免疫、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[11]。上述病原體感染均可引起炎癥因子上調(diào)。上述炎癥因子均與上皮細(xì)胞免疫有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MO 可以進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞中IL-1β，TNF-α，IFN，IRF7 等炎癥因子的表達(dá)并無(wú)明顯變化，MO 感染不會(huì)引起人肺泡II型上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)變化。

為了進(jìn)一步研究MO 對(duì)人肺泡II 型上皮細(xì)胞的潛在影響，本研究采用基因芯片進(jìn)行差異基因篩選，共檢出3 個(gè)mRNA 及5 個(gè)lncRNA 在MO 感染的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，qPCR 驗(yàn)證后證實(shí)SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及l(fā)ncRNA RP11-29G8.3-001 表達(dá)顯著上升。但利用OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，除上皮鈉通道γ 亞基外（由SCNN1G 基因編碼），LOX 和ST6GALNAC1 均與呼吸系統(tǒng)疾病無(wú)相關(guān)性。而上皮鈉通道γ 亞基表達(dá)升高對(duì)肺水轉(zhuǎn)運(yùn)有促進(jìn)作用，可以減少肺水腫的發(fā)生[12]。

反義lncRNA RP11-29G8.3 基因存在于第13 號(hào)染色體上（Ensembl GRCh37.p13 版本），目前功能尚不清楚。人肺泡II 型上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 在MO 感染后表達(dá)顯著升高，提示其在感染中可能存在一定作用，因此本實(shí)驗(yàn)采用基因過(guò)表達(dá)的方法驗(yàn)證其功能。結(jié)果顯示lncRNA RP11-29G8.3-001 可以顯著下調(diào)HLA-B、HLA-F、HLA-C等基因的表達(dá)，并且顯著抑制抗感染因子OAS1、OAS3 等基因表達(dá)。人HLA-B、HLA-C 基因編碼主要組織相容性復(fù)合物I 類(lèi)（MHC-I），HIV 可以通過(guò)抑制MHC-I 的表達(dá)而逃避免疫清除。而IFI6 可以通過(guò)線粒體依賴(lài)途徑抑制登革2 型病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13]，提示IFI6 在抗病毒、抗凋亡中發(fā)揮作用。IFITM1、IFITM3 可以通過(guò)抑制病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而抑制丙型肝炎病毒進(jìn)入細(xì)胞[14]。OAS1 和OAS3 作為人類(lèi)巨噬細(xì)胞中趨化因子和干擾素應(yīng)答基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，是抗病毒反應(yīng)系統(tǒng)的介質(zhì)[15]。這些抗感染相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)與ln?cRNA RP11-29G8.3-001 負(fù)相關(guān)，提示lncRNA RP11-29G8.3-001 可能參與細(xì)胞免疫抑制。然而與基因過(guò)表達(dá)相比，體外大劑量MO 感染（MOI 10）并不能大幅上調(diào)人肺泡II 型上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 的表達(dá)量，而低水平的lncRNA RP11-29G8.3-001不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的免疫抑制作用，因此MO 通過(guò)大幅上調(diào)lncRNA RP11-29G8.3-001 造成人肺泡II型上皮細(xì)胞免疫抑制的可能性極小。

圖6 人肺泡II 型上皮細(xì)胞中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)Fig.6 Expression of immune-related genes inhuman alveolar type II epithelial cells

綜上所述，MO 是造成綿羊傳染性胸膜肺炎的主要病原菌，可以通過(guò)飛沫等途徑傳染，對(duì)綿羊養(yǎng)殖業(yè)危害極大，但這種支原體是否會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在影響，尚無(wú)理論依據(jù)。本研究通過(guò)建立MO 感染肺泡上皮細(xì)胞模型，從細(xì)胞活性及基因表達(dá)等方面評(píng)估了MO 對(duì)人體的潛在危險(xiǎn)，研究發(fā)現(xiàn)MO 對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞的影響有限，造成損害的可能性較小。