聶向榮，武劍磊，武永慶

1邯鄲市中心醫(yī)院,河北邯鄲056001;2武安市第一人民醫(yī)院

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率、病死率隨人口老齡化及飲食習(xí)慣改變呈上升趨勢(shì)[1]。結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者生存率降低的重要原因，尋找結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶分子是目前研究重點(diǎn)。鈣黏蛋白是定位于細(xì)胞膜上的鈣依賴性跨膜蛋白，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲有關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)下降，神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)表達(dá)增加，使上皮細(xì)胞極性消失，轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，從上皮組織分離或脫落至其他部位，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。多配體蛋白聚糖1(SDC1)又名CD138，是進(jìn)化保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)家族的重要成員之一，主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、黏附等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[3]。SDC1蛋白定位于細(xì)胞表面，其異常表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤[4]、乳腺癌[5]的發(fā)生、不良預(yù)后關(guān)系密切。2012年1月—2014年8月，我們采用免疫組化法檢測(cè)了結(jié)腸癌患者癌組織及癌旁正常組織中SDC1蛋白表達(dá)，探究其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年1月—2014年8月入住我院并行手術(shù)切除的130例結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤組織>5 cm)的石蠟樣本，患者男66例、女64例，年齡(45.79±6.27)歲，其中<60歲者71例，≥60歲者59例。腫瘤直徑<5 cm者76例，≥5 cm者54例；組織分化程度：中高分化95例，低分化35例；腫瘤浸潤(rùn)深度T1+T243例，T3+T487例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移42例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期79例，Ⅲ期+Ⅳ期51例。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：患者或其家屬簽署知情同意書；有完整的病歷資料和隨訪資料；術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌(腺癌)；術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；肝、膽、腎等重要器官功能不全；患有家族性腺瘤性息肉病。以患者出院為隨訪起點(diǎn)，采用電子通信或門診復(fù)診的方式，對(duì)患者進(jìn)行為期1～60個(gè)月的隨訪，直至隨訪時(shí)間結(jié)束或患者死亡，隨訪截止日期為2019年10月。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 SDC1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取組織石蠟標(biāo)本，常規(guī)脫蠟至水(3次二甲苯，3次乙醇)。采用通用型SP檢測(cè)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)：滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH 6.0)，加熱至100 ℃，持續(xù)10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加封閉液(正常山羊血清)，37 ℃封閉10 min，棄血清；分別滴加SDC1(sc-12765，美國(guó)Santa Cruz公司)、E-cadherin(sc-21791，美國(guó)Santa Cruz公司)、N-cadherin(sc-59987，美國(guó)Santa Cruz公司)一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌3次；滴加新鮮配制的DAB溶液，進(jìn)行顯色反應(yīng)，蒸餾水清洗；蘇木素溶液復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。

結(jié)果判定[6]：SDC1蛋白、E-cadherin蛋白及N-cadherin蛋白均主要定位于細(xì)胞膜。光學(xué)顯微鏡下(CX31，日本Olympus公司)，隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<5%為0分，5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分；著色強(qiáng)度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分的乘積進(jìn)行結(jié)果判定，二者乘積5～12為陽(yáng)性表達(dá)，0～4為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，兩樣本間陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析兩等級(jí)指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系，Kaplan-Meier生存模型、Log-rank檢驗(yàn)分析SDC1蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中SDC1蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為22.31%(29/130)，癌旁正常組織中SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為91.54%(119/130)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中，SDC1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P均<0.05)，見表1。

2.3 結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響SDC1蛋白陰性表達(dá)101例(SDC1蛋白陰性表達(dá)組)，SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)29例(SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組)。SDC1蛋白陰性表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為51.49%(52/101)，SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為79.31%(23/29)，Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組預(yù)后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.494，P=0.019)。

2.4 結(jié)腸癌組織SDC1蛋白表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為26.15%(34/130)，N-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為70.77%(92/130)。SDC1蛋白陰性表達(dá)者E-cadherin陰性表達(dá)72例，陽(yáng)性表達(dá)29例；SDC1蛋白陰性表達(dá)者N-cadherin陰性表達(dá)15例，陽(yáng)性表達(dá)86例。SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者E-cadherin陰性表達(dá)24例，陽(yáng)性表達(dá)5例；SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者N-cadherin陰性表達(dá)23例，陽(yáng)性表達(dá)6例。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.753，P=0.016)，SDC1蛋白表達(dá)與N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.682，P=0.028)。

