陳錫龍，周澤曉，王慶紅，謝麗麗，郭 萍，古 海，焦仁剛，羅 楊

(貴州省獸藥飼料檢測所,貴陽 550003)

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備 Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(配DAD檢測器)；色譜柱為Hypersil GOLD C18，(5 μm, 4.6 × 250 mm)色譜柱。Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE,昆山市超聲儀器廠)。

1.2 對照品 磺胺間甲氧嘧啶對照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：C0031610，含量99.5%。甲氧芐啶對照品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：H0161210，含量100.0%。

1.3 原料藥 磺胺間甲氧嘧啶：吳江博霖實驗有限公司提供，含量：97.38%；甲氧芐啶：壽康富康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37020335，批號：A-10111710094，生產(chǎn)日期：20171031，含量：99.3%。

1.4 試驗樣品 共收集了5批2個不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑樣品，樣品信息見表1。

表1 試驗樣品信息Tab 1 Relative information of five Compound SMM Premix samples

1.5 試劑 甲醇、乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.6 方法

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm 4.6×250 mm)；柱溫為40 ℃；流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈(86 ∶14)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為240 nm[5]；進樣體積為20 μL。

1.6.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取磺胺間甲氧嘧啶對照品50.43 mg，甲氧芐啶10.14 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10～20 min，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，混勻，即得磺胺間甲氧嘧啶濃度為1.0036 mg/mL和甲氧芐啶濃度為202.8 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得磺胺間甲氧嘧啶濃度為100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的混合對照品溶液。

1.6.3 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10～20 min，取出，放冷，再加甲醇稀釋至刻度。另取上述稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

產(chǎn)業(yè)演變過程不僅通過產(chǎn)業(yè)集聚的組織形式對區(qū)域產(chǎn)生環(huán)境效應(yīng)，也通過產(chǎn)業(yè)網(wǎng)絡(luò)、產(chǎn)業(yè)共生等組織形式對區(qū)域生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響，相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者已開展了卓有成效的研究（王鋒等，2018）?；?55篇文獻計量分析和70篇代表性文獻分析，展望地理學(xué)、經(jīng)濟學(xué)、規(guī)劃學(xué)、環(huán)境學(xué)、社會學(xué)等學(xué)科對產(chǎn)業(yè)集聚環(huán)境效應(yīng)研究的拓展領(lǐng)域和方向。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取上述磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品貯備液各0.5、1、2、5、10 mL，分別置于5個100 mL容量瓶中，補足甲醇量為10 mL，再加水稀釋至刻度，得含磺胺間甲氧嘧啶濃度分別為5.02、10.04、20.07、50.18、100.36 μg/mL 和甲氧芐啶濃度為1.01、2.03、4.06、10.14、20.28 μg/mL系列混合對照品溶液。精密吸取各系列混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶色譜峰面積(Area)為縱坐標(biāo), 其相應(yīng)質(zhì)量濃度(Amt, μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各自回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.6.5 含量測定 精密吸取上述1.6.2項中的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品溶液及1.6.3項中的供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法定量計算供試品的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 分別精密吸取磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品溶液及供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明：供試品溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰。

圖1 磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品及預(yù)混劑供試品溶液高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of reference substances or Compound SMM Premix sample

2.2 線性范圍 分別精密吸取上述1.6.4項中各系列梯度的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)(Amt)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Area)，進行線性回歸，得到磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的回歸方程。結(jié)果表明：磺胺間甲氧嘧啶在5.02～100.36 μg/mL和甲氧芐啶在1.01～20.28 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear equation and related coefficient

2.3 重復(fù)性 精密量取含磺胺間甲氧嘧啶濃度為100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶混合對照品溶液及含量測定項下編號為SHGY1的供試品溶液各20 μL分別連續(xù)進樣6次，以測定結(jié)果峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗的重復(fù)性，磺胺間甲氧嘧啶色譜峰面積的RSD分別為0.03%和0.13%，甲氧芐啶色譜峰面積的RSD分別為0.10%、0.20%，表明方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)Tab 3 Test data of repeatability

