劉雪松，朱慶賀，楊旭東，張 艷，陳 曦，王 爽，王觀悅，穆永才，羅天瑤，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，屬于腸桿菌科、埃希氏菌屬，一種兼性厭氧、兩端鈍圓、革蘭氏陰性短桿菌，幾乎是所有動(dòng)物腸道內(nèi)的常在菌。但隨著研究的不斷加深，發(fā)現(xiàn)了一些大腸桿菌是有致病性的[1]，可引起多種動(dòng)物疾病。致病性大腸桿菌可以引起犢牛腹瀉，這種病發(fā)病急且具有傳染性，2～3日齡犢牛最易感染。本病又被稱為牛白痢，一般在氣溫多變的冬末春初發(fā)病率較高[2]。致病性大腸桿菌攜帶的毒力因子種類較多，其致病性也來(lái)源于多種毒力因子的相互作用。目前確定致病性大腸桿菌毒力因子主要有黏菌素菌毛、腸毒素、LEE毒力島、志賀毒素以及溶血素等。不同種致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因是不同的，因此可以通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)致病性大腸桿菌進(jìn)行分類。根據(jù)相關(guān)研究表明，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)目前是導(dǎo)致?tīng)倥８篂a最常見(jiàn)的致病性大腸桿菌。目前牛源性致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因包括K88、K99、F17以及F41等[3-4]。

2018年11月黑龍江省哈爾濱市某牛場(chǎng)犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀。患病犢牛出現(xiàn)暴發(fā)性腹瀉，已導(dǎo)致3頭犢牛死亡。本試驗(yàn)從該牛場(chǎng)送檢病死犢牛器官中分離細(xì)菌，并通過(guò)生化試驗(yàn)、16S rRNA基因序列測(cè)定、毒力基因測(cè)定等方法對(duì)該株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出這株細(xì)菌的敏感藥物，旨在為幫助該牛場(chǎng)治療犢牛腹瀉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無(wú)菌采集來(lái)自哈爾濱周邊地區(qū)某牛場(chǎng)中死亡犢牛的病料，包括小腸、大腸、瘤胃、肝臟以及脾臟等。

1.1.2 試劑與儀器 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。MH培養(yǎng)基，廣州鴻泉生物科技有限公司生產(chǎn)。50×TAE，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。革蘭氏染色液，鄭州理利生物工程有限公司生產(chǎn)。藥敏紙片、生化試驗(yàn)管，杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。Taq Master Mix、DNA Marker，大連Takara公司生產(chǎn)。DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。Bio-Rad梯度PCR儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。凝膠圖像處理系統(tǒng)，青島科易偉業(yè)生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明雌鼠10只，40日齡，體重大致在22～25 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 分別無(wú)菌取病死犢牛的小腸、大腸、瘤胃、肝臟以及脾臟接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，再挑取菌落形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代后挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 生化試驗(yàn)鑒定 對(duì)分離出來(lái)的菌株進(jìn)行相關(guān)生化試驗(yàn)，包括麥芽糖、甘露糖、VP、吲哚、尿素酶、乳糖、L鼠李糖、間肌醇以及葡萄糖。

1.2.3 分離菌株的PCR擴(kuò)增和測(cè)序 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]，合成大腸桿菌16S rRNA的通用引物。菌液為模板提取DNA，用細(xì)菌16S rRNA的通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如表1所示。

表1 16S rRNA通用引物序列Tab 1 16S rRNA universal primer sequence

1.2.4 毒力基因的測(cè)定 根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)中的引物序列設(shè)計(jì)CS31A、K88、K99、F17以及F41等毒力基因引物[6-7]。已提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表2所示。

表2 毒力基因引物序列Tab 2 Primer sequence of virulence genes

1.2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)小鼠分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。試驗(yàn)小鼠在試驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境一周。在試驗(yàn)前24 h禁食、禁水。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3]，將分離菌種進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔注射。每只小鼠注射量為1.5×109CFU/只。對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 按照CLSI相關(guān)指導(dǎo)[8]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離得到的菌株用MH肉湯進(jìn)行培養(yǎng)，用麥?zhǔn)媳葷醿x將細(xì)菌濃度調(diào)整到0.5麥?zhǔn)蠁挝弧⒄{(diào)整好的菌液均勻涂抹于MH瓊脂平板上。將藥敏紙片均勻的放置在涂抹細(xì)菌的平板上，兩紙片之間圓心的距離不少于24 mm，每個(gè)平板放置不超過(guò)5個(gè)紙片。質(zhì)控菌株為ATCC25922。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與形態(tài)觀察 分離出來(lái)的細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)粉紅色菌落。在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的菌落。挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)鏡檢觀察到陰性桿菌，多散在，兩端稍鈍圓(圖1)。

圖1 分離菌株鏡檢(10×100)Fig 1 Morphology of isolates in the microscope(10×100)

2.2 生化鑒定 生化鑒定結(jié)果如表3所示。分離出的細(xì)菌能發(fā)酵乳糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵麥芽糖、甘露醇。吲哚試驗(yàn)、鼠李糖試驗(yàn)為陽(yáng)性，VP、尿素酶以及間肌醇試驗(yàn)為陰性。分離細(xì)菌的生化特性與大腸桿菌生化特性相一致。

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of biochemical test

2.3 PCR鑒定 分離菌株通過(guò)DNA提取試劑盒，提取出DNA模板。提取的DNA模板經(jīng)合成16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳后，在1543 bp處獲得明顯的條帶(圖2)，復(fù)合預(yù)期大小。用膠回收試劑盒進(jìn)行回收測(cè)序后，用NCBI的Blast功能進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與GenBank上已知的大腸桿菌16S rRNA序列同源性為98%～99%。結(jié)合生化試驗(yàn)與序列比對(duì)結(jié)果，確定該株分離菌株為大腸桿菌。

2.4 毒力基因鑒定 以分離出的細(xì)菌的DNA為模板，檢測(cè)該株細(xì)菌是否具有K88、K99、F17、F41以及CS31A毒力基因。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該株細(xì)菌攜帶K99毒力基因，未檢測(cè)到其他毒力基因，如圖3所示，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 腹腔注射菌液的小鼠在注射完的6 h后，出現(xiàn)精神沉郁、顫栗等癥狀；8 h后，小鼠排稀便；24 h，小鼠全部死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠腹水增多，胃擴(kuò)張鼓氣，腸道積液，腸系膜充血，病變情況如圖4所示。無(wú)菌采集病死小鼠的器官接種于麥康凱以及伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上。發(fā)現(xiàn)分別長(zhǎng)出了粉紅色菌落和帶有金屬光澤的菌落。可以認(rèn)為是腹腔注射的大腸桿菌導(dǎo)致了小鼠的死亡。對(duì)照組小鼠注射了生理鹽水，身體狀況良好，無(wú)死亡現(xiàn)象。

圖4 小鼠病變情況Fig 4 Pathological changes in mice

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。將藥敏試驗(yàn)結(jié)果與CLSI相關(guān)文件[10]進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松以及頭孢噻肟敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星以及四環(huán)素耐藥，對(duì)慶大霉素和土霉素素處于中介狀態(tài)。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of drug sensitivity