3 討論

結(jié)腸癌患者早期癥狀不明顯，但隨病情進(jìn)展、腫瘤體積增加，患者表現(xiàn)為便秘、腹瀉、便血、局部腹痛，后期則出現(xiàn)腰部疼痛、腸梗阻癥狀，嚴(yán)重影響患者日常生活、威脅患者生命安全[7]。近年來(lái)，隨著靶向化療藥物的臨床應(yīng)用，患者臨床癥狀得到顯著緩解[8]，但因結(jié)腸癌具有易侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。

腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移是多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。SDC1蛋白屬于黏附分子，可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用，SDC1蛋白表達(dá)減少或缺失可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，如轉(zhuǎn)錄因子E盒鋅指蛋白1(ZEB1)抑制SDC1基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌侵襲[10]，Schneider等[11]證實(shí)，miR-10b靶向SDC1基因表達(dá)，降低SDC1蛋白表達(dá)，促進(jìn)IL-6分泌、增加基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、新生血管生成。Ibrahim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SDC1可作為三陰性乳腺癌分子標(biāo)志物，且可作為患者的治療靶標(biāo)。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，SDC1蛋白主要定位于細(xì)胞膜，且結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁正常組織，此外，癌組織中SDC1蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上結(jié)果初步表明SDC1蛋白具有腫瘤抑制功能，SDC1蛋白低表達(dá)能誘發(fā)結(jié)腸癌形成，且可能通過(guò)減弱結(jié)腸癌細(xì)胞間黏附進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)周圍組織浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。新生血管形成是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，SDC1蛋白可能參與調(diào)控血管生成擬態(tài)。Andersen等[13]證實(shí),多發(fā)性骨髓瘤中SDC1高表達(dá)與腫瘤血管生成相關(guān)。

研究證實(shí)，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵，其特征性改變?yōu)榫o密連接蛋白E-cadherin表達(dá)缺失，間質(zhì)相關(guān)蛋白N-cadherin表達(dá)增加[14,15]。本研究Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，而與N-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中，SDC1蛋白與E-cadherin蛋白發(fā)揮協(xié)同作用，但SDC1蛋白拮抗N-cadherin蛋白作用，初步證實(shí)SDC1蛋白低表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，且可能參與E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)調(diào)控。此外，已有研究證實(shí)SDC1是基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)的底物之一，在維持黏膜屏障功能等方面發(fā)揮重要作用[16]，這可能是SDC1蛋白參與腫瘤細(xì)胞侵襲的調(diào)控機(jī)制之一。筆者推測(cè)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)除可降解ECM外，還可作用于SDC1蛋白，降低SDC1蛋白表達(dá)，而細(xì)胞膜蛋白間相互作用，導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)降低，而N-cadherin蛋白表達(dá)增加，以上機(jī)制共同發(fā)揮作用，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲。后續(xù)將在細(xì)胞水平證實(shí)以上科學(xué)假設(shè)，探究SDC1蛋白分子的調(diào)控機(jī)制。

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，SDC1蛋白陰性表達(dá)組術(shù)后5年總生存率低于SDC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組，且SDC1蛋白低表達(dá)與TNM高分期相關(guān)，提示SDC1蛋白低表達(dá)與結(jié)腸癌患者低生存率有關(guān)。Binder等[17]在結(jié)腸癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，SDC1蛋白表達(dá)缺失可預(yù)示結(jié)腸癌惡性進(jìn)展。以上研究表明SDC1蛋白低表達(dá)具有預(yù)測(cè)患者病情惡化、不良預(yù)后的潛能。然而，本研究樣本量有限，有待大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中SDC1蛋白呈低表達(dá)，且與患者病情惡性進(jìn)展、預(yù)后不良有關(guān)；SDC1蛋白表達(dá)下降可降低E-cadherin蛋白表達(dá)、增加N-cadherin蛋白表達(dá)，誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移。