2.4 準(zhǔn)確度 以所建立方法的測定結(jié)果同原永停滴定法測量結(jié)果進行比較，計算5批樣品磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶兩種方法測量結(jié)果平均值的相對偏差，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，兩種方法測量結(jié)果的相對偏差均不大于2.42%，方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表4 準(zhǔn)確度測量結(jié)果(n=5)Tab 4 Accuracy results(n=5)

表5 耐用性試驗結(jié)果(n=3)Tab 5 Durability test results(n=3)

2.6 專屬性 在對照品及樣品測試色譜圖中，甲氧芐啶及磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)出峰時間附近未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，甲氧芐啶與其前面雜質(zhì)峰的分離度為4.3，與磺胺間甲氧嘧啶峰的分離度為15.0；同時，經(jīng)DAD檢測器對兩個色譜主峰進行識別和定位，均表明方法的專屬性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗 精密量取含磺胺間甲氧嘧啶濃度100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液20 μL，分別約于0、24、48 h上機測定，每次進樣兩針，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶三次測量的色譜峰面積平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%和1.45%，結(jié)果見表6，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性測量結(jié)果Tab 6 Stability results

2.8 添加回收試驗 以編號為SHGY1的樣品作為本底樣品，稱取約500 mg，精密稱定，精密添加磺胺間甲氧嘧啶原料藥(含量為97.38%)約50 mg和甲氧芐啶10 mg(含量為99.3%)，使兩者的添加量均達(dá)到原本底含量的約100%，按照供試品溶液的配制方法制成供試品溶液進行含量測定，共做8個平行。按(實測含量-本底含量)/實際添加量×100%計算添加回收率，測得磺胺間甲氧嘧啶的回收率為98.83%～101.95%，平均回收率為100.53%，RSD為0.91%；甲氧芐啶的回收率為99.02%～103.09%，平均回收率為101.53%，RSD為1.23%，結(jié)果見表7。

表7 磺胺間甲氧嘧啶、甲氧芐啶回收率測量結(jié)果(n=8)Tab 7 Recovery rates of SMM and TMP(n=8)

2.9 樣品檢測 取5批試驗樣品，按供試品溶液的制備方法分別制成供試品溶液后進行含量測定，每批樣品作三個平行，結(jié)果見表8。結(jié)果表明，各批次磺胺間甲氧嘧啶的RSD均小于2.0%；甲氧芐啶的RSD相差較大，可能是其含量較低且有部分樣品沒有混勻的緣故。