3 討論與結(jié)論

引起犢牛腹瀉的因素有很多，根據(jù)其發(fā)生的原因不同，大致可以分為消化不良性腹瀉以及傳染性腹瀉。傳染性腹瀉包括細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)性腹瀉[9]。細(xì)菌性犢牛腹瀉的病原菌很多，包括了大腸桿菌、沙門(mén)氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等[10]。通過(guò)大量的試驗(yàn)證明，在細(xì)菌性的腹瀉病中，致病性大腸桿菌引起的腹瀉病居多[11]，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大影響。根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理以及流行病學(xué)特征可以將致病性大腸桿菌分為五類，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)以及腸粘附性大腸桿菌(EAEC)[12]。目前主要應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分型。其中ETEC主要檢測(cè)的毒力基因?yàn)镵88、K99、F17及F41等，EPEC為bfpA基因，EHEC主要檢測(cè)eaeA以及irp2基因[13-15]。通過(guò)檢測(cè)致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因，可以迅速為大腸桿菌進(jìn)行分型，了解其致病機(jī)理以及對(duì)其治療方案提供科學(xué)依據(jù)。張震等研究發(fā)現(xiàn)，在黑龍江部分牛場(chǎng)致病性大腸桿菌毒力因子的調(diào)查與分析中，ETEC菌株的檢出率占比為76.09%[6]。經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證明，ETEC是導(dǎo)致?tīng)倥８篂a最常見(jiàn)的大腸桿菌，其致病性與毒力因子密切相關(guān)，其中就包括了黏附素性菌毛以及腸毒素。ETEC被證實(shí)在進(jìn)入機(jī)體后會(huì)依靠菌毛定殖于小腸黏膜進(jìn)行繁殖，并分泌腸毒素，干擾正常的代謝，引起腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者可造成死亡[16]。菌毛K99最早分離于腹瀉的犢牛和羔羊，是ETEC常見(jiàn)的菌毛之一[17]。本次從病死犢牛的體內(nèi)檢出的致病性大腸桿菌攜帶的毒力基因?yàn)镵99，屬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)。本次試驗(yàn)對(duì)分離出來(lái)的致病性大腸桿菌進(jìn)行了分型，了解該株細(xì)菌的大體致病機(jī)理，為今后的治療提供了一定的理論依據(jù)。

藥敏試驗(yàn)可以為治療某種病原菌造成疾病的臨床用藥提供依據(jù)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離出來(lái)的致病性大腸桿菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松以及頭孢噻肟敏感，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星以及四環(huán)素展現(xiàn)出了耐藥性，這可能與這些抗生素多年來(lái)的使用有關(guān)系。根據(jù)王宏、楊斯琴等對(duì)牛源致病性大腸桿菌耐藥情況的研究[18-19]可以看出，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題逐漸呈現(xiàn)出來(lái)，多重耐藥的情況逐漸加重。研究表明，牛源致病性大腸桿菌對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、多西環(huán)素等抗生素展現(xiàn)出較為強(qiáng)烈的耐藥性，一些菌株多重耐藥性情況嚴(yán)重，少則為4重耐藥，多則達(dá)到17重耐藥[20]，這對(duì)以后具有多重耐藥性細(xì)菌的治療會(huì)帶來(lái)許多阻礙。面對(duì)這種情況，許多專家提出了解決方案，如抗生素的輪流使用、聯(lián)合用藥以及通過(guò)PK/PD模型對(duì)藥物的劑量以及給藥間隔重新進(jìn)行評(píng)定[21]等，其中通過(guò)PK/PD模型對(duì)現(xiàn)有以及正在研發(fā)的抗生素提供具有科學(xué)依據(jù)的給藥劑方案被廣泛使用[22]。PK/PD模型與其他模型以及軟件的聯(lián)用為今后抗生素的合理使用提供了一種新的方向。通過(guò)相應(yīng)的藥敏試驗(yàn)與PK/PD模型的聯(lián)用會(huì)為減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生做出巨大貢獻(xiàn)。

本試驗(yàn)從牛場(chǎng)病死犢牛體內(nèi)中分離出了致病性大腸桿菌，通過(guò)毒力基因檢測(cè)以及藥敏試驗(yàn)確定了該株細(xì)菌的分型以及對(duì)何種抗生素敏感，為治療這株細(xì)菌引起的犢牛腹瀉提供合理的依據(jù)。與以往的細(xì)菌鑒定試驗(yàn)相比，本次試驗(yàn)測(cè)定了相關(guān)的毒力基因，從基因角度證明了該株大腸桿菌的致病性。

M. DL2000 Marker；1. 陽(yáng)性對(duì)照1；2.陽(yáng)性對(duì)照2；3. 分離菌株M. DL2000 Marker；1. Positive control 1；2. Positive control 2；3 Isolated bacteria圖2 細(xì)菌16S rRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 2 Results of bacterial 16S rRNA agarosegel electrophoresis

M. DL2000 Marker; 1. 陽(yáng)性對(duì)照1; 2. 陽(yáng)性對(duì)照2; 3. 分離菌株M. DL2000 Marker; 1. Positive control 1;2.Positive control 2; 3. Isolated bacteria圖3 K99基因 PCR 鑒定結(jié)果Fig 3 Identification of K99 gene by PCR