表8 5批樣品中磺胺間甲氧嘧啶及甲氧芐啶含量測量結(jié)果(n=3)Tab 8 Content determination results of SMM and TMP in 5 samples(n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件及檢測波長的選擇 當(dāng)前文獻報道測量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18,V/V)[6]、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)[7]、0.017 mol/L磷酸-乙腈(80+20)[8]、磷酸鹽溶液-甲醇(65+35)[9]、甲醇-水-三乙胺(200∶799∶1,V/V)(用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.9)[10-11]等，柱溫主要有30、40 ℃，檢測波長多為270、240、230 nm。在200～400 nm波長范圍內(nèi)對磺胺間甲氧嘧啶對照品溶液進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)磺胺間甲氧嘧啶最大吸收峰為295、250、230 nm，在285、270、215 nm處均有較強吸收峰。陳錫龍[12]采用流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)檢測磺胺間甲氧嘧啶(鈉)的含量，認(rèn)為磺胺間甲氧嘧啶(鈉)的出峰時間適當(dāng)，峰形良好，且0.1%的磷酸溶液也容易配制。由于增加了對甲氧芐啶的檢測，流動相的比例也應(yīng)作出適當(dāng)調(diào)整。檢測中發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶色譜峰的保留時間受流動相比例變化的影響較大，即有機相增加，出峰時間提前，且峰形尖銳；有機相減少，出峰延遲，峰形變鈍。研究發(fā)現(xiàn)，同時檢測磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶時，采用流動相0.1%磷酸溶液-乙腈(86∶14)效果最佳。但有專家認(rèn)為該流動相酸性較強，有可能會損傷色譜柱。實驗表明，該流動相的pH值略大于2.0，約為2.05左右，滿足一般色譜柱對pH值的要求范圍，且自從2013年開始使用0.1%磷酸溶液-乙腈流動相系統(tǒng)研究檢測磺胺類藥物以來，未曾發(fā)生一例色譜柱受到損壞的情況。為使該0.1%磷酸溶液-乙腈流動相系統(tǒng)(以下簡稱磷酸-乙腈系統(tǒng))能被更加廣泛地應(yīng)用于檢測多種磺胺類藥物，研究還考察了其與甲醇-水-三乙胺(200∶799∶1,V/V)(用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.9)流動相系統(tǒng)(以下簡稱甲醇-三乙胺系統(tǒng))檢測不同磺胺藥物含量的比較情況，發(fā)現(xiàn)后者同樣能夠?qū)Χ喾N磺胺有良好的分離，但缺點是洗脫能力差，容易污染色譜柱，從而導(dǎo)致色譜柱柱效快速下降，使用壽命大大縮短?？紤]到為保持將來磺胺類藥物檢測方法的一致性，同時也能夠獲得較好的分離效果，故選擇240 nm作為檢測波長，40 ℃作為色譜柱柱溫，0.1%磷酸溶液-乙腈(86∶14,V/V)作為流動相。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化 對于樣品的提取方法，陳錫龍[13]采用加入1 mL的鹽酸溶解處理樣品后再加水定容的方法。但鹽酸的破壞力極強，可能會對樣品造成不可預(yù)知的破壞，也存在一定的安全隱患，同時，該方法處理樣品后需要迅速進行稀釋，否則，磺胺間甲氧嘧啶特別是甲氧芐啶容易析出結(jié)晶，導(dǎo)致測量結(jié)果出現(xiàn)偏差。用甲醇提取樣品或溶解對照品時可獲得滿意的檢測效果，但要注意上機溶液中有機溶劑的比例不宜超過20%，否則，易產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，使甲氧芐啶的峰形變差，甚至出現(xiàn)分叉等，從而影響檢測結(jié)果。

3.3 高效液相色譜法測量結(jié)果比永停滴定法略低的原因分析 使用高效液相色譜法測量磺胺間甲氧嘧啶時，其結(jié)果往往要略低于傳統(tǒng)的永停滴定法測量的結(jié)果。分析認(rèn)為是磺胺間甲氧嘧啶在貯存過程中會產(chǎn)生一定程度的降解，且其降解產(chǎn)物也屬于磺胺類物質(zhì)，使用永停法進行測量時，儀器無法識別出該產(chǎn)物；而使用高效液相色譜儀進行測量時，該降解產(chǎn)物則能夠被很好地識別出來，即在前文圖1中磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對照品及預(yù)混劑供試品溶液色譜圖中保留時間約為6.7 min(磺胺間甲氧嘧啶相對保留時間約0.48處)的較小的色譜峰，所以，高效液相色譜法測量結(jié)果比永停滴定法略低也就不難理解了。該降解產(chǎn)物經(jīng)二極管陣列檢測器檢測，在238.8、265.0、288.6 nm波長處有最大吸收。其相對峰面積甚至可能高達(dá)10%以上。但是，關(guān)于該降解產(chǎn)物的性質(zhì)及其對藥品質(zhì)量會產(chǎn)生什么樣的影響尚不清楚。

本研究建立的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑含量的高效液相色譜測定法是可行的，該方法簡單，準(zhǔn)確，精密度好，回收率高，可以作為復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中同時測定磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶含量方法的補